Name: Zuivering van Pathogeen vacuolen uit Legionella-Geïnfecteerde Fagocyten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Leer een betrouwbare methode voor zuivering van Legionella-bevattende vacuolen uit geïnfecteerde fagocyten. Deze techniek combineert immuno-magnetische scheiding met dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor zuivere monsters.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek in ons laboratorium werd ondersteund door het Max von Pettenkofer Institute, Ludwig-Maximilians Universiteit van München, het Duitse Research Foundation (DFG, HI 1511/3-1) en het Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) &quot;Medische Infection Genomics&quot;-initiatief ( 0315834C).

1. De voorbereidingen voor LCV Isolatie <ol><li> Streak op Legionella pneumophila de productie van DsRed-Express 13,14 uit glycerol voorraad op CYE agar platen met 5 ug / ml chlooramfenicol (Cam) vier dagen voor de LCV isolatie. Incubeer de kiemen bij 37 ° C. </li><li> Zaad uit 1 x 10 7 D. discoideum produceren GFP-calnexin of RAW264.7 murine macrofagen in 75 cm2 weefselkweekflessen een dag voor infectie. Gebruik 10 ml HL5 medium met 20 ug / ml G418 voor D. discoideum en incubeer de amoeben bij 23 ° C. Voor RAW264.7 macrofagen gebruik 10 ml RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FCS (hitte geïnactiveerd) en 1% glutamine en groeien de cellen bij 37 ° C en 5% CO2. Gebruik minimaal drie 75 cm 2 flessen per infectie en monster (minimaal 6 x 10 7 cellen). </li><li> Inoculeer een nachtelijke cultuur met L. pneumophila van de CYE plaat. Neem een ​​buis van 15 ml met 3 ml AYE mediumen 5 ug / ml Cam. Geënt met 100 ul van een bacteriële suspensie in een OD 600 nm van 0,1 oplevert. Incubeer de nacht cultuur op een overhead rotatie wiel bij 37 ° C gedurende 21-22 uur. </li></ol> 2. LCV Isolatie <ol><li> Verander het medium van D. discoideum cellen het antibioticum, die interfereren met de volgende infectie te verwijderen. </li><li> Meet de OD van de nacht cultuur. Bacteriën moeten hebben bereikt piek infectiviteit in een OD 600 nm ≥ 3, hetgeen overeenkomt met 2 x 10 9 bacteriën / ml. </li><li> Infecteren van de cellen door toevoeging van ongeveer 500 pi van de L. pneumophila &#39;s nachts cultuur aan de cellen groeien in 10 ml HL5 medium (D. discoideum) of 10 ml RPMI 1640 (macrofagen). Dit correspondeert met een multipliciteit van infectie (MOI) 50. Vervolgens wordt de infectie gesynchroniseerd door centrifugeren van de bacteriën op de cellen bij 500 g gedurende 10 minuten. Centrifugeren gevolgddoor een incubatie van het D. discoideum cellen bij 25 ° C en RAW264.7 macrofagen bij 37 ° C en 5% CO2, respectievelijk. De infectie van 1 uur onder de centrifugatiestap. </li><li> Na de infectie te verwijderen op de middellange en een keer wassen van de cellen aan de extracellulaire bacteriën te verwijderen. Gebruik ijskoude Int buffer voor D. discoideum en ijskoude PBS voor RAW264.7 macrofagen. Voeg 3 ml HS buffer, aangevuld met proteaseremmers (Roche) aan elke kolf en het verzamelen van de cellen met behulp van een cel schraper. Pool de overeenkomstige monsters in een 15 ml centrifugebuis. </li><li> Voor homogenisering van het monster gebruik 3 ml kunststof Luer-Lock spuiten en de roestvrij stalen kogel homogenisator. Zorg ervoor dat u werkt op het ijs. Voordat u begint, was de bal homogenisator met gedestilleerd water, om geen schoonmaakmiddel besmetting wordt voorkomen en het met ijskoud HS buffer om zich te ontdoen van luchtbellen te spoelen. Gebruik de 8 micrometer speling bal. </li><li> Vul de eerste 3 ml in de spuit und monteren op the homogenisator. Op het monster en weer negen keer door de homogenisator. Daarna wisselen de spuiten om besmetting met niet-gehomogeniseerde materiaal te voorkomen. Verzamel en bundelen de gehomogeniseerde monster in een buis van 15 ml en neem een ​​150 ul monster voor microscopische analyse. Alvorens over te gaan met een andere steekproef uit elkaar en was de bal homogenisator. </li><li> Blok het homogenaat met 2% CS of FCS 30 minuten op een schudapparaat op ijs of op een overhead-draaiende wiel (10-20 rpm) bij 4 ° C. </li><li> Na blokkering gebruik affiniteit-gezuiverde primaire antilichaam tegen SIDC (verdunning 1:3000) of tegen een andere bacteriële marker uitsluitend binding aan de membraan LCV. Vortex het antilichaam oplossing voordat u deze aan het homogene mengsel. Incubeer het monster gedurende 1 uur op een schudinrichting op ijs of op een overhead-draaiende wiel (10-20 rpm) bij 4 ° C. </li><li> In de tussentijd bereiden de Histodenz verloop. Gebruik een buis van 15 ml per helling en de drie 75 cm 2 flessen van een monster. Sparst toevoegen 5,75 ml 35% Histodenz de buis en tweede wordt voorzichtig 5,75 ml 10% Histodenz oplossing op. Daarna zorgvuldig de buizen horizontaal neer gedurende 1 uur. </li><li> Na incubatie van het homogenaat de blokkerend reagens en het primaire antilichaam, centrifuge 600 x g gedurende 15 min bij 4 ° C tot pellet het monster. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 1,5 ml HS buffer. Breng de monsters een nieuwe 15 ml buis en neemt 40 ßl monster voor microscopische analyse later. </li><li> Incubeer de pellet met het secundaire antilichaam - MACS geit anti-konijn IgG microbolletjes (verdunning 1:25) - 30 min op een schudder bij 4 ° C. In de tussentijd zet de kolommen op het MACS magnetische houder en evenwicht komen ze met 0,5 ml HS buffer. </li><li> Vervolgens toepassen monsters aan de kolom. Verzamelen 150 pi van de doorstroming voor verdere microscopische analyse. Was de kolom driemaal met 0,5 ml HS buffer. </li><li> Verwijder de kolommen tHij magneet en eluaat van de lichte bedrijfswagens met 0,5 ml HS buffer door onmiddellijke spuiten. Neem een ​​20 ui monster voor microscopische analyse. De zuivering stap voor immuno-magnetische scheiding wordt verwacht dat de opbrengst per 1 × 10 7 besmet D. discoideum cellen ongeveer 1 x 10 6 intact bedrijfsauto die ongeveer zevenvoudig zijn in het eluaat verrijkt vergeleken met de doorstroom 13. </li><li> Zet de Histodenz gradiënt buizen terug naar een verticale positie en zorgvuldig te laden het eluaat op de top. Centrifugeer de buizen 3350 g gedurende 1 uur bij 4 ° C. </li><li> Na centrifugeren 1,5 ml fracties vanaf de bodem van de reageerbuis met een glazen Pasteur pipet. In totaal acht verzamelen fracties elk van de bodem van de buis. Geen zichtbare lagen worden waargenomen in de continue Histodenz gradiënt. De hoogste opbrengst bedrijfsauto wordt meestal verwacht fractie 4 bij een verhouding van 2 x 10 ~ 5 intact bedrijfsauto per 1 x 10 7fected amoeben 13. Kleine hoeveelheden bedrijfsauto ook in fracties 3 respectievelijk 5. Aldus de totale opbrengst van gezuiverd bedrijfsauto is ~ 1 x 10 6 intact bedrijfsauto per 6 x 10 7 geïnfecteerd D. discoideum cellen 13. Het herstel van bedrijfsauto kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT), en de bedrijfsauto gelijkmatig enkele uren. </li></ol> 3. Microscopische analyse van de verzamelde monsters <ol><li> Bereid een 24-well vlakke bodem weefselkweek plaat met poly-L-lysine beklede dekglaasjes. </li><li> Pipetteer elke monster in het LCV zuivering en 150 ul van elke fractie in dichtheidsgradiënt 24-wells plaat. 0,5 ml buffer HS in elk putje om de hoge Histodenz concentratie te verdunnen. Daarna wordt gecentrifugeerd plaat 600 g gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder de supernatant en zet de monsters met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 min bij KT. Na fixatie was de monsters twee keer. Onse Int voor D. discoideum en PBS RAW264.7 macrofagen. </li><li><ol class="lalpha"><li> Monteer de monsters van GFP-calnexin uiten D. discoideum, genomen op verschillende stappen tijdens het LCV isolatie, direct op glas-dia&#39;s met behulp van bijvoorbeeld Vectashield. </li><li> Incubeer de monsters van RAW264.7 macrofagen, genomen op verschillende stappen tijdens LCV isolatie met blokkeeroplossing (1% BSA in PBS) gedurende 10 min bij KT. Gebruik een anti-SIDC primaire antilichaam aan de lichte bedrijfswagens vlekken en voor 1 uur incuberen in een vochtige kamer bij RT (affiniteit-gezuiverd konijn anti-SIDC; 1:1000 in het blokkeren van buffer). Vervolgens wassen monsters drie keer met PBS. Incuberen met een secundair antilichaam (bijv. anti-konijn Cy5, 1:200 in blokkeeroplossing) gedurende 30 min in een vochtige en donkere kamer bij KT. Tot slot, was de monsters drie keer met PBS en monteer ze op glas-dia&#39;s met behulp van bijvoorbeeld Vectashield. </li></ol></li><li> Morfologie, integriteit en hoeveelheid van de lichte bedrijfsvoertuigen geïsoleerd van GFP-calnexin uiten D. discoideum of RAW264.7 macrofagen worden geanalyseerd door een fluorescentiemicroscoop met de passende filters. </li></ol> 4. Representatieve resultaten De kwaliteit en opbrengst van het LCV zuivering van immuno-affiniteit scheiding en dichtheid gradiënt centrifugatie kunnen worden gevolgd door fluorescentiemicroscopie (Fig. 1). Een overzicht van de monsters verzameld in het LCV isolatie van D. discoideu m of macrofagen wordt (Fig. 2). Het homogenaat van L. pneumophila geïnfecteerde fagocyten toont intact lichte bedrijfswagens, maar ook veel celresten en extracellulaire bacteriën. Na het pelleteren het monster, het beeld is vergelijkbaar met de homogenaat, soms een beetje dichter. Sinds intact lichte bedrijfswagens moet vasthouden aan de kolom, de flow-through bevat voornamelijk extracellulaire bacteriën en celresten. Na het elueren van het monster uit de kolom, het eluaat bevat intact lichte bedrijfswagens in grote hoeveelheden. In onze handen, de LCV purificati<html> op lijkt meer effectief D. discoideum dan macrofagen. In D. discoideum de ziekteverwekker vacuolen verschijnen ronder en de opbrengst van geïsoleerde lichte bedrijfswagens is meer dan 10 keer hoger in vergelijking met macrofagen (afb. 3). In intacte macrofagen LVCs gekleurd met verschillende antilichamen verschijnen ook meer een onregelmatige vorm. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematisch overzicht van LCV isolatie. A) Isolatie van lichte bedrijfsvoertuigen door immuno-magnetische scheiding met behulp van een affiniteit-gezuiverd antilichaam tegen de bacteriële effector eiwit SIDC, het lokaliseren van uitsluitend aan de LCV membraan. Een secundaire MACS micro kraal gekoppelde antilichaam en een magneet worden gebruikt voor het isoleren van lichte bedrijfswagens celresten. B) Na immuno-magnetische scheiding bedrijfsauto verder gezuiverd door Histodenz dichtheid gradiënt centrifugatie. Lichte bedrijfswagens zijn verrijkt in fractie 4. upload/4118/4118fig2.jpg &quot;/&gt; Figuur 2. Monsters die afgenomen worden tijdens de LCV zuivering. Beelden uit de homogenaat, pellet, doorstroom en eluaat van D. discoideum of macrofagen zijn afgebeeld. De monsters tonen L. pneumophila produceren DsRed-Express (rood) in D. discoideum produceren GFP-calnexin signaal (groen, bovenste paneel) of macrofagen gekleurd met een anti-SIDC antilichaam (cyaan, onderste paneel). Bars, 10 pm. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4118/4118fig3.jpg" /> Figuur 3. Gezuiverd lichte bedrijfswagens van D. discoideum of macrofagen. De monsters vertonen fractie 4 na Histodenz dichtheid gradiënt centrifugatie L. pneumophila produceren DsRed-Express (rood) in (A) D. discoideum produceren GFP-calnexin signaal (groen) of (B) in macrofagen gekleurd met een anti-SIDC antilichaam (cyaan). Bars, 10 pm.

<ol><li>Hilbi, H., Hoffmann, C., Harrison, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Legionella+spp.+outdoors%3A+colonization%2C+communication+and+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol.+Rep%22%5BJournal%5D)">Legionella spp. outdoors: colonization, communication and persistence.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3, 286-296 (2011).</li>
<li>Zhu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+protein+substrates+of+the+Dot%2FIcm+type+IV+transporter+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of protein substrates of the Dot/Icm type IV transporter of Legionella pneumophila.</a> PLoS ONE. 6, e17638(2011).</li>
<li>Hilbi, H., Weber, S., Finsel, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anchors+for+effectors%3A+subversion+of+phospho-inositide+lipids+by+Legionella%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anchors for effectors: subversion of phospho-inositide lipids by Legionella.</a> Front Microbiol. 2, 91(2011).</li>
<li>Hubber, A., Roy, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+host+cell+function+by+Legionella+pneumophila+type+IV+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulation of host cell function by Legionella pneumophila type IV effectors.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 26, 261-283 (2010).</li>
<li>Kima, P. E., Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+calnexin+expression+on+phagosomes+to+isolate+Leishmania+parasitophorous+vacuoles%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Exploiting calnexin expression on phagosomes to isolate Leishmania parasitophorous vacuoles.</a> Microb. Pathog. 38, 139-145 (2005).</li>
<li>Lührmann, A., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+purify+bacteria-containing+phagosomes+from+infected+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A method to purify bacteria-containing phagosomes from infected macrophages.</a> Methods Cell Sci. 22, 329-341 (2000).</li>
<li>Sturgill-Koszycki, S., Haddix, P. L., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+between+Mycobacterium+and+the+macrophage+analyzed+by+two-dimensional+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">The interaction between Mycobacterium and the macrophage analyzed by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Electrophoresis. 18, 2558-2565 (1997).</li>
<li>Fernandez-Mora, E., Polidori, M., Lührmann, A., Schaible, U. E., Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+Rhodococcus+equi-containing+vacuoles+is+arrested+after+completion+of+the+early+endosome+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Maturation of Rhodococcus equi-containing vacuoles is arrested after completion of the early endosome stage.</a> Traffic. 6, 635-653 (2005).</li>
<li>Mills, S. D., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+Salmonella+typhimurium+and+Yersinia+pseudotuberculosis-containing+phagosomes+from+infected+mouse+macrophages%3A+Y.+pseudotuberculosis+traffics+to+terminal+lysosomes+where+they+are+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of Salmonella typhimurium and Yersinia pseudotuberculosis-containing phagosomes from infected mouse macrophages: Y. pseudotuberculosis traffics to terminal lysosomes where they are degraded.</a> Eur. J. Cell Biol. 77, 35-47 (1998).</li>
<li>Shevchuk, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+Legionella-containing+phagosomes+isolated+from+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of Legionella-containing phagosomes isolated from Dictyostelium.</a> Int. J. Med. Microbiol. 299, 489-508 (2009).</li>
<li>Brombacher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab1+guanine+nucleotide+exchange+factor+SidM+is+a+major+phosphatidylinositol+4-phosphate-binding+effector+protein+of+Legionella+pneumophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Rab1 guanine nucleotide exchange factor SidM is a major phosphatidylinositol 4-phosphate-binding effector protein of Legionella pneumophila.</a> J. Biol. Chem. 284, 4846-4856 (2009).</li>
<li>Urwyler, S., Finsel, I., Ragaz, C., Hilbi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Legionella-containing+vacuoles+by+immuno-magnetic+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of Legionella-containing vacuoles by immuno-magnetic separation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. Chapter 3, Unit 3(2010).</li>
<li>Urwyler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+Legionella+vacuoles+purified+by+magnetic+immunoseparation+reveals+secretory+and+endosomal+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of Legionella vacuoles purified by magnetic immunoseparation reveals secretory and endosomal GTPases.</a> Traffic. 10, 76-87 (2009).</li>
<li>Mampel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Planktonic+replication+is+essential+for+biofilm+formation+by+Legionella+pneumophila+in+a+complex+medium+under+static+and+dynamic+flow+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Planktonic replication is essential for biofilm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static and dynamic flow conditions.</a> Appl. Environ. Microbiol. 72, 2885-2895 (2006).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In tegenstelling tot eerder gepubliceerde werkwijzen wordt dit protocol op twee stappen, eerst de scheiding van bedrijfsauto door een immuno-magnetische benadering, en anderzijds de zuivering van bedrijfsauto door dichtheid gradiënt centrifugatie. De LCV isolatie kan worden gevolgd door fluorescentiemicroscopie bij een fluorescent gelabelde bacteriën en GFP-cellen of antilichamen kleuring gebruikt. Het protocol beschreven is een eenvoudige ongecompliceerde methode waardoor de verrijking van bedrijfsauto met een hoge zui...

zuivering van pathogeen vacuolen uit<em&gt; legionella</em&gt;-geïnfecteerde fagocyten

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

De opportunistische pathogeen Legionella pneumophila is een amoebe-resistente bacterie, die ook repliceert in alveolaire macrofagen waardoor voor de ernstige longontsteking &quot;veteranenziekte&quot; 1. In protozoa en zoogdieren fagocyten, L. pneumophila maakt gebruik van een geconserveerd mechanisme om een specifieke, replicatie-tolerante compartiment, de &quot;Legionella-bevattende vacuole&quot; (LCV) te vormen. LCV vorming vereist dat de bacteriële ICM / Dot type IV secretie systeem (T4SS), die maar liefst 275 &quot;effector&quot; eiwitten translokeert in gastheercellen. De effectoren manipuleren gastheer eiwitten en lipiden en communiceren met secretie, endosomale en mitochondriale organellen 2-4. De vorming van een complexe bedrijfsauto, robuuste en redundante proces moeilijk te vatten in een reductionistische wijze. Een integrale aanpak is nodig om volledig te begrijpen LCV vorming, inclusief een globale analyse van het padOgen-host factor interacties en hun temporele en ruimtelijke dynamiek. Als een eerste stap op weg naar dit doel, zijn intact lichte bedrijfswagens gezuiverd en geanalyseerd met behulp van proteomics en lipidomics. De samenstelling en de vorming van pathogeen bevattende vacuolen is onderzocht door proteoomanalyse met vloeistofchromatografie en 2-D gelelektroforese gekoppeld met massaspectrometrie. Vacuolen geïsoleerd van zowel de sociale bodem amoebe Dictyostelium discoideum of zoogdieren fagocyten koesterde Leishmania 5, Listeria 6, Mycobacterium 7, Rhodococcus 8, 9 of Salmonella Legionella spp. 10. De zuivering protocollen gebruikt in deze studie zijn tijdrovend en moeizaam, omdat hiervoor bijvoorbeeld elektronenmicroscopie LCV morfologie integriteit en zuiverheid analyseren. Bovendien zijn deze protocollen niet gebruikmaken van specifieke kenmerken van de ziekteverwekker vacuole voor enrichment. De hier beschreven methode overwint deze beperkingen door gebruik D. discoideum het produceren van een fluorescente marker LCV en door zich te richten de bacteriële effector eiwit SIDC, die selectief ankers om het LCV membraan door te binden aan fosfatidylinositol 4-fosfaat (PtdIns (4) P) 3,11. Bedrijfsauto zijn verrijkt in een eerste stap van immuno-magnetische scheiding met affiniteit-gezuiverde primaire antilichaam tegen SIDC en een tweede antilichaam gekoppeld met magnetische korrels, gevolgd in een tweede stap een klassieke Histodenz dichtheid gradiënt centrifugatie 12,13 (Fig. 1) . Een proteoom studie van geïsoleerde lichte bedrijfswagens van D. discoideum bleek meer dan 560 gastheercel eiwitten, zoals eiwitten geassocieerd met fagocytaire vesicles, mitochondria, ER en Golgi, alsmede enkele GTPases, die niet in LCV vorming betrokken bij 13. Lichte bedrijfswagens verrijkt en gezuiverd met debeschreven protocol kan hier verder worden geanalyseerd met behulp van microscopie (immunofluorescentie, elektronenmicroscopie), biochemische methoden (Western blot) en proteomics of lipiden benaderingen.

Dit artikel beschrijft een werkwijze voor de isolatie en zuivering van intacte<em&gt; Legionella</em&gt;-Met vacuolen (lichte bedrijfsvoertuigen) van amoebe en macrofagen. De twee-staps protocol omvat LCV verrijking van immuno-magnetische scheiding met een antilichaam tegen bacteriële LCV marker en verdere zuivering door dichtheid gradiënt centrifugatie.

Zuivering van Pathogeen vacuolen uit<em&gt; Legionella</em&gt;-Geïnfecteerde Fagocyten

De opportunistische pathogeen Legionella pneumophila is een amoeberesistente bacterie die zich ook repliceert in alveolaire macrofagen, waardoor de ernstige ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het isoleren van intacte legionella-bevattende VAE's of LCD's uit geïnfecteerde fagocyten. Dit wordt bereikt door de geïnfecteerde fagocyten eerst te homogeniseren met een roestvrijstalen kogelhomogenisator. Tijdens de tweede stap wordt het homogenizaat geïncubeerd met een primair antilichaam dat specifiek gericht is tegen een bacterieel effectorproteïne dat lokaliseert naar het LCV-membraan, gevolgd door incubatie met een secundair antilichaam gekoppeld aan magnetische kralen.Vervolgens worden de met antilichamen versierde LCD's vastgehouden door een magnetisch veld, waarna ze worden gewassen en geëlueerd. Uiteindelijk kunnen de magnetisch verrijkte LCD's verder worden gezuiverd via dichtheidsgradiëntcentrifugatie.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat compartimentspecifieke moleculaire kenmerken van de geïnfecteerde parasieten kunnen worden benut om intacte pathogene bacteriën te zuiveren. Vier dagen vóór de LCV-isolatie wordt DS red express-producerende Legionella pneumophila vanuit glycerolvoorraden uitgestreken op houtskool-gistextract-agarplaten met 5 µg/mL chloramphenicol. Incub

purification-of-pathogen-vacuoles-from-legionella-infected-phagocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Jung, A. L. et. al., Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the pre-treatment of macrophages with Legionella pneumophila outer membrane vesicles (OMVs) to examine their effect on bacterial replication. By altering host immune signaling, OMVs make macrophages more permissive to infection. Higher colony counts in treated cells, compared to untreated ones, indicate...

Assaying Legionella pneumophila Replication in Macrophages Pretreated with Outer Membrane Vesicles

Source: Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles: Isolation and Analysis of Their Pro-inflammatory Potential on Macrophages. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the isolation of outer membrane vesicles (OMVs) from Legionella pneumophila using sequential centrifugation, sterile filtration, and ultracentrifugation. The purified OMVs, enriched in membrane proteins and lipopolysaccharides, are suitable for host-pathogen interaction studies.

Ultracentrifugation-Based Isolation of Legionella pneumophila Outer Membrane Vesicles

Source: Sigal, N., et al. RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells. J. Vis. Exp. (2016).This video demonstrates the isolation of internalized pathogenic bacteria from infected bone marrow-derived macrophages (BMDMs). Bacteria are allowed to attach to host cells, and unattached bacteria are washed away. After internalization, an antibiotic is added to eliminate non-internalized bacteria. The host cells are lysed, centrifuged, and the supernatant is...

Isolation of Intracellular Pathogenic Bacteria from Infected Host Cells

Source: Pett, N., et al. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the purification of bacteriophages from bacterial cell lysates using sequential centrifugation, membrane filtration, chloroform extraction, centrifugal filtration, and buffer exchange to obtain a purified phage preparation.

Purification of Bacteriophages from Bacterial Lysate

Deze techniek verschaft een werkwijze te oogsten, normaliseren en kwantificeren intracellulaire groei van bacteriële pathogenen die vooraf gekweekt in natuurlijke protozoa gastheercellen voor infecties van zoogdiercellen. Deze methode kan worden aangepast aan een grote verscheidenheid van gastheercellen voor de priming podium en doelcel types tegemoet.

Handelbaar Mammalian Cell Infecties met Protozoan-geprimed Bacteriën

De larve van de wasmot Galleria mellonella werd onlangs opgericht als een in vivo model om Legionella pneumophila infectie te bestuderen. Hier tonen we basistechnieken de pathogenese van Legionella karakteriseren de larven, zoals inoculatie meting van bacteriële virulentie en replicatie en extractie en analyse van geïnfecteerde hemocytes.

Gebruik<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Als modelorganisme om te studeren<em&gt; Legionella pneumophila</em&gt; Infectie

We beschrijven de kwantificering van cytosolische en vacuolaire Salmonella typhimurium in uit beenmerg afgeleide macrofagen met behulp van differentiële digitonine permeabilisatie.

Kwantificering van cytosolische vs. vacuole<em&gt; Salmonella</em&gt; In het Primair macrofagen door Differential Permeabilisatie

We beschrijven de zuivering van Legionella pneumophila (L. pneumophila) buitenmembraan vesicles (OMV) van vloeibare kweken. Deze gezuiverde blaasjes worden vervolgens gebruikt voor de behandeling van macrofagen aan de pro-inflammatoire potentieel analyseren.

Legionella pneumophila Outer membraanvesicles: Isolatie en analyse van hun pro-inflammatoire Potential op macrofagen

We beschrijven hier een eenvoudige en snelle methode voor de isolatie van Salmonella typhimurium-phagosomes van macrofagen bevattende coating van de bacteriën met biotine en daar.

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Beeldvorming van bacteriële cellen is een opkomende systeembiologiebenadering gericht op het definiëren van statische en dynamische processen die de functie van grote macromoleculaire machines dicteren. Hier wordt integratie van kwantitatieve live celbeeldvorming en cryo-elektronentomografie gebruikt om legionella pneumophila type IV secretiesysteemarchitectuur en -functies te bestuderen.

Live Cell Imaging en Cryo-Electron Tomography toepassen op Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Leer een betrouwbare methode voor zuivering van Legionella-bevattende vacuolen uit geïnfecteerde fagocyten. Deze techniek combineert immuno-magnetische scheiding met dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor zuivere monsters.

Zuivering van Pathogeen vacuolen uit

Meer video's verkennen