Vaste fase synthese van een gefunctionaliseerd Bis-Peptide Met behulp van "Veiligheid Catch" Methodologie
May 15th, 2012
De efficiënte solid-phase peptide synthese van een gefunctionaliseerde bis-peptide trimeer gebruik te maken van een "veiligheidspal" decollete procedure vanaf HMBA hars wordt beschreven.
Het algemene doel van het volgende experiment is om een functioneel BSP-peptide te synthetiseren met behulp van vaste-fasetechnieken. Dit wordt bereikt door een beschermde BIS-aminozuur op hydroxyethylbenzoëzuurhars te laden. Vervolgens worden cycli van diepe beschermingskoppeling herhaald om functionele bis-aminozuren te bevestigen, een proces dat het BIS-peptide verlengt en de gewenste functionaliteit toont.
Ten slotte wordt het eerste bis-aminozuur gemodificeerd met een alfa-aminozuur om het BIS-peptide van de hars te scheiden door DI Keto pyrazine-vorming. Er worden resultaten verkregen die de succesvolle synthese van een functioneel BSP-peptide in goede ruwe zuiverheid en consistente geïsoleerde opbrengsten van ongeveer 10% laten zien op basis van vloeistofchromatografie massaspectrometrie-analyse. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar parallelle en bibliotheeksynthese van bis-peptiden omdat de BIS-peptiden worden geassembleerd op een vaste hars, die gemakkelijker te manipuleren is dan reacties in oplossing en bijproducten worden gemakkelijk verwijderd door filtratie.
Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang omdat veel van de stappen moeilijk te leren zijn omdat er veel belangrijke details nodig zijn om ervoor te zorgen dat alle reacties zo dicht mogelijk bij de voltooiing komen. Bij vastefasesynthese is er geen manier om tussenproducten te zuiveren. Dus om een schoon eindproduct te verkrijgen, moet elke reactie zo ver mogelijk worden gedreven.
We raden aan een checklist van experimentele procedures te maken om verwarring te voorkomen, aangezien de stappen van repetitieve aard zijn. Dit protocol begint met het laden van het eerste BSP-peptide, de bescherming van het eerste BSP-peptide en gelijktijdige hars-capping. Om te beginnen laadt u het eerste BSP-peptide door 114 milligram H-M-B-A-A hars in een acht milliliter reactievat te wegen en een magnetische roerstaaf toe te voegen.
Bedek de bovenkant van het vat met het rubberen septum en zuiver de buis met Argonne gedurende ten minste vijf minuten. Bereid ondertussen de geactiveerde BIS-aminozuuroplossing voor zoals beschreven in het geschreven protocol. Breng de oplossing over naar het reactievat via een spuit en roer de volgende dag 's nachts onder Argonne, verwijder het septum en laat het reactiemengsel weglopen.
Was de hars door ongeveer twee milliliter chloromethaan toe te voegen aan de hars. Roer gedurende 30 seconden tot een minuut en laat weglopen. Herhaal dit proces vier keer met DCM en was de hars vervolgens vijf keer met dimethylformamide.
Om diepe bescherming van de eerste bis-aminozuur en gelijktijdige hars-capping uit te voeren, voegt u langzaam twee milliliter van een oplossing van 33%waterstoff broom in azijnzuur en DCM toe aan het reactievat. Laat 15 minuten roeren na het weglopen en wassen van de hars vijf keer in DCM. Herhaal de D-beschermingssequens nog een keer.
Was vervolgens de hars vijf keer in DCM gevolgd door vijf keer in DMF, neutraliseer de hars door twee keer te wassen met de 5%volume, volume oplossing van D-I-P-E-A in DMF. Was vervolgens vijf keer met DCM en nogmaals vijf keer met DMF. Nu kan koppeling van het beschermde functionele bis-aminozuur worden uitgevoerd.
Herintroduceer eerst een inerte atmosfeer naar het harsbevattende reactievat door drie keer te wassen met anhydrous DCM. Bevestig vervolgens een septum en argonne-lijnzuiver en was het vat door één tot twee milliliter anhydrous DCM toe te voegen en gedurende 30 seconden te roeren. Laat het vat weglopen totdat de argonne-lijnbubbeler begint te stijgen.
Herhaal dit proces nog minstens één keer. Bereid vervolgens een oplossing van functioneel bis-aminozuur in een vlamgedroogde testbuis voor onder Argonne-atmosfeer. Voeg 47 microliter DIC toe en roer gedurende 90 minuten.
Voeg vervolgens 35 microliter D-I-P-E-A toe in 666 microliter en hydrus DMF aan de hars en roer gedurende nog eens vijf minuten. Breng de vooraf geactiveerde BIS-aminozuuroplossing over naar het vat via een spuit en roer de volgende dag 's nachts. Laat het reactiemengsel weglopen en was twee keer met anhydrous DCM terwijl u onder argon bent.
Een kritische stap in deze procedure is de biz-aminozuurkoppelingen. Om di keto piperazine-ring sluitingen te garanderen, gaan we langere reactietijden door met aanvullende activerende agentia. Om de sluiting van de di keto pyrazine te bevorderen, voegt u een HOAT en DIC-oplossing toe, roer onder argon gedurende een uur.
Verwijder vervolgens het septum en laat het reactiemengsel weglopen. Was de hars vijf keer met DCM en vijf keer met DMF. Deze sectie behandelt de diepe bescherming van het functionele BIS-aminozuur, de diepe bescherming van F moc en de acetylering van het eerste BIS-aminozuur.
Voer de diepe bescherming van het beschermde functionele bis-aminozuur uit door langzaam twee milliliter van een oplossing van TFA en TIPS toe te voegen aan het reactievat en gedurende een uur te roeren na het weglopen, was de hars met DCM gedurende ongeveer 30 seconden en laat weglopen, herhaal DCM-was vijf keer. Herhaal vervolgens de volledige diepe bescherming harswassequentie volgens A-D-C-M-D-M-F-was. Neutraliseer de hars door twee keer te wassen met een 5%volume volume oplossing van D-I-P-E-A in DMF.
Voer vervolgens een andere D-C-M-D-M-F-was uit. Vanaf hier kan het BIS-peptide worden verlengd met andere functionele bis-aminozuren of functioneel worden gemaakt op de leidende stikstofcarboxylzuur of beide. Om de FM-groep te deprotecteren, voegt u een twee milliliter oplossing van 20%pipe paridine in DMF toe en mengt u de reactie gedurende 20 minuten.
Laat weglopen en was de hars vijf keer in DMF. Herhaal dit proces nog eens na een extra was van de hars. Isoleer het eerste bis-aminozuur door de bereide aminozuuroplossing toe te voegen aan het react
Overzicht
Dit artikel beschrijft de vast-fase peptidesynthese van een functioneel bis-peptide trimer met behulp van een safety catch cleavable methode vanuit HMBA hars. Het proces omvat meerdere koppelingscycli om de gewenste peptide functionaliteit te bereiken.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Peptidesynthese
- Vast-fase technieken
- Biochemie
Achtergrond
- Vast-fase peptidesynthese maakt het eenvoudiger om reacties te manipuleren.
- Nevenproducten kunnen efficiënt worden verwijderd door middel van filtratie.
- Begrip van de details van elke reactiestap is cruciaal voor succes.
- Checklists kunnen helpen bij het beheren van de repetitieve aard van de procedures.
Doel van de studie
- Om een functioneel BSP-peptide te synthetiseren met behulp van vast-fase technieken.
- Om de efficiëntie van de safety catch cleavable procedure te demonstreren.
- Om de implicaties voor parallelle en bibliotheeksynthese van bis peptiden te verkennen.
Gebruikte methoden
- Beschermde BIS-aminozuren laden op hydroxyethyl benzoic acid hars.
- Diep beschermingskoppelingscycli uitvoeren om het peptide te verlengen.
- DI Keto pyrazine-vorming gebruiken voor cleavable van de hars.
- Vloeistofchromatografie massaspectrometrie gebruiken voor opbrengstanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle synthese van een functioneel BSP-peptide met goede ruwe zuiverheid.
- Consistente geïsoleerde opbrengsten van ongeveer 10% werden bereikt.
- De methode maakt efficiënte manipulatie van de vaste hars mogelijk.
- Visuele demonstraties versterken het begrip van complexe stappen.
Conclusies
- De vast-fase synthesemethode is effectief voor bis-peptide productie.
- Aandacht voor detail in elke stap is essentieel voor hoogwaardige resultaten.
- Deze techniek heeft potentieel voor bredere toepassingen in peptidesynthese.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Solid-phase synthesis of functionalized bis-peptides enables efficient assembly of complex peptide architectures for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The safety catch cleavage method provides controlled release, supporting reproducible synthesis of bis-peptide libraries for screening applications. This approach reduces synthetic burden and improves throughput for lead identification campaigns targeting protein-protein interactions or catalytic functions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of bis-peptide scaffolds to validate therapeutic hypotheses through predictable spatial positioning of functional groups.
- Operational Value: Supports de-risking of target engagement studies by providing access to structurally defined bis-peptide variants.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified bis-peptide libraries suitable for quantitative binding or activity assays in drug discovery.
- Operational Value: Facilitates parallel synthesis on solid resin, improving scalability and reducing purification burden compared to solution-phase methods.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables exploration of structure-activity relationships in bis-peptides for modulating protein-protein interactions or enzymatic function.
- Operational Value: Supports preclinical continuity by delivering consistent material for efficacy and mechanistic studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows for lead identification, where bis-peptide synthesis enables hypothesis testing and pathway clarification prior to optimization.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by providing defined bis-peptide tools to probe target function and interaction networks.
- Screening: Delivers assay-ready bis-peptide libraries with consistent purity for high-throughput or format-flexible screening campaigns.
- Analytics: LC-MS monitoring enables quantitative assessment of coupling efficiency and cleavage success, informing go/no-go decisions in library synthesis.
- Translational Research: Connects discovery-stage bis-peptide generation to preclinical evaluation through reliable, scalable production.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for bis-peptide library generation across multiple targets or modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through access to conformationally constrained bis-peptide scaffolds.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via solid-phase handling and filtration-based byproduct removal.
- Strategic Value: Improved capital efficiency in lead identification by enabling parallel synthesis and reducing failure rates from impure intermediates.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of bis-peptide candidates based on quantifiable purity and yield data from LC-MS analysis.
Implementation Considerations
- Expertise in peptide synthesis, protecting group strategies, and resin handling is required.
- Instrumentation includes inert atmosphere capability, syringes, and LC-MS systems for monitoring.
- Standardization across teams depends on consistent execution of protection, coupling, and cleavage steps.
- Adaptation to other bis-amino acid systems may require optimization of coupling agents and cleavage conditions.
- Practical limitations include the need for anhydrous conditions and careful monitoring to drive reactions to completion due to lack of intermediate purification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:55
Loading of First Bis-Peptide, Deprotection of First Bis-Peptide, and Simultaneous Resin Capping
3:43
Coupling Tert-butyl Carbamate (Boc)/tert-butyl Ester(tBu)-protected Functionalized Bis-Amino Acid
5:21
Deprotection of Boc/tBu-protected Functionalized Bis-Amino Acid, Deprotection of Fmoc, and Acylation of the First Bis-Amino Acid
6:55
Removal of the Boc Group from the Resin Bound Amino Acid and Cleavage from the Resin
7:56
Assessment Methods
9:51
Results: Analysis by Liquid Chromatography and Mass Spectroscopy
10:36
Conclusion
