DNA vector-gebaseerde RNA-interferentie op genfunctie in Cancer Study

Het algemene doel van deze procedure is om genfuncties te bepalen middels DNA-vectorgebaseerde RNA-interferentie. Dit wordt bereikt door eerst shRNA-constructen te ontwerpen en te genereren die gericht zijn op specifieke genen. De tweede stap is het produceren van lentivirus dat de shRNA-expressiecassette draagt.

Vervolgens worden stabiele cellijnen gegenereerd door cellen te infecteren met het lentivirus, waarna de met het lentivirus geïnfecteerde cellen worden gebruikt in diverse in vitro en in vivo assays om de effecten van het uitschakelen van het gen van belang te bepalen. Afhankelijk van de gebruikte assays kunnen de resultaten uiteindelijk veranderingen in de tumorigeniciteit van de cellen laten zien als gevolg van gen-knockdown, door middel van in vitro proliferatie-, migratie- en invasie-assays, evenals in vivo xenograft-vormingsmodellen. De procedure wordt gedemonstreerd door Daniel Stowell en Ma Juan; Daniel is een promovendus in mijn laboratorium en Ma Juan is een technicus.

Chang is een postdoctoral fellow. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen in het kankeronderzoek, zoals of een specifiek gen een rol speelt bij de ontwikkeling en progressie van kanker, en voor welke aspecten van deze processen het mogelijk belangrijk is. Begin met het ontwerpen en bestellen van de oligonucleotiden op basis van de beschreven criteria; Anil, de twee reverse complementaire oligos die de targetsequentie van 20 tot 23 nucleotiden in het targetgen bevatten.

Deze vormen Eco R1- en HindIII-sites aan de twee uiteinden. Na annealing wordt een andere oligo, die een reverse complementaire sequentie van de doelsequentie bevat, aan het 3'-uiteinde van de H1- of U6-promotor geanneald met een upstream primer.

Gebruik een PCR om een fragment te maken met BAM HI- en HindIII-sites aan beide uiteinden. Digesteer ondertussen de lentivirale vector en het PCR-fragment. Voer vervolgens een ligatiereactie uit met drie fragmenten tussen de vector, het PCR-fragment en de Anil-oligonucleotiden.

Bij een molaire ratio van 1:10:10 zal de resulterende vector het HRNA van belang produceren met een Hindi III-sequentie in de lusregio. Indien een induceerbare vector wordt gebruikt, zal de HRNA-productie afhangen van de aanwezigheid van een induceermolecuul, zoals doxycycline voor het Tet-on-systeem. Transformeer nu hoogefficiënte, competente E. coli DH5α-cellen met het geligreerde product en identificeer positieve vectoren met behulp van een kolonie-gebaseerde PCR-screening.

Amplificeer een product dat zich uitstrekt over de vector en de ligatieplaats van de induceerbare promoter. Bereid plasmide-DNA voor uit de positieve kolonies met een commerciële kit. Bevestig vervolgens de aanwezigheid van het insert door Bam HI- en Eco RI-digestie en door agarose-gelelektroforese van het DNA.

Sequenceer daarnaast de regio die de promotor en S-H-R-N-A bevat met behulp van LIGA nucleotide P vijf. Bereid het lentivirus-DNA dat de HRNA-expressiecassette draagt voor, met gebruik van een endotoxinevrije MIDI- of maxi-prepkit. Bepaal de DNA-concentratie door de lichtabsorptie bij 260 nanometer te meten en controleer de zuiverheid van het DNA door te verifiëren dat de verhouding van de lichtabsorptie bij 260 tot 280 nanometer tussen 1,8 en 2,0 ligt.

Voer tenslotte een agarosegel-elektroforese uit voor het lentivirale plasmide om te controleren of het supercoiled is. Bereid de transfectie voor door eerst langzaam 0,9 milliliters van oplossing A te druppelen in 0,9 milliliters van oplossing B, terwijl er met een pipet lucht door oplossing B wordt gebubbeld. Incubeer het mengsel vervolgens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Druppel daarna langzaam 0,6 milliliters van het mengsel op drie verschillende 10 centimeter platen met HEK 293 T-cellen.

Plaats de cellen vier tot zes uur later terug in de incubator. Vervang het medium door 7 mL compleet DMEM-medium. Voeg na 24 uur nog eens 5 mL medium toe en oogst na nog eens 24 uur het medium dat het lentivirus bevat.

Centrifugeer het geoogste medium gedurende 10 minuten bij 1500 RPM op kamertemperatuur. Filtreer het supernatant met een 0,45 micrometer filter. Centrifugeer het doorstromende medium dat het lentivirus bevat via ultracentrifugatie.

Giet het supernatant af in een afvalcontainer met 5% bleekmiddel. Resuspendeer het lentiviruspellet in een halve tot één milliliter koude 1X PBS. Verdeel de lentivirusoplossing vervolgens in aliquots van 50 tot 100 microliter voor bewaring bij minus 80 graden Celsius.

Bepaal tot slot de titer van het lentivirus met een betrouwbare techniek. Gewoonlijk produceert een kweekschaal van 10 centimeter 50 tot 100 miljoen infectieuze eenheden voordat er wordt overgegaan tot celinfectie. Bepaal voor deze procedure de MOI van de lentivirale titer met behulp van een kit of RT-PCR.

Een MOI lager dan vier wordt aanbevolen. Begin met het uitplaten van de te infecteren cellen in een zeswellsplaat tot een confluentie van 30 tot 40% en cultureer deze gedurende de nacht. De volgende dag.

Vervang het medium door één milliliter vers medium dat poly-brain of protamine bevat. Voeg vervolgens tussen de 1 en 2 miljoen iu van een lentivirus toe dat een fluorescentie- of antibioticummarker bevat.

Schud de plaat langzaam gedurende 10 seconden om te mengen en incubeer deze gedurende zes uur. Vervang na zes uur het medium door normaal, compleet medium en kweek de cellen gedurende twee dagen verder. Het medium mag na twee dagen geen antibiotica of induceerders bevatten, ongeacht het gebruikte lentivirus.

Voeg het juiste antibioticum toe als het lentivirus een antibioticummarker bevat. Voeg op dezelfde wijze een inductor toe aan de helft van de culturen als het lentivirus induceerbaar is. Nadat de cellen nog twee of drie dagen zijn gekweekt met antibiotica en inductoren, wordt een western blot-analyse uitgevoerd om de knockdown van het doelgen te testen voorafgaand aan de xenograft trypsin eyes.

Oogst de cellen uit grote celkweekschalen en resuspendeer ze in het oorspronkelijke medium dat 50% matrigel bevat. Het is essentieel om de geresuspendeerde kankercellen in 50% matrigel en de spuit op ijs te bewaren. Anders bestaat het risico dat de matrigel stolt en de infectie opnieuw moet worden uitgevoerd.

Bereid de chirurgische plaats voor door deze grondig te reinigen met 70%ethanol en voer de anesthesie uit met uitstekende ventilatie en een isofluoraan-scavengerfilter bevestigd aan de inductiekamer. Anestheseer een thymic nude muis met 2%isofluoraan gemengd met 1,5%oxygen drie tot vijf minuten vóór de celinoculatie. Handhaaf vervolgens de anesthesie met 2%isofluoraan gemengd met oxygen via een neusmasker.

Plaats de muis op een warmteplateau dat is ingesteld op 30 °C. Laad de cellen in spuiten met naalden van 25,5 gauge voor subcutane injecties, of naalden van 28 tot 30 gauge voor orthotope injecties. Injecteer vijf minuten na de inductie van de anesthesie op één of twee locaties één tot 10 miljoen cellen in bolussen van 200 µL.

Het aantal cellen is afhankelijk van de maligniteit of agressiviteit van de kankercellen. Gebruik voor constitutief actieve vectoren twee groepen muizen die zijn geïnjecteerd met cellen die respectievelijk het doelgen S-H-R-N-A of een gescrambelde S-H-R-N-A-sequentie op vectoren tot expressie brengen. Gebruik dezelfde twee groepen en verdeel deze elk in subgroepen die wel of niet een induceerder in hun drinkwater krijgen.

Vervang tweemaal per week de drinkflessen met water. Controleer wekelijks of tweewekelijks het volume van de tumoren met een schuifmaat. Zorg ervoor dat het tumorvolume de institutionele limiet of de limiet van de A CUC niet overschrijdt en euthanaseer alle dieren die uitgebreide ulceratie, necrose, duidelijke infectie, ongecontroleerde bloedingen of een terminale ziekte vertonen. Om tumorstoring en metastase via een bioluminescente marker te monitoren, desinfecteer dan de werkruimte en anesthetiseer de muizen in een beeldvormingskamer met gasvormige anesthesie.

Maak eerst een belichting van twee tot vijf minuten, controleer de signaalintensiteit en pas deze vervolgens naar behoefte aan. Indien de tumoromvang 1000 kubieke millimeter of de institutionele groottelimiet overschrijdt, dient het dier bij het offeren te worden geëuthanaseerd; documenteer de tumoromvang en bewaar deze voor verdere analyse. Dit protocol werd gebruikt om de effecten van why Y one knockdown te bestuderen op de vorming van xenograft-tumoren van luciferase-expresserende humane borstadenocarcinoomcellen geïmplanteerd in athyme naaktmuizen.

Zowel de S-H-R-N-A-doelsequentie van het menselijke YY1 als een gescrambelde controle-S-H-R-N-A, die geen significante gelijkenis vertoonde met enig bekend menselijk transcript, werden getest. Als resultaat werden twee lentivirale vectoren geconstrueerd en gebruikt om twee lentivirussen te produceren. Beiden werden gebruikt om twee verschillende celpopulaties te infecteren, waarna polyklonale celpopulaties werden verkregen.

Na selectie met puromycine bevestigde Western blot-analyse de DS-geïnduceerde knockdown van YY1 in deze geïnfecteerde cellijnen. Vervolgens werd de polyklonale celpopulatie van kloon drie die was geïnfecteerd met induceerbare YY1 shRNA en de controle-shRNA.

LENTIVIRussen werden gebruikt om de effecten van YY1-depletie op invasie te testen. We observeerden dat YY1-depletie de invasiviteit van de cellen verminderde. Western blot-analyse bevestigde de geïnduceerde YY1-silencing in cellen met de indu YY1 S-H-R-N-A, terwijl cellen met de controle.

S-H-R-N-A vertoonde dit effect niet. Deze cellen werden vervolgens gebruikt in een xenograft-muismodelstudie vergeleken met de controlegroepen indu, YY one S-H-R-N-A geïmplanteerde muizen die water bevattende dosissen kregen, vertoonden een significant verminderde tumorvorming bij visualisatie via bioluminescentie en bij de meting van het tumorgewicht, zoals verwacht. YY one silencing in deze xenograft-tumoren werd eenvoudig bevestigd via western blot.

Studies Vergeet niet dat werken met lentivirus uiterst gevaarlijk kan zijn volgens de NIHB-veiligheidsoverwegingen voor onderzoek met lentivirale vectoren; verbeterde veiligheidsniveau 2-insluitingsprocedures zijn vereist voor alle laboratoriumomgevingen.