Name: Vaste fase synthese van een gefunctionaliseerd Bis-Peptide Met behulp van Veiligheid Catch Methodologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Leer de vaste fase synthese van een gefunctionaliseerd bis-peptide met behulp van safety catch methodologie op HMBA-hars. Deze techniek biedt efficiënte zuivering en consistente opbrengsten voor peptide-onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De auteurs willen graag Dr Zachary Z. Brown en Jennifer Alleva bedanken voor de initiële ontwikkeling van deze vaste fase synthese techniek en Matthew FL Parker voor nuttige discussies. Dit werk wordt ondersteund door de Defense Threat Reduction Agency (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) en de Horst Witzel Fellowship Award wordt ondersteund door Cephalon, Inc

1. Setup <ol><li> De reactie opstelling voor de vaste-fase synthese is een polypropyleen filterpatroon of glazen reactor die via polypropeen buis verbonden met een gesloten kolf onder vacuum filter zoals in figuur 1. De reactie kan worden gemengd met een magnetische roerstaaf of door stikstof door de reactor. </li><li> Een gas verdeelstuk is aangesloten op een Argon cilinder met een droogbuis en olie opvangvat wordt aanbevolen omdat hiermee het reactievat te worden opgenomen in een inerte atmosfeer en kan de verwijdering van reagentia uit gesloten containers. </li><li> Alle handelingen worden uitgevoerd in een zuurkast en de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (veiligheidsbril, labjas en nitril handschoenen) is vereist. </li></ol> 2. Laden Eerste Bis-Peptide Onto Resin <ol><li> Weeg 114 mg van HMBA-AM Resin (0,88 mmol / g laden, 100 mol) in 8 ml reactievat en voeg magnetische roerstaaf. Cap boven the vat met een rubber septum en zuivering van de buis met argon tenminste 5 minuten. </li><li> Intussen gewicht 117,3 mg verbinding 1 van figuur 3 (586,63 g / mol, 2eq) en 59,2 mg 1 - (mesityleen-2-sulfonyl)-3-nitro-1 ,2,4-triazool (MSNT, 296,0 g / mol, 2eq) in een 15 ml centrifugebuis wegwerp en oplossen in 2 ml watervrij dichloormethaan (DCM). Voeg 24 ul van 1-methylimidazool (NMI, 80,81 ml / mol, 3EQ) een oplossing, en roer tot volledig opgelost. </li><li> Breng de geactiveerde oplossing van het reactievat via een injectiespuit en laat roeren onder argon nacht (~ 10 uur). </li><li> Verwijder het septum en laat het reactiemengsel. Was de hars met DCM (5x) en dimethylformamide (DMF) (5x). Voer de &quot;methylrood test&quot; beschreven in paragraaf 10.1 tot en met de mate van hars belasting te beoordelen. Als de hars op rood blijft staan ​​tijdens de methylrood-test vervolgens de stappen 2.2 en 2.3 moet worden herhaald. Een gele kleur, hetgeen wijst op een negatieve methylrood test de voorkeur;kan echter omdat de resterende hydroxylgroepen wordt begrensd in de volgende stap wordt een licht positief resultaat (lichtoranje kleur hars) aanvaardbaar. </li></ol> 3. Verwijdering van de bescherming van de Eerste Bis-peptide en Gelijktijdige Resin Plafonnering <ol><li> Voeg 1 ml DCM het reactievat dan 1 ml 33% waterstofbromide in azijnzuur druppelsgewijs gedurende 30 seconden (borrelen plaatsvindt) en laat roer 15 minuten. Giet ze af en was de hars met DCM (5x) en herhaal nog een keer te verwerken. </li><li> Was de hars met DCM (5x) dan DMF (5x). Neutraliseren hars door tweemaal wassen met 5% v / v oplossing van N, N-diisopropylethylamine (DIPEA) in DMF daarna wassen met DCM (5x) en DMF (5x) weer. Voer de &quot;methylrood test&quot; en &quot;chloranil test&quot; besproken in paragraaf 10.1 en 10.2. Resultaten moeten negatief zijn voor de methylrood-test en positief voor de chloranil test. </li></ol> 4. Koppeling Boc / tBu-Beschermd Gefunctionaliseerde Bis-Amino zuur <ol><li> Opnieuw een inerte atmosfeer aan de hars-bevattende reactievat door driemaal wassen met watervrij DCM sluit vervolgens een septum en argon lijn. Spoel en was het schip door het toevoegen van 1-2 ml watervrij DCM en te laten roer gedurende 30 seconden en het aftappen van het schip tot aan de argon lijn bubbler begint te stijgen. Doe dit minstens een keer meer. </li><li> Een oplossing van 0,15 M gefunctionaliseerde bis-aminozuur (3EQ) en 245 mg 1-hydroxy-7-azabenzotriazole (HOAT, 136,11 g / mol, 18eq) in 2 ml 2:1 DCM: DMF in een vlam gedroogd proef buis onder argon atmosfeer. Voeg 47 ul van diisopropylcarbodiimide (DIC, 156,6 ml / mol, 3EQ) en schud gedurende 90 minuten. </li><li> Voeg 35 ul DIPEA (174,19 ml / mol, 2eq) in 666 ul watervrije DMF de hars en laat roeren gedurende 5 minuten. </li><li> Breng de vooraf geactiveerde bis-aminozuur oplossing reactievat via een injectiespuit en laat een nacht roeren. </li><li> Giet het reactiemengsel en tweemaal spoelen met watervrij DCM terwijl onder<html> argon. </li><li> Om de afsluiting van de diketopiperazine bevorderen toevoegen 0,25 M oplossing van HOAT (136,11 g / mol, 10eq) en DIC (156,6 ml / mol, 10eq) in 4 mL van 1:1 DCM: DMF en laat roeren onder argon gedurende 1 uur. </li><li> Verwijder het septum en laat het reactiemengsel. Was de hars met DCM (5x) en DMF (5x). Indien gewenst, voert u de &quot;chloranil test&quot; besproken in paragraaf 10.2. </li></ol> 5. Verwijdering van de bescherming van Boc / tBu-Beschermd Gefunctionaliseerde Bis-Amino Acid <ol><li> Voeg 2 ml van een oplossing van 95:5 trifluororacetic zuur (TFA) triisopropylsilaan (TIPS) aan het reactievat en laat roeren gedurende 1 uur. Giet ze af en was de hars voor ongeveer 30 seconden met DCM (5x) en herhaal proces nog een keer. </li><li> Was de hars met DCM (5x) dan DMF (5x). Neutraliseren hars door tweemaal wassen met 5% v / v oplossing in DMF DIPEA daarna wassen DCM (5x) en DMF (5x) weer. Indien gewenst, voert u de &quot;chloranil test&quot; besproken in paragraaf 10.2. </li></ol>le &quot;&gt; 6. Herhaal stap 4 en 5 naar wens te synthetiseren gerichte bis-peptide. 7. Functionaliseren de Bis-Peptide Prolidine End <ol><li> De prolidine einde van de groeiende bis-peptide kunnen onafhankelijk van elkaar kunnen worden geacyleerd door een diketopiperazine. Ook kan daartoe worden gelaten beschermd, dat deze worden gesplitst, bieden het vrije aminozuur. Indien gewenst, voert u de &quot;chloranil test&quot; besproken in de paragrafen 10.2 en koppeling efficiëntie te beoordelen. </li></ol> 8. Verwijdering van de bescherming van Fmoc en acylering van het Kwartair Einde van de Bis-Peptide <ol><li> Een 2 ml oplossing van 20% piperidine in DMF toegevoegd en de reactie gedurende 20 minuten gemengd. Giet ze af en was de hars met DMF (5x) en herhaal proces nog een keer. </li><li> Was de hars met DCM (5x) dan DMF (5x). </li><li> Bereid een 0,15 M oplossing van aminozuur (3EQ) in 2 ml N-methylpyrrolidon (NMP) bij 114 mg 2 - (7-aza-1H-benzotriazool-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorfosfaat<html> (HATU, 380,2 g / mol, 3EQ) en 104,5 ul DIPEA (174,19 ml / mol, 6eq) en goed mengen. Toevoegen reactievat en laat roeren gedurende 6 uur. </li><li> Was de hars met DCM (5x) dan DMF (5x). </li></ol> 9. Verwijder de BOC Group van de hars Bound Amino Acid en Cleave van Resin <ol><li> Voeg 2 ml van een 1:1 TFA: DCM oplossing van het reactievat mogelijk roeren gedurende 30 minuten. Giet ze af en was de hars met DCM (5x) en herhaal nog een keer te verwerken. </li><li> Was en laat de hars gedurende 30 seconden met DCM (5x) en vervolgens DMF (5x). </li><li> Voeg 2 ml van een oplossing van 10% DIPEA in watervrije DMF en laat 24-48 uur roeren. </li><li> Verzamelen reactiemengsel in voorgewogen rondbodemkolf. Overdracht 30 pi van deze oplossing tot 450 ul van THF in een LC-MS flacon dienen voor analyse. Was de hars met extra porties van DMF en verzamelen in de rondbodemkolf dan oplosmiddel te verwijderen in vacuüm. </li></ol>dflinebreak &quot;&gt; 10. Zuivering van Bis-Peptide <ol><li> Los ruwe bis-peptide in een minimale hoeveelheid dimethyl sulfoxide (100-250 pi) en overdracht HPLC flacon inzetstuk. Plaats het inzetstuk in het autosampler van semi-prepitive HPLC-systeem (Hewlett Packard 1100 serie) uitgerust met een XTerra Prep MS C18 5 micrometer 7.8x150 mm kolom en een 100 ul injectie lus. </li><li> Voer meerdere injecties 50 ul van het monster met een gradiënt programma van 5-95% acetonitril in water met 0,1% mierezuur 30 minuten terwijl de controle bij 274 nm. Verzamel het product piek in een vooraf gewogen wegwerp centrifugebuis en vries droog met een vriesdroger. Voorzichtigheid moet worden genomen met de eerste run als een lichte verschuiving van de piek-retentietijd in vergelijking met analytische LCMS wordt meestal waargenomen. </li></ol> 11. Assessment Methods <ol><li> METHYLROOD TEST 7: Verwijder ~ 1 mg droge hars via disposable pipet en spoel ze in 4 ml reactievat. Voeg een oplossing van 20 mg methyl rood, 50 ul N, N&#39;-diisopropylcarbodiimide (DIC) en 5 mg 4-dimethylaminopyridine (DMAP) in 500 pi watervrij DCM en laat roeren gedurende 5-10 minuten. Giet af en was hars met DCM totdat het filtraat kleurloos is. Positieve indicatie is de hars kralen resterende oranje of rood. </li><li> Chloranil TEST 12: Transfer ~ 1 mg droge hars in een kleine flacon via disposable pipet. 3 druppels van zowel 0,8 mM chloranil in DMF oplossing en 2% aceetaldehyde in DMF oplossing laten staan ​​bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten. Positieve indicatie is de hars kralen draaien blauw / paars. </li><li> ACTIVERING TRAP TEST: Actieve verbindingen tijdens de synthese kan worden beoordeeld door de overdracht van een kleine hoeveelheid (5-10 pi) van de geactiveerde oplossing voor een vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) flacon met 50 ul van pyrrolidine. Meng met de hand voor een paar seconden (solutiop zou moeten worden geel) verdun vervolgens met 450 ul van tetrahydrofuran (THF) en in te dienen voor LC-MS-analyse. </li><li> ANALYTISCH LC-MS: Het uiteindelijke product en geactiveerde tussenproducten kunnen worden beoordeeld met behulp van een HP 1200 serie LC-MS-systeem uitgerust met een Waters Xterra MS C18 3,5 micrometer 4,6 mm x 150 mm kolom en een gradiënt systeem van 5-95% acetonitril in water met 0,1% mierenzuur gedurende 30 minuten. </li></ol> 12. Representatieve resultaten Een voorbeeld van zowel ruwe (figuur 4) en gezuiverd (figuur 5) LCMS sporen zijn aangebracht. Gezuiverd opbrengst van ongeveer 10% verwacht volgens de methoden zoals hierboven beschreven. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> Figuur 1. Schema van experimentele set-up voor vaste-fase synthese. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> Figuur 2.Relevante nomenclatuur van de Bis-aminozuren / Bis-peptiden. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> Figuur 3. Algemene synthetische Scheme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 4a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> Figuur 4a. HPLC-Trace van het ruwe product op 274 nm. <img alt="Figuur 4b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> Figuur 4b. MS spectrum van ruwe product Peak. <img alt="Figuur 5a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> Figuur 5a. HPLC-Trace van de gezuiverde product op 274 nm. <img alt="Figuur 5b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> Figuur 5b. MS Spectrum van gezuiverd Product Peak.

<ol><li>Atherton, E., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtherton%2C+E+%22Solid+Phase+Peptide+Synthesis%3A+A+Practical+Approach%22">Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (1989).</li>
<li>Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-Phase+Synthesis+of+Functionalized+Bis-Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Solid-Phase Synthesis of Functionalized Bis-Peptides.</a> Biopolymers. 96, 578-585 (2010).</li>
<li>Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape-Programmable+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Shape-Programmable Macromolecules.</a> Acc. Chem. Res. 41, 1387-1398 (2008).</li>
<li>Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Hexa-+and+Pentasubstituted+Diketopiperazines+from+Sterically+Hindered+Amino+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Let%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids.</a> Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).</li>
<li>Nielson, J., Lyngso, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Solid-Phase+Synthesis+of+Balanol+Analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Tet.+Lett%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues.</a> Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).</li>
<li>Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Method+for+Anchoring+Fmoc-Amino+Acids+to+Hydroxyl-Functionalized+Solid+Supports%5BTitle%5D)+AND+%22Tet.+Lett%22%5BJournal%5D)">An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports.</a> Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).</li>
<li>Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Colorimetric+Test+for+Detection+of+Hydroxyl+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tet.+Lett%22%5BJournal%5D)">A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis.</a> Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).</li>
<li>Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Functional+Groups+into+Peptides+via+N-Alkylation%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation.</a> Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).</li>
<li>Plas, S. E. V. ander, Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+New+SPE+Material+for+EDCs%3A+Fully+Automated+Synthesis+of+a+Library+of+Tripodal+Receptors+Followed+by+Fast+Screening+by+Affinity+LC%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC.</a> Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).</li>
<li>Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+Test+for+Detection+of+Free+Terminal+Amino+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis+of+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides.</a> Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).</li>
<li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChan%2C+WC+%22Fmoc+Solid+Phase+Peptide+Synthesis%3A+A+Practical+Approach%22">Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2000).</li>
<li>Vojkovsky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Secondary+Amines+on+Solid-Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Peptide+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of Secondary Amines on Solid-Phase.</a> Peptide Research. 71, 236-237 (1995).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De synthetische benadering die hierin in een werkwijze voor de synthese van gefunctionaliseerde bis-peptiden van bis-aminozuur bouwstenen gebruikelijke vaste-fase peptide synthese technieken. Het monomeer synthese van deze &quot;Pro4&quot; bouwstenen van trans-4-hydroxyproline 3 is zeer schaalbaar en is met succes afgerond aan de hydantoïne stadium bij een 600 mmol (234 g) schaal (niet gepubliceerd). Zodra de monomeren in de hand, het gebruik van vaste-fase techniek geeft een snellere methode bis-peptidesynthese dan de huidige oplossing fase methode 4 door overbodig reactie werk-ups en tussenliggende reinigingen. De primaire uitdaging vaste-fase synthese diagnose synthetische vooruitgang en oplossen aangezien geen tussenproducten worden geïsoleerd. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van vele colorimetrische testen waaronder die dat aangeeft of gratis amines (Kaiser Test 10) of gratis hydroxYLS (Methyl Red Test 7) worden blootgesteld op de hars. Helaas is de gebruikte Kaiser Test 10 niet algemeen toepasbaar in vaste-fase synthese door de vrijwel uitsluitend gebruik van secundaire aminen of aminen aan een quaternair koolstof. Andere opties voor beoordeling op HMBA hars onder andere breuklijnen-test met behulp van een nucleofiel, zoals hydrazine 11, kwantitatieve Fmoc decollete gecontroleerd door UV / Vis 1,11, en ​​vangen en analyseren van binnenkomende geactiveerd verbindingen. Een ander over het hoofd gezien probleem in vaste-fase synthese is het repetitieve karakter van synthetische stappen die nodig zijn door de operator. Met dit in het achterhoofd, de auteurs raden het gebruik van een spreadsheet of een checklist bij het uitvoeren van handmatige vaste-fase peptide synthese. De moeilijkheid met in bis-peptiden voor vaste-fase synthese opzichte gemeenschappelijke α-aminozuren bevat de mogelijke moeilijker koppelingen door sterische hindrance, de behoefte aan on-hars diketopiperazine sluitingen, en gelijktijdige deprotections (Boc / tBu; Cbz / tBu). Een andere moeilijkheid ligt in het bereiken van kwantitatieve vrijlating uit de hars met behulp van deze &quot;veiligheidspal&quot; methode in vergelijking met meer conventionele middelen. Met deze factoren in het achterhoofd, is het heel goed mogelijk dat een verdere optimalisatie van deze methode kan worden bereikt en de huidige inspanningen zijn aan de gang in onze groep om de methode hier gepresenteerde verbeteren.

<table border="1"><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> HMBA-Am Resin </td><td> Novabiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> Novabiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 336092 </td><td> Giftig, bijtend </td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> Kankerverwekkende </td></tr><tr><td> Watervrij DCM </td><td> Acros </td><td> 34846 </td><td> Kankerverwekkende </td></tr><tr><td> 33% waterstofbromide in azijnzuur </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 248630 </td><td> Toxic, Corrosive, rook wanneer het open is </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 387649 </td><td> Brandbaar, giftig, bijtend </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC27960 </td><td> Brandbare, Toxic </td></tr><tr><td> Watervrije DMF </td><td> Acros </td><td> 34843 </td><td> Brandbare, Toxic </td></tr><tr><td> HOAT </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> Brandbaar, giftig, bijtend </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> Giftig, bijtend </td></tr><tr><td> TIPS </td><td> Acros </td><td> 21492 </td><td> Brandbare, Toxic </td></tr><tr><td> Piperidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 104094 </td><td> Brandbaar, giftig, bijtend </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><td&gt; Toxic </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36438 </td><td> Giftig </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> Novabiochem </td><td> 851055 </td><td> Giftig </td></tr><tr><td> Methyl Red </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td><td> Brandbaar, giftig, Peroxide Vormen </td></tr><tr><td> Pyrrolidine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P73803 </td><td> Brandbaar, giftig, bijtend </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> Visser </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> SPPS reactievaten </td><td> Grace </td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> Agilent </td><td> 1200 serie </td><td></td></tr><tr><td> Semi-Prep LC </td><td> Hewlett Packard </td><td> 1100 Series </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Vriesdroger </td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotovapor </td><td> Buchi </td><td> R-210 Series </td><td></td></tr><tr><td> Argon </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

vaste fase synthese van een gefunctionaliseerd bis-peptide met behulp van &quot;veiligheid catch&quot; methodologie

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

In 1962, RB Merrifield gepubliceerd eerste procedure met vaste-fase peptide synthese als nieuwe route efficiënt synthetiseren peptiden. Deze techniek bleek al snel voordelig ten opzichte van zijn oplossing-fase voorganger, zowel in tijd en arbeid. Verbeteringen met betrekking tot de aard van de vaste drager, de beschermende groepen gebruikt en de koppeling methoden die in de afgelopen vijf decennia alleen maar toegenomen het nut van de oorspronkelijke systeem Merrifield&#39;s. Vandaag de dag gebruik van een Boc-gebaseerde beveiligings-en basis / nucleofiel splitsbare hars strategie of Fmoc-gebaseerde beveiliging en zure splitsbare hars strategie, ontwikkeld door RC Sheppard, worden het meest gebruikt voor de synthese van peptiden 1. Ingegeven door vaste gedragen strategie Merrifield, hebben wij een Boc / tert-butyl vaste-fase synthese strategie voor de montage van gefunctionaliseerde bis-peptiden 2, die hierin wordt beschreven. Het gebruik van vaste-fase synthese opzichte to oplossing fase methode is niet alleen gunstig in tijd en arbeid als beschreven door Merrifield een, maar kan ook gemakkelijker in de synthese van bis-peptide libraries. De synthese die we tonen hier is uitgerust met een decollete laatste stadium dat gebruik maakt van een twee-stap &quot;veiligheidspal&quot; mechanisme om de gefunctionaliseerde bis-peptide vrij te maken uit de hars door diketopiperazine formatie. Bis-peptiden stijve spiro-ladder oligomeren van bis-aminozuren die in staat functionaliteit positioneren in een voorspelbare en ontwerpbaar wijze bestuurd door het type en stereochemie van de monomere eenheden en de verbinding tussen elk monomeer. Elke bis-aminozuur is een stereochemisch zuiver cyclische steiger die twee aminozuren (een carbonzuur met een α-amine) 3,4 bevat. Ons laboratorium onderzoekt momenteel de mogelijkheden van functionele bis-peptiden in een breed scala van gebieden zoals katalyse, eiwit-eiwit interacties en nanomaterials.

De efficiënte solid-phase peptide synthese van een gefunctionaliseerde bis-peptide trimeer gebruik te maken van een &quot;veiligheidspal&quot; decollete procedure vanaf HMBA hars wordt beschreven.

Vaste fase synthese van een gefunctionaliseerd Bis-Peptide Met behulp van &quot;Veiligheid Catch&quot; Methodologie

In 1962 publiceerde R.B. Merrifield de eerste procedure waarin gebruik werd gemaakt van peptide-synthese op vaste fase als een nieuwe methode om efficiënt peptiden te synthetiseren. Deze ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om een gefunctionaliseerd BSP-peptide te synthetiseren met behulp van vastfase-technieken. Dit wordt bereikt door een beschermd BIS-aminozuur te laden op hydroxyethylbenzoëzuurhars. Vervolgens worden cycli van diepe beschermingskoppeling herhaald om gefunctionaliseerde bis-aminozuren te koppelen, een proces waardoor het BIS-peptide wordt verlengd en de gewenste functionaliteit wordt vertoond.Ten slotte wordt het eerste bis-aminozuur gemodificeerd met een alfa-aminozuur om het BIS-peptide van de hars te splitsen door vorming van DI Keto-pyrazine. De resultaten tonen een succesvolle synthese van een gefunctionaliseerd BSP-peptide aan met een goede ruwe zuiverheid en consistente geïsoleerde opbrengsten van ongeveer 10% op basis van vloeistofchromatografie-massaspectrometrieanalyse. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot parallelle synthese en bibliotheeksynthese van bis-peptiden, aangezien de BIS-peptiden op een vaste hars worden geassembleerd, wat gemakkelijker te manipuleren is dan reacties in oplossing en waarbij bijproducten eenvoudig via filtratie kunnen worden verwijderd.Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien veel van de stappen moeilijk aan te leren zijn vanwege de vele belangrijke details die nodig zijn om ervoor te zorgen dat alle reacties zo volledig mogelijk verlopen. Bij vastefasesynthese is er geen mogelijkheid om tussenproducten te zuiveren. Om daarom een zuiver eindproduct te verkrijgen, moet elke reactie tot het maximale worden gedreven.We raden aan om een checklist van de experimentele procedures op te stellen om verwarring te voorkomen, aangezien de stappen repetitief van aard zijn. Dit protocol begint met het laden van het eerste BSP-peptide, de bescherming van het eerste BSP-peptide en het gelijktijdige cappen van de hars. Begin met het laden van het eerste BSP-peptide door 114 milligram H-M-B-A-A-hars af te wegen in een reactievat van acht milliliter en voeg een magnetische roerstaaf toe.Sluit de bovenkant van het vat af met het rubberen septum en spoel de buis gedurende ten minste vijf minuten door met Argonne. Bereid ondertussen de geactiveerde BIS-aminozuuroplossing voor zoals beschreven in het geschreven protocol. Ter aanvulling op deze video: breng de oplossing met een spuit over naar het reactievat en roer dit de volgende dag gedurende de nacht onder Argonne; verwijder vervolgens het septum en laat het reactiemengsel uitlopen.Was de hars door ongeveer twee milliliter chloormethaan aan de hars toe te voegen. Roer gedurende 30 seconden tot een minuut en laat het vervolgens aflopen. Herhaal dit proces vier keer met DCM en was de hars daarna vijf keer met dimethylformamide.Om de eerste bis-aminozuurgroep diep te beschermen en gelijktijdig de hars af te cappen, voegt u langzaam twee milliliter van een oplossing van 33% waterstofbromide in azijnzuur en DCM toe aan het reactievat. Laat dit 15 minuten roeren, waarna de hars wordt afgetapt en vijf keer wordt gewassen in DCM. Herhaal de D-beschermingsvolgorde nogmaals.Was vervolgens de hars vijf keer met DCM, gevolgd door vijf keer met DMF, en neutraliseer de hars door deze twee keer te wassen met een 5% volume/volume oplossing van D-I-P-E-A in DMF. Was daarna nogmaals vijf keer met DCM en vijf keer met DMF. Nu kan de koppeling van het beschermde gefunctionaliseerde bis-aminozuur worden uitgevoerd.Herstel eerst een inerte atmosfeer in het reactievat dat de hars bevat door dit drie keer te spoelen met watervrij DCM. Plaats vervolgens een septum en een argonlijn voor het purgen en spoel het vat door één tot twee milliliter watervrij DCM toe te voegen en 30 seconden te roeren. Laat het vat daarna draineren totdat de borrelsteen van de argonlijn begint te stijgen.Herhaal dit proces nog ten minste één keer. Bereid vervolgens een oplossing van gefunctionaliseerd bis-aminozuur in een vlamgedroogde reageerbuis onder een argonatmosfeer. Voeg 47 µL DIC toe en roer gedurende 90 minuten.Voeg vervolgens 35 µL D-I-P-E-A in 666 µL watervrije DMF toe aan de hars en roer nog eens vijf minuten. Breng de vooraf geactiveerde BIS-aminozuuroplossing met een injectiespuit over naar het vat en roer dit de volgende dag een nacht lang. Giet het reactiemengsel af en was dit tweemaal met watervrije DCM onder argon.Een kritische stap in deze procedure zijn de bis-aminozuurkoppelingen. Om de ringsluiting van di-ketopiperazines te waarborgen, maken we gebruik van langere reactietijden met aanvullende activeringsmiddelen. Voeg om de sluiting van de di-ketopyrazine te bevorderen een HOAT- en DIC-oplossing toe en roer gedurende één uur onder argon.Verwijder vervolgens het septum en laat het reactiemengsel weglopen. Was de hars vijf keer met DCM en vijf keer met DMF. Deze sectie behandelt de volledige bescherming van het gefunctionaliseerde BIS-aminozuur, de volledige bescherming van Fmoc en de acylering van het eerste BIS-aminozuur.Om de diepe protectie van het geprotectioneerde gefunctionaliseerde bis-aminozuur uit te voeren, voegt u langzaam twee milliliter van een oplossing van TFA en TIPS toe aan het reactievat en roert u gedurende één uur. Na het aftappen wast u de hars gedurende ongeveer 30 seconden met DCM en tapt u deze vervolgens af; herhaal deze DCM-wasstap vijf keer. Herhaal daarna de volledige wasreeks voor de diepe protectie van de hars volgens de A-D-C-M-D-M-F-wasvolgorde. Neutraliseer de hars door deze twee keer te wassen met een 5% volume/volume oplossing van D-I-P-E-A in DMF.Voer vervolgens nogmaals een D-C-M-D-M-F wasbeurt uit. Vanaf dit punt kan het BIS-peptide worden verlengd met andere gefunctionaliseerde bis-aminozuren, worden gefunctionaliseerd op het leidende stikstofcarbonzuur, of beide. Om de FM-groep te deblokkeren, voegt u een oplossing van 2 ml 20% piperidine in DMF toe en mengt u de reactie gedurende 20 minuten.Laat de hars uitlekken en was deze vijf keer met DMF. Herhaal dit proces nogmaals na een extra wasbeurt van de hars. Isoleer als laatste stap het eerste bis-aminozuur door de bereide aminozuuroplossing aan het reactievat toe te voegen en zes uur lang te roeren.Was de hars vijf keer met DCM en vijf keer met DMF. Het laatste deel van dit protocol omvat het verwijderen van de Bach-groep van het aan de hars gebonden aminozuur en de splitsing van de hars. Voeg eerst twee milliliter van een één-op-één T-F-A-D-C-M-oplossing toe aan het reactievat en roer 30 minuten.Laat de harsen aflopen en was deze vijf keer met DCM. Herhaal dit proces vervolgens nogmaals. Was en laat de harsen 30 seconden aflopen, vijf keer met DCM en vijf keer met DMF.Voeg vervolgens twee milliliters van een oplossing van 10% D-I-P-E-A in anhydere DMF toe en roer 24 tot 48 uur. Verzamel tenslotte het reactiemengsel in een vooraf gewogen rondbodemkolf. Overbreng 30 µL van deze oplossing naar 450 µL Tetra Hydro FU in een lc MS-vial en dien deze in voor analyse.Was de hars met extra aliquoten DMF en verzamel deze in de rondbodemkolf. De volgende methoden kunnen worden gebruikt om chemische transformaties op de hars gedurende de synthese te monitoren. Om vrije hydroxylgroepen te detecteren, wordt de methylroodtest uitgevoerd door eerst ongeveer één milligram droge hars met een wegwerppipet te verwijderen.Spoel het mengsel in een reactievat van vier milliliter. Voeg een methylroodoplossing toe, bereid zoals beschreven in de tekst, en roer gedurende vijf tot 10 minuten. Giet af en was de hars vijf keer met DCM; oranje of rode harskralen duiden op de aanwezigheid van vrije hydroxylgroepen.Deze test kan worden gebruikt om de belading van het eerste bis-aminozuur en de resin-cappingstappen te beoordelen. Om secundaire groepen te detecteren, wordt de chloraaltest uitgevoerd door ongeveer één milligram droge resin via een wegwerppipet over te brengen naar een klein vial. Voeg drie druppels toe van zowel een 0,8 millimolaire chloraaloplossing in DMF als een 2% zuur-aldehydeoplossing in DMF.Laat dit vervolgens vijf tot 10 minuten bij kamertemperatuur staan. In dit geval zijn blauwe of paarse harsbolletjes een indicatie dat er vrije secundaire aminen aanwezig zijn op het aan de hars gebonden complex. Om de activeringsefficiëntie te bevestigen, wordt de activeringstrap-test uitgevoerd; het geactiveerde complex tijdens de synthese kan worden beoordeeld door 5 tot 10 µL van de geactiveerde oplossing over te brengen naar een vloeistofchromatografie-massaspectrometrie-vial met 50 µL olaine en dit handmatig te mengen.Gedurende enkele seconden moet de oplossing geel worden, waarna deze wordt verdund met 450 µL tetra hydro uran en wordt ingediend voor lc-ms-analyse. Het eindproduct en geactiveerde tussenproducten kunnen worden beoordeeld met een LC-MS-systeem uitgerust met een C18 reverse-phase kolom en een oplosmiddelsysteem van water/acetonitril met 0,1% mierenzuur. Dit LC-MS-UV-chromatogram geeft een voorbeeld van de goede zuiverheid van het ruwe product.De belangrijkste piek in het spectrum bij 21,3 minuten vertoont een massa die consistent is met de verwachte productmassa. Dit kan worden gevisualiseerd in het massaspectrum van het ruwe product, waarbij de piek belangrijke pieken onthult die overeenkomen met de massa, plus de massa van het natriumion, evenals de massa minus de massa van de IV DDE-beschermingsgroep. Hier wordt de LCMS UV-trace van de gezuiverde spectra getoond, die een zeer zuiver product onthult bij 21,3 minuten, en het massaspectrum dat de identiteit van deze gezuiverde piek bevestigt.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe vaste-fase-technieken kunnen worden gebruikt om gefunctionaliseerde bis-peptiden te synthetiseren na de ontwikkeling ervan. Zodra deze techniek beheerst is, heeft deze de weg vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van bis-peptiden om toepassingen in proteïne-proteïne-interacties en katalyse te verkennen. Deze techniek kan, indien correct uitgevoerd, leiden tot de synthese van een gefunctionaliseerde bis-peptide trimeer in vier tot vijf dagen.Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de beads gedurende de reactie- en wasstappen in de betreffende oplossingen ondergedompeld moeten blijven. Andere methoden, zoals parallelle synthese of library-synthese, kunnen worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het effect van stereochemie of alternatieve functionaliteiten op de eiwitbinding of katalytische activiteit. Houd er rekening mee dat het werken met organische reagentia extreem gevaarlijk kan zijn; neem daarom altijd voorzorgsmaatregelen, zoals het gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en een zuurkast, bij het uitvoeren van deze procedure.

solid-phase-synthesis-functionalized-bis-peptide-using-safety-catch

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een eenvoudige en algemene handleiding peptoïde synthese methode waarbij basisuitrusting en de handel verkrijgbare reagentia wordt geschetst, zodat peptoids gemakkelijk worden gesynthetiseerd in de meeste laboratoria. De synthese, zuivering en karakterisatie van een amfifiele peptoïde 36mer wordt beschreven, evenals de zelf-assemblage in zeer geordende nanosheets.

Vaste-fase-Submonomer Synthese van peptoïde polymeren en hun zelf-assemblage in zeer geordende nanosheets

Een eenvoudige en algemene methode voor de synthese van cyclische peptiden met behulp van microgolfbestraling wordt geschetst. Deze procedure maakt de synthese mogelijk van cyclische peptiden met een ruggengraat met verschillende conformatieën, terwijl de zijketens en de farmacofore groepen behouden blijven en daarom, maakt het mogelijk om te screenen op de bioactieve conformatie.

Ontwikkeling van een Backbone cyclisch peptide bibliotheek als potentieel antiparasitaire Therapeutics behulp van microgolfstraling

Een protocol voor het synthetiseren van peptoïden met gemengde kationische functionaliteit in dezelfde sequentie wordt gepresenteerd (lysine- en arginine-achtige monomeren). Het daaropvolgende testen van deze verbindingen tegen Leishmania mexicana, de protozoa-parasieten die cutane leishmaniasis veroorzaken, wordt ook beschreven.

Een efficiënte methode voor de synthese van peptoïden met Gemengde lysine-type / Arginine-type monomeren en evaluatie van hun anti-leishmania Activity

De synthese van peptide polyamine gebaseerde amfifielen (PPA) is een grote uitdaging wegens de aanwezigheid van meerdere amine stikstofatomen, waarvoor oordeelkundig gebruik om groepen te maskeren deze reactieve functionaliteiten te beschermen. In deze paper beschrijven we een facile methode voor de bereiding van deze nieuwe klasse van zelfassemblerende moleculen.

Facile Protocol voor de synthese van het zelf monteren van Peptide Polyamine gebaseerde amfifielen (PPA) en verwante biomaterialen

Een protocol voor de synthese van een 1,2-dithiolane gemodificeerde peptide en de karakterisatie van de supramoleculaire structuren die voortvloeien uit de peptide zelf-assemblage.

Synthese en karakterisering van 1,2-Dithiolane gemodificeerde zelfassemblerende Peptides

Een protocol wordt gepresenteerd voor de synthese van informatie-gecodeerde peptoid oligomeren en voor de sequentie-gerichte zelfassemblage van deze peptoids in moleculaire ladders met behulp van amines en aldehyden als dynamische covalente reactant paren en Lewis zure zeldzame aarde metalen triflates als multi-role reagentia.

Synthese van informatiedragende Peptoids en hun reeks-geleide Dynamische Covalent Zelfassemblage

Dit protocol presenteert de synthese van cyclische peptiden via bisalkylering tussen cysteïne en methionine en de gemakkelijke thiol-yne-reactie veroorzaakt door het propargylsulfoniumcentrum.

Cyclische peptiden construeren met behulp van een on-tether sulfoniumcentrum

Dit protocol beschrijft de synthese van cyclische celdoordringende peptiden met aromatische dwarsverbanden en de evaluatie van hun permeabiliteit over biologische barrières heen.

Constructie van cyclische celdoordringende peptiden voor verbeterde penetratie van biologische barrières

Er wordt een eenvoudig, goedkoop en nieuw apparaat gepresenteerd voor het uitvoeren van peptidesyntheses in vaste fase in een commerciële microgolfreactor.

Een goedkope aanpassing van een commerciële microgolfreactor voor de synthese van peptiden in de vaste fase

De Ugi reactie is gebleken dat een handige manier om snel diverse bibliotheken van verbindingen. Het gaat om de reactie van een amine, een aldehyde, een carbonzuur en een isonitril doorgaans in methanol bij kamertemperatuur. In deze video maken we gebruik van een 48-slot Mettler-Toledo MiniBlock uitgerust met filtratie buizen en een Mettler-Toledo MiniMapper geautomatiseerde vloeibare handler werd gebruikt om de reagentia en oplosmiddelen te leveren. De parameters die van belang waren de...

Optimalisatie van de Ugi reactie met behulp van parallelle synthese en geautomatiseerde Liquid Handling

Leer de vaste fase synthese van een gefunctionaliseerd bis-peptide met behulp van safety catch methodologie op HMBA-hars. Deze techniek biedt efficiënte zuivering en consistente opbrengsten voor peptide-onderzoek.

Vaste fase synthese van een gefunctionaliseerd Bis-Peptide Met behulp van "Veiligheid Catch" Methodologie

Meer video's verkennen