DNA vector-gebaseerde RNA-interferentie op genfunctie in Cancer Study

Het algemene doel van deze procedure is om de genfunctie te bepalen door gebruik te maken van DNA vector-gebaseerde RNA interferentie. Dit wordt bereikt door eerst S-H-R-N-A constructen te ontwerpen en te genereren die specifieke genen targeten. De tweede stap is om een lentivirus te produceren dat het SH RNA expressiecassette draagt.

Vervolgens worden stabiele cellijnen gegenereerd door cellen te infecteren met het lentivirus en de cellen die met het lentivirus geïnfecteerd zijn, worden gebruikt in verschillende in vitro en in vivo assays om de effecten van het silencing van het gen van belang te bepalen. Uiteindelijk kunnen de resultaten, afhankelijk van de gebruikte assays, veranderingen in tumorgeniciteit van de cellen laten zien als resultaat van genknockdown door gebruik van in vitro proliferatie, migratie en invasie assays, evenals in vivo xenograft formatie modellen. Het demonstreren van de procedure zal worden gedaan door Daniel Stowell, ma Juan, en Daniel is een afstudeerstudent in mijn lab. Ma Ma is een technicus.

Chang is een postdoctoraal onderzoeker. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het kankeronderzoeksveld te beantwoorden, zoals of een specifiek gen een rol speelt in kankerontwikkeling en -progressie, en welke aspecten van deze processen er belangrijk voor kunnen zijn. Om te beginnen ontwerpen en bestellen de oligonucleotiden op basis van de beschreven criteria Anil de twee reverse complementaire oligo's die de 20 tot 23 nucleotiden doelsequentie in het doelgen bevatten.

Ze zullen eco R een en Hindi drie sites vormen aan de twee uiteinden. Na het knielen bevat een ander oligo een reverse complementaire sequentie naar de doelsequentie, en zijn drie prime-uiteinde. Neils naar het drie prime-uiteinde van de H een of U zes promotor met een upstream-primer.

Gebruik een PCR om een fragment te maken dat BAM H een en Hindi drie sites aan beide uiteinden heeft. Digest intussen de lentivirus vector en het PCR fragment. Voer vervolgens een drie fragment ligatie reactie uit tussen de vector, het PCR fragment en de Anil oligo nucleotiden.

Bij een 1 tot 10 tot 10 molaire verhouding zal de resulterende vector de HRNA van belang produceren met een Hindi drie sequentie in de lusregio. Als een induceerbare vector wordt gebruikt, zal de HRNA productie afhangen van de aanwezigheid van een inductor molecuul zoals doxycycline voor het Tet on systeem. Transformeer nu zeer efficiënte, competente e coli DH vijf alfa cellen met behulp van het geligade product en identificeer positieve vectoren met behulp van een op kolonie gebaseerde PCR screen.

Versterk een product dat de vector en de induceerbare promotor ligatieplaats overspant. Bereid plasma DNA van de positieve kolonies met een commercieel kit. Bevestig vervolgens de aanwezigheid van de insert door BAM H een en ECO R een digestie en door DNA agarose elektroforese.

Sequens bovendien het gebied dat de promotor en S-H-R-N-A bevat met behulp van LIGA nucleotide P vijf. Gebruik een endotoxine vrij MIDI of maxi prep kit om de lentivirus DNA te bereiden die het HRNA expressiecassette draagt. Bepaal de DNA concentratie door de lichtabsorptie bij 260 nanometer te meten en zorg ervoor dat de DNA's zuiverheid is door te controleren dat de 260 tot 280 nanometer lichtabsorptie verhouding tussen 1,8 en 2,0 ligt.

Ten slotte voer de lentivirus plasmide op een aero gel uit om er zeker van te zijn dat het S gespiraliseerd is. Voor de transfectie bereid je voor door eerst langzaam 0,9 milliliter oplossing A te druppelen in 0,9 milliliter oplossing B terwijl je lucht door oplossing B laat bubbelen met behulp van een pipette. Bewaar vervolgens het mengsel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Laat vervolgens langzaam 0,6 milliliter van het mengsel druppelen op drie verschillende 10 centimeter platen met HEK 2 93 T cellen.

Breng vervolgens de cellen vier tot zes uur later terug naar de incubator. Vervang het medium met zeven milliliter compleet DMEM medium. Voeg na 24 uur nog vijf milliliter medium toe en oogst na nog eens 24 uur het medium dat het lentivirus bevat.

Centrifugeer het geoogste medium bij 1500 RPM bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Filter de supernatant met behulp van een 0,45 micrometer filter. Centrifugeer het flow-through medium dat het lentivirus bevat door ultracentrifugatie.

Decanteer de supernatant in een afvali container met 5%bleach. Resuspendeer het lentivirus pellet in een half tot een milliliter van koud een XPBS. Verdeel vervolgens de lentivirus oplossing in 50 tot 100 microliter aliquots voor opslag bij min 80 graden Celsius.

Bepaal tenslotte het titer van het lentivirus met behulp van een betrouwbare techniek. Typisch zal een 10 centimeter kweekschaal 50 tot 100 miljoen infectieuze eenheden produceren voordat je verdergaat met celinfectie. Bepaal de MOI van het lentivirale titer met behulp van een kit of R-T-P-C-R voor deze procedure.

Een MOI lager dan vier wordt aanbevolen. Begin door de te infecteren cellen in een zes putjes plaat te zaaien tot 30 tot 40%co fluentie en kweek ze een nacht lang. De volgende dag.

Vervang het medium met een milliliter vers medium dat poly brein of protamine bevat. Voeg vervolgens tussen een en 2 miljoen iu toe. Een lentivirus dat een fluorescente of een antibioticum marker bevat.

Schud de plaat gedurende 10 seconden langzaam om te mengen en incubeer deze gedurende zes uur. Vervang na zes uur het medium met normaal, compleet medium en vermeerder de cellen gedurende twee dagen. Het medium mag geen antibiotica of inductoren bevatten ongeacht het gebruikte lentivirus na twee dagen.

Voeg het juiste antibioticum toe als het lentivirus een antibioticum marker bevat. Voeg eveneens inductor toe aan de helft van de culturen als het lentivirus induceerbaar is. Na twee of drie dagen de cellen te hebben gekweekt met antibiotica en inductoren, voer een westerse bloed analyse uit om de knockdown van het doelgen te testen voorafgaand aan xenograft trypsinogenogen.

De cellen uit grote kweekschalen nemen en ze resuspenderen in origineel medium dat 50% matrigel bevat. Het is essentieel om kankercellen gesuspendeerd te houden en in 50% matrigel en de spuit op ijs te bewaren. Anders bestaat het risico dat de matrigel zal stollen en de infectie zal moeten worden a