Name: Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Leer neurale lijstcellen isoleren en kweken uit embryonale muizenneurale buis zonder FACS of feederlagen. Deze methode levert 96% zuivere premigratoire cellen op voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen Marc Wozniak erkennen voor video-ondersteuning. Wij zouden ook graag Sean Morrison te erkennen aan de UT Southwestern voor het oorspronkelijke protocol voor het kweken van ratten NC cellen. Dit werk werd ondersteund Vanderbilt University Medical Center Academisch programma Support en door subsidies van de NIH (HD36720 en HD036720-11S109) en de AHA 11GRNT7690040 op PAL, predoctorale beurzen van de AHA (0615209B) en NIH (NS065604) naar de NAM, en ERP was ondersteund door een NIH-subsidie ​​T32HD007502 training.

1. Voorbereiding van Platen <ol><li> Gebruik steriele techniek allen tijde. </li><li> Bereid fibronectine (FN) door verdunning 100 pl van menselijk plasma FN bouillon in een eindvolume van 3,3 ml in PBS van Dulbecco (DPBS). Uiteindelijke concentratie 30 pg / ml en kan worden bewaard bij 4 ° C gedurende 1 week. </li><li> Bedek bodem van elk putje van een steriele weefselkweek vier goed plaat met FN-oplossing en laten zitten voor 15 minuten. Zorg ervoor dat het hele oppervlak is bedekt. Merk media tijdens deze periode (stap 2 en 3). </li><li> Verwijder FN oplossing en laat platen drogen. Voorzichtig spoelen putten met 500 pL DMEM, verwijderen DMEM, en voeg 500 ul van Self-Renewal (SR) medium (zie hieronder). Incuberen bij 37 ° C in een bevochtigde incubator met 5 procent CO2. Vul dit ongeveer een uur vóór versnijding, zodat de platen droog voor gebruik. </li></ol> 2. Voorbereiden SR Medium <ol><li> Voor de cultuur van de vagale en romp NCvan tien embryo (ongeveer een nest, afhankelijk genetische achtergrond van de muis lijn), bereid 25 ml SR medium. Meng 12,5 ml laag glucose DMEM, 7,5 ml Neurobasal Medium 25 pi retinoïnezuur (117 uM eindconcentratie) en 25 pi 2-mercaptoethanol (50 mM eindconcentratie). Meng goed. </li><li> Voeg 3,75 ml Chick Embryo Extract, 250 ul N 2 extra zout, 500 pL B27 supplement en 250 ul penicilline-streptomycine (1% eindconcentratie). Filter het medium door een 0,22 pm filter. </li><li> Voeg 10 ul steriel IGF1 (20 ug / ml eindconcentratie) en 20 pi steriel bFGF (20 ug / ml eindconcentratie). Meng door het omkeren. Bewaar bij 4 ° C. </li></ol> 3. Voorbereiden Wash Medium <ol><li> Voor ongeveer 10 embryo&#39;s voor te bereiden 50 ml wassen medium. Combineer 50 mg BSA met 35 ml lage glucose DMEM, 15 ml Neurobasal Medium, en 500 ul penicilline-streptomycine (1% eindconcentratie). Steriel filter met een 0,22urn gefiltreerd. </li></ol> 4. Voorbereiden Collagenase / Dispase <ol><li> Voeg 50 pi van 100 mg / ml collagenase / Dispase tot 5 ml DPBS. Meng goed. </li><li> Spuit filter met een 0,2 um filter en 1,5 ml toe te voegen in elk van de drie putten van een twaalf goed plaat. Pipetteer ongeveer 1 ml wasmedium in de overige wells. Bewaar gehele plaat op ijs totdat u ze gaat ontleed weefsel verteren. </li><li> Snijd tips van een P20 en P1000 pipet filtertip met een steriel scheermesje. Juist onder de schuine rand van de tip. De afgesneden P1000 worden gebruikt om de gehele embryo dragen terwijl de p20 wordt gebruikt om stukjes geïsoleerde weefsel te brengen. </li></ol> 5. Isoleren Vagale en Trunk Neural Tube van 9,5 dpc embryo&#39;s <ol><li> Voor de timing van zwangerschappen, worden dammen met een vaginale plug beschouwd 0,5 dpc &#39;s middags&#39; s ochtends de stekker wordt waargenomen. Offer en verwijder de baarmoeder van 9,5 dpc. </li><li> Verwijder de decidua van baarmoeder en voorzichtig rchrap het embryo uit de decidua. Na ervaring met dit protocol, te isoleren 3-4 9.5 dpc embryo&#39;s op een moment in een steriele DPBS. Gebruik steriele techniek en gesteriliseerd dissectie-instrumenten. Instrumenten kunnen worden gesteriliseerd door autoclaveren, warmte sterilisatie of door incubatie in ethanol. </li><li> Voor anterior vagale NC: het gebruik van insuline naalden, snijd de neurale buis in het midden otic placode. Snijd weer op de achterste rand van het 4 e somiet. Trim weefsel ventraal van de neurale buis om de faryngeale bogen en het hart te verwijderen. </li><li> Voor de romp NC: het gebruik van insuline naalden, verwijder dan het gedeelte van de neurale buis tussen somieten 16 tot 22 (of de laatste somiet als embryo&#39;s op ontwikkelingsgebied ouder zijn dan de 22 somiet stadium). </li><li> Houd de dooierzak en de eventuele resterende embryonaal weefsel voor genotypering. </li></ol> 6. Verwijdering van niet-neurale ectoderm en mesoderm <ol><li> Plaats neurale buis met segmenten in collagenase / Dispase bij kamertemperatuur 10 minutens. Onmiddellijk in het wassen medium. </li><li> Keer terug weefsel tot steriele DPBS. Met behulp van steriele naalden insuline, verwijder voorzichtig de niet-neurale ectoderm uit het weefsel en scheid de somieten uit de buurt van de neurale buis. De laatste resterende delen van het mesoderm van somiet weefsel kan worden verwijderd door tritureren zachtjes met een cut-down P20 tip. Wees voorzichtig om geen schade aan de neurale buis. Observeer dit tijdens tritureren. </li><li> Plaats de geïsoleerde neurale buis door een tweede en derde 30 seconden wassen van het wasgoed medium. </li><li> Was eenmaal in SR medium, en plaats de geïsoleerde neurale buis in het midden van een FN-coating goed, dat eerder werd bereid (Stap 1.3). Dompel de hypoxie kamer met een schotel van steriel water. Plaats de schaal in de kamer hypoxie en spoel kamer met gasmengsel tot 3% O 2 (met een tank met een mengsel van 1% O 2, 6% CO2, 93% N2). </li><li> Ga altijd voorzichtig de kamer zeer zorgvuldig to tha zorgent explantaten geen storingen zijn en in het midden van de putten. </li><li> Incuberen bij 37 ° C. Samenvatting van de stappen 5-6 is weergegeven in figuur 1. </li></ol> 7. Verwijdering van de neurale buis <ol><li> Na 24 uur incubatie, verwijder de neurale buis door voorzichtig plagen de rand van de neurale buis uit de buurt van de migrerende cellen met behulp van een steriele naald insuline. Verwijder de neurale buis van het medium met een steriele p20 gesneden als in stap 6.2 en vervangen door het medium met vers SR medium (figuur 2). Dit wordt het gemakkelijkst uitgevoerd met een omgekeerde microscoop. </li></ol> 8. Representatieve resultaten Na 24 uur incubatie bij 37 ° C in hypoxische omstandigheden NC cellen gemigreerd van de neurale buis in een nagenoeg zuivere populatie (figuur 3a). Soms zal minder dan ideale culturen niet leveren robuuste uitwassen. Zo is het mogelijk dat na 24 uur tHij neurale buis zal hebben opgerold op zichzelf en het NC zal niet weg te stappen van de neurale buis (figuur 3b). Af en toe de neurale buis niet zal hechten aan de fibronectine gecoate platen. In onze ervaring, kunnen sub-optimale NC migratie of problemen met de bevestiging van de neurale buis nadelig beïnvloed worden door normoxia voorwaarden of concentratie van de fibronectine, respectievelijk. Enzymatische activiteit van de collagenase / Dispase verschilt enigszins per partij en de spijsvertering tijd moeten behoren afgesteld, echter niet verteren het weefsel langer dan vijftien minuten. Overdigestion van de neurale buis die weefsel in collagenase / Dispase zal ook leiden tot een onvoldoende uitwassen. Als somiet weefsel wordt niet gemakkelijk uit de neurale buis na incubatie in collagenase / Dispase, kan de neurale buis worden geïncubeerd langer dan tien minuten. Soms neurale buis niet aan op het substraat. Indien dit het geval is, controleert de fibronectin concentratie en de hypoxia. Hoewel normoxie kan worden cultuur wild-type NC, hypoxische omstandigheden nauwer na te bootsen de in vivo omgeving 29,30. Onze ervaring is dat hypoxische condities werd kritisch bij het kweken van mutant NC. Wanneer bijvoorbeeld Foxd3 mutant NC werden gekweekt in normoxie, romp NC had een sterk verminderde cel uitgroei in vergelijking met controles. Dit verschil in grootte uitgroei werd verwijderd toen de explantaten werden gekweekt in hypoxische omstandigheden (figuur 4). Bovendien, als wild-type neurale buis explantaten werden gekweekt in normoxia het aantal caspase-positieve cellen was groter dan die van soortgelijke explantaten gekweekt in hypoxie (gegevens niet getoond). Door het handhaven van alle NC cultuur in hypoxie, kunnen vergelijkingen gemakkelijker worden gemaakt tussen de dynamiek van controle en mutant culturen. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> <strong&gt; Figuur 1. In het algemeen schema van NC-isolatie. A) Prepareer gebieden van interesse van het embryo. B) Digest neurale buis in collagenase / Dispase tien minuten (niet meer dan vijftien minuten). C) Was in wassen medium. D) Prepareer weg van de niet-neurale ectoderm en mesoderm. EF) twee keer wassen in wassen medium. G) Plate bij zelfvernieuwing medium. Incuberen bij 37 ° C in 3% O 2 hypoxische omstandigheden. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Stapsgewijze het verwijderen van de neurale buis van explantaat. De neurale buis moet worden verwijderd na 24-48 uur om verontreiniging met niet-NC-cellen te voorkomen. A) Let op de grens tussen de neurale buis en de NC uitgroei (vaste lijn). B) Knip langs de rand van de neurale buis met een insuline naald. C) Gooi de neurale buis en vervang medium met vers zelfvernieuwing medium. Onderbroken lijn geeft de omvang van de uitgroei. Afkorting: NT, neurale buis. Figuur 3. Voorbeelden van representatieve resultaten. A) Typische explant uitgroei na 24 uur incubatie bij zelfvernieuwing medium in hypoxische omstandigheden (gestippelde lijn geeft de omvang van de uitgroei). B) Vergrote weergave van NC uitgroei na 48 uur in de cultuur. C) Minder ideale cultuur met een lage uitgroei opbrengst. A en C werden onder dezelfde omstandigheden. Afbeeldingen tonen het natuurlijke verspreidingsgebied in de cultuur robuustheid. Dit kan worden beïnvloed door de efficiëntie van de neurale buis isolatie, concentratie van het FN, hypoxische omstandigheden, en tijd in collagenase / Dispase ontsluitingen. <img src="/files/ftp_upload/4134/4134fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. In vitro analyses van NC explant culturen in normoxia ten opzichte van hypoxie. Control (wild-type) NC-cellen gemigreerd van neurale buis explantaten na 48 uur in normoxische kweekomstandigheden. Daarentegen Foxd3 mutantNC was sterk verminderd cel uitwassen in normoxia (rode contouren merk randen van de NC uitwassen). Bij vergelijkbare explantaten werden gekweekt onder hypoxische condities, Foxd3 mutant NC explantaten groeide vergelijkbaar met controles, waardoor latere analyses. Let op, dit gedrag goed gecorreleerd met het gedrag van Foxd3 mutant NC in vivo.

<ol><li>Le Douarin, N., Kalcheim, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLe+Douarin%2C+N+%22The+neural+crest%22">The neural crest</a>. , 2nd edn, Cambridge University Press. (1999).</li>
<li>Kulesa, P. M., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+migration%3A+patterns%2C+phases+and+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest migration: patterns, phases and signals.</a> Developmental biology. 344, 566-568 (2010).</li>
<li>Saint-Jeannet, J. -P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaint-Jeannet%2C+J-P+%22Neural+crest+induction+and+differentiation%22">Neural crest induction and differentiation</a>. , Springer Science+Business Media, Landes Bioscience/Eurekah.com. (2006).</li>
<li>Plank, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+and+timing+of+arrival+of+murine+neural+crest+on+pancreatic+beta+cell+development+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Influence and timing of arrival of murine neural crest on pancreatic beta cell development and maturation.</a> Developmental biology. 349, 321-330 (2011).</li>
<li>Nekrep, N., Wang, J., Miyatsuka, T., German, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signals+from+the+neural+crest+regulate+beta-cell+mass+in+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Signals from the neural crest regulate beta-cell mass in the pancreas.</a> Development. 135, 2151-2160 (2008).</li>
<li>Freem, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intrinsic+innervation+of+the+lung+is+derived+from+neural+crest+cells+as+shown+by+optical+projection+tomography+in+Wnt1-Cre%3BYFP+reporter+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">The intrinsic innervation of the lung is derived from neural crest cells as shown by optical projection tomography in Wnt1-Cre;YFP reporter mice.</a> J. Anat. 217, 651-664 (2010).</li>
<li>Cohen, A. M., Konigsberg, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+clonal+approach+to+the+problem+of+neural+crest+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A clonal approach to the problem of neural crest determination.</a> Developmental biology. 46, 262-280 (1975).</li>
<li>Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+quail+neural+crest+cells%3A+they+are+pluripotent+and+differentiate+in+vitro+in+the+absence+of+noncrest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of quail neural crest cells: they are pluripotent and differentiate in vitro in the absence of noncrest cells.</a> Developmental biology. 80, 96-106 (1980).</li>
<li>Baroffio, A., Dupin, E., Douarin, N. M. L. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+precursors+for+neural+and+mesectodermal+derivatives+in+the+cephalic+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Common precursors for neural and mesectodermal derivatives in the cephalic neural crest.</a> Development. 112, 301-305 (1991).</li>
<li>White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+stem+cells+undergo+cell-intrinsic+developmental+changes+in+sensitivity+to+instructive+differentiation+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neural crest stem cells undergo cell-intrinsic developmental changes in sensitivity to instructive differentiation signals.</a> Neuron. 29, 57-71 (2001).</li>
<li>Morrison, S. J., White, P. M., Zock, C., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification%2C+isolation+by+flow+cytometry%2C+and+in+vivo+self-renewal+of+multipotent+mammalian+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Prospective identification, isolation by flow cytometry, and in vivo self-renewal of multipotent mammalian neural crest stem cells.</a> Cell. 96, 737-749 (1999).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., Sieber-Blum, M., Cohen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+the+avian+neural+crest%3A+migration+and+maturation+of+mixed+neural+crest+clones+injected+into+host+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of the avian neural crest: migration and maturation of mixed neural crest clones injected into host chicken embryos.</a> J. Comp. Neurol. 193, 423-434 (1980).</li>
<li>Stemple, D. L., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+stem+cell+for+neurons+and+glia+from+the+mammalian+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest.</a> Cell. 71, 973-985 (1992).</li>
<li>Corpening, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+live+imaging+of+enteric+progenitors+based+on+Sox10-Histone2BVenus+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Isolation and live imaging of enteric progenitors based on Sox10-Histone2BVenus transgene expression.</a> Genesis. 49, 599-618 (2011).</li>
<li>Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. G., Miller, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skin-derived+precursors+%28SKPs%29+and+differentiation+and+enrichment+of+their+Schwann+cell+progeny%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny.</a> Nat. Protoc. 1, 2803-2812 (2006).</li>
<li>Chung, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+property+of+postmigratory+cranial+neural+crest+cells+and+their+utility+in+alveolar+bone+regeneration+and+tooth+development%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Stem cell property of postmigratory cranial neural crest cells and their utility in alveolar bone regeneration and tooth development.</a> Stem Cells. 27, 866-877 (2009).</li>
<li>Biernaskie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SKPs+derive+from+hair+follicle+precursors+and+exhibit+properties+of+adult+dermal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">SKPs derive from hair follicle precursors and exhibit properties of adult dermal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5, 610-623 (2009).</li>
<li>Hagedorn, L., Suter, U., Sommer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P0+and+PMP22+mark+a+multipotent+neural+crest-derived+cell+type+that+displays+community+effects+in+response+to+TGF-beta+family+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">P0 and PMP22 mark a multipotent neural crest-derived cell type that displays community effects in response to TGF-beta family factors.</a> Development. , 126-3781 (1999).</li>
<li>Heanue, T. A., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+and+isolation+of+enteric+nervous+system+progenitors+using+Sox2%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Prospective identification and isolation of enteric nervous system progenitors using Sox2.</a> Stem Cells. 29, 128-140 (2011).</li>
<li>Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+in+reduced+levels+of+oxygen+promotes+clonogenic+sympathoadrenal+differentiation+by+isolated+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Culture in reduced levels of oxygen promotes clonogenic sympathoadrenal differentiation by isolated neural crest stem cells.</a> J. Neurosci. 20, 7370-7376 (2000).</li>
<li>Ito, K., Morita, T., Sieber-Blum, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+clonal+analysis+of+mouse+neural+crest+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">In vitro clonal analysis of mouse neural crest development.</a> Developmental biology. 157, 517-525 (1993).</li>
<li>Etchevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+chick%2C+mouse+or+human+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells.</a> Nat. Protoc. 6, 1568-1577 (2011).</li>
<li>Mundell, N. A., Labosky, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+stem+cell+multipotency+requires+Foxd3+to+maintain+neural+potential+and+repress+mesenchymal+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest stem cell multipotency requires Foxd3 to maintain neural potential and repress mesenchymal fates.</a> Development. 138, 641-652 (2011).</li>
<li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Gu, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidance+of+trunk+neural+crest+migration+requires+neuropilin+2%2Fsemaphorin+3F+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Guidance of trunk neural crest migration requires neuropilin 2/semaphorin 3F signaling.</a> Development. 133, 99-106 (2006).</li>
<li>Gammill, L. S., Gonzalez, C., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+2%2Fsemaphorin+3F+signaling+is+essential+for+cranial+neural+crest+migration+and+trigeminal+ganglion+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 2/semaphorin 3F signaling is essential for cranial neural crest migration and trigeminal ganglion condensation.</a> Dev. Neurobiol. 67, 47-56 (2007).</li>
<li>Kasemeier-Kulesa, J. C., Bradley, R., Pasquale, E. B., Lefcort, F., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eph%2Fephrins+and+N-cadherin+coordinate+to+control+the+pattern+of+sympathetic+ganglia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Eph/ephrins and N-cadherin coordinate to control the pattern of sympathetic ganglia.</a> Development. 133, 4839-4847 (2006).</li>
<li>Osborne, N. J., Begbie, J., Chilton, J. K., Schmidt, H., Eickholt, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin%2Fneuropilin+signaling+influences+the+positioning+of+migratory+neural+crest+cells+within+the+hindbrain+region+of+the+the+chick%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Semaphorin/neuropilin signaling influences the positioning of migratory neural crest cells within the hindbrain region of the the chick.</a> Dev. Dyn. 232, 939-949 (2005).</li>
<li>Schwarz, Q., Maden, C. H., Vieira, J. M., Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+1+signaling+guides+neural+crest+cells+to+coordinate+pathway+choice+with+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 1 signaling guides neural crest cells to coordinate pathway choice with cell specification.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6164-6169 (2009).</li>
<li>Simon, M. C., Keith, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxygen+availability+in+embryonic+development+and+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of oxygen availability in embryonic development and stem cell function.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 285-296 (2008).</li>
<li>Ivanovic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+or+in+situ+normoxia%3A+The+stem+cell+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm.</a> J. Cell Physiol. 219, 271-275 (2009).</li>
</ol>

Wij hebben niets te onthullen.

Zorgvuldige aandacht moet worden besteed aan het ontwikkelingsstadium van het embryo aan het succes van deze aanpak te garanderen. Tellen somieten van de vroege muizenembryo&#39;s is van cruciaal belang voor zowel het podium bijpassende embryo&#39;s in een nest en het bepalen van de juiste regio&#39;s van de neurale buis voor isolatie. Een variatie van een of twee somieten tussen embryo binnen een redelijk aantal ontwikkelingstiming, afhankelijk van de resolutie van de uitgevoerde experimenten. Een embryo tussen 9 en 9,...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> DMEM (lage glucose) </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11885 </td><td></td></tr><tr><td> Neurobasal Medium </td><td> Gibco </td><td> 21103 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A3912-10G </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Gibco </td><td> 14190-144 </td><td></td></tr><tr><td> IGF-1 </td><td> BD Biosciences </td><td> 354037 </td><td> Winkel in 50 ug / ml fracties bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> BD Biosciences </td><td> 354060 </td><td> Winkel in 25 ug / ml fracties bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> Fibronectine </td><td> Gibco </td><td> 33016-015 </td><td> Opgeslagen in 1mg/ml aliquots bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> Retinoïnezuur </td><td> Sigma </td><td> R2625 </td><td> Winkel in 35 ug / ml monsters na bereiding in ethanol bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> 2-mercaptoethanol </td><td> Sigma </td><td> D-5637 </td><td></td></tr><tr><td> N 2 supplement </td><td> Gibco </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> B27 supplement </td><td> Gibco </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Steriflip 0,22 pm filters </td><td> Millipore </td><td> SCGP00525 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Invitrogen </td><td> 15140122 </td><td></td></tr><tr><td> 0,20 micrometer filters </td><td> Corning </td><td> 431219 </td><td></td></tr><tr><td> Spuiten (voor filtratie) </td><td> BD Biosciences </td><td> 301604 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Vier putjes </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> 176740 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase / Dispase </td><td> Roche </td><td> 269 ​​638 </td><td> Activiteit verschilt per partij. Winkel in 100 mg / ml fracties bij -20 ° C. </td></tr><tr><td> Insuline naalden (29 ½ gage) </td><td> Becton Dickson </td><td> 309306 </td><td></td></tr><tr><td> Hypoxie Kamer </td><td> Billups-Rothenberg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oxygen Analyzer </td><td> Billups-Rothenberg </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Pincetten # 5 </td><td> Fine Science Tools </td><td></td><td> Voor het verwijderen van baarmoeder en de decidua. </td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA (0,25%) </td><td> Gibco </td><td> 25200 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie en cultuur van neurale lijst cellen van embryonale murine neural tube

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

De embryonale neurale lijst (NC) is een multipotente voorlopercellen bevolking die afkomstig zijn van de dorsale aspect van de neurale buis, ondergaat een epitheliale naar mesenchymale transitie (EMT) en migreert in het embryo, die aanleiding geven tot verschillende celtypen 1-3. NC heeft ook de unieke mogelijkheid om de differentiatie en rijping van de doelorganen 4-6 te beïnvloeden. Wanneer geëxplanteerd in vitro, NC voorouders zelfvernieuwing ondergaan, migreren en differentiëren in een verscheidenheid van het weefsel vormen, met inbegrip neuronen, glia, gladde spiercellen, kraakbeen en bot. NC multipotent werd voor het eerst beschreven vanuit explantaten van de aviaire neurale buis 7-9. In vitro isolatie van NC cellen vergemakkelijkt de studie van de NC-dynamiek met inbegrip van proliferatie, migratie en multipotent. Verdere werkzaamheden in de vogelgriep en ratten hebben aangetoond dat geëxplanteerd NC cellen hun NC potentieel behouden wanneer weer getransplanteerd in het embryo 10-13. Omdat deze inherente cellulaire eigenschappen zijn bewaard gebleven in geëxplanteerd NC voorouders, de neurale buis explant test biedt een aantrekkelijke optie voor het bestuderen van de NC in vitro. Om een ​​beter begrip van de zoogdieren NC te realiseren, hebben vele methoden zijn gebruikt om NC bevolking te isoleren. NC-afgeleide voorlopercellen kan gekweekt worden uit post-trekkende locaties in zowel het embryo en volwassenen om de dynamiek van de post-trekkende NC voorouders 11,14-20 te bestuderen, maar de isolatie van NC voorouders als ze emigreren van de neurale buis zorgt voor een optimale bewaring van NC cel potentieel en trekkende eigenschappen 13,21,22. Sommige protocollen gebruiken fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) een NC populatie verrijkt bijzonder voorlopers 11,13,14,17 isoleren. Echter, bij de start met een vroeg stadium embryo&#39;s celaantallen geschikt voor analyse moeilijk te verkrijgen met FACS bemoeilijkt de isolatie van de eerste NC populations van individuele embryo&#39;s. Hier beschrijven we een benadering die niet op de FACS en de resultaten vertrouwen in een ongeveer 96% zuiver NC bevolking op basis van een Wnt1-Cre geactiveerde lijn reporter 23. De methode hier gepresenteerde is een bewerking van protocollen geoptimaliseerd voor de cultuur van de rat NC 11,13. De voordelen van dit protocol dan eerdere methoden zijn dat 1) de cellen niet gekweekt op een voedingsbodem, 2) FACS is niet vereist om een ​​relatief zuivere NC populatie, 3 verkrijgen) premigratory NC cellen geïsoleerd en 4) verloopt gemakkelijk worden gekwantificeerd. Bovendien kan dit protocol worden gebruikt voor de isolatie van NC van een mutant muismodel de studie van het NC eigenschappen met verschillende genetische manipulaties. De beperking van deze benadering is dat de NC wordt verwijderd uit de context van de embryo, waarvan bekend is dat de overleving migratie en differentiatie van de NC 2,24-28 beïnvloeden.

Isolatie van embryonale neurale lijst van de neurale buis vergemakkelijkt het gebruik van<em&gt; In vitro</em&gt; Methoden voor het bestuderen van migratie, zelfvernieuwing en multipotent van de neurale lijst.

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

De embryonale neurale kam (NC) is een multipotente progenitorpopulatie die ontstaat aan de dorsale zijde van de neurale buis en een epitheliale-naar...

Reserveer drie uur voor het uitvoeren van dit protocol. Zodra u ervaren bent, zou dit protocol tussen anderhalf en twee uur in beslag moeten nemen, afhankelijk van het aantal gedissekeerde embryo's. Dit protocol beschrijft hoe u een snede maakt in een embryo van 9,5 dagen post coitum ter hoogte van de mid-otische plaque en somiet vier om weefsel te isoleren dat de vagale neurale buis bevat. Snijden.Op de tijdstippen 16 en 22 wordt weefsel geïsoleerd dat de neurale buis van de romp bevat. Vagale neurale kamcellen migreren vanuit de vagale neurale buis. Terwijl de neurale kamcellen van de romp vanuit de neurale buis van de romp migreren, wordt het gedissecteerde weefsel enzymatisch verteerd in een oplossing van collagenase, gewassen, en wordt het niet-neurale ectoderm en mesoderm weggedisseceerd.De geïsoleerde neurale buis wordt nog tweemaal gewassen en vervolgens geplaatst in zelfvernieuwingsmedium. Ik ben Elise Graph van het Bosky Laboratory aan Vanderbilt University. Vandaag zal ik demonstreren hoe de neurale kam uit de neurale buis in een explantaatkweek kan worden geïsoleerd.Met deze techniek kunt u de kenmerken van de neurale lijst in vitro bestuderen. Laten we beginnen. Begin

isolation-culture-neural-crest-cells-from-embryonic-murine-neural

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Deze video beschrijft de methode die wordt gebruikt voor het isoleren van neuroprecursors uit de ontwikkelingslanden cortex van embryonale muizen. De procedure voor het verwijderen van embryo's uit de baarmoeder, het ontleden van de corticale weefsel, en verteren de geïsoleerde cerebrale cortex wordt weergegeven.

Cultuur van Mouse Neurale Stem Cell Voorlopers

Hier laten we onze methode om de muis epidermale neurale stamcellen (EPI-NCSC) te isoleren. Techniek houdt in micro-ontleden whisker follikels, het isoleren van de verdikking en placeing het in weefselkweek. EPI-NCSC beginnen om van uitstulping explantaten op de ondergrond emigreren binnen 3 - 4 dagen.

Muis Epidermale neurale lijst Stem Cell (EPI-NCSC) culturen

Om neurale lijst stamcellen (NCSC) kweken in vitro, is een speciaal medium (NCSCM) vereist. Essentieel onderdeel van NCSCM is kippenembryo extract (CEE). We beschrijven hier accurate technieken om een ​​maximale hoeveelheid van pure en hoge kwaliteit CEE, inclusief details zoals de isolatie, maceratie, centrifugeren en filtratie processen te produceren.

Productie van Chick Embryo Extract voor de teelt van Muizen neurale lijst Stem Cells

Dit artikel presenteert een robuuste protocol voor isolatie en kweek van neurale stamcellen uit menselijke haarzakjes.

Isolatie en Cultuur van neurale stamcellen uit menselijke haarzakjes

This video illustrates a technique for isolating cranial neural folds from the midbrain region of chick embryos. It presents a detailed dissection process of the neural folds, their placement, and attachment on fibronectin-coated coverslips, followed by the observation of neural crest cell migration from the neural folds.

Isolating Cranial Neural Folds From a Chick Embryo for a Neural Crest Cell Culture

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor het gelijktijdig opwekken van neurale precursoren celculturen, hetzij als hechtende monolagen of neurosferen, uit de subventriculaire zone en dentate gyrus van individuele volwassen muizen.

Een muis, twee culturen: Isolatie en Cultuur van adulte neurale stamcellen uit de Twee Neurogeen Zones van individuele muizen

Hier introduceren wij een nieuwe microchirurgische techniek voor de isolatie van neurale stamcellen uit de E13 muis embryo ganglionaire eminentie.

Isolatie en cultuur van muis embryonale neurale stamcellen

Dit protocol beschrijft de dissectie en de cultuur van craniale neurale Crest cellen van muismodellen, voornamelijk voor de studie van de Celmigratie. We beschrijven de gebruikte technieken voor Live Imaging en de analyse van veranderingen in snelheid en celvorm.

Dissectie, cultuur en analyse van primaire Cranial neurale Crest cellen van de muis voor de studie van neurale Crest Celdelaminatie en migratie

Dit veelzijdige protocol beschrijft de isolatie van premigratory neural crest cells (NCC's) door de excisie van craniale neurale plooien van kuikenembryo's. Bij plating en incubatie komen migrerende NCC's tevoorschijn uit neurale vouwexplantaten, waardoor celmorfologie en migratie in een vereenvoudigde 2D-omgeving kunnen worden beoordeeld.

Voorbereiding en morfologische analyse van Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

Dit protocol schetst een in vitro migratie-experiment dat geschikt is voor de functionele analyse van de moleculen die betrokken zijn bij de in vivo migratie van neurale topcellen naar de hyaluronrijke extracellulaire matrix.

In vitro Onderzoek naar de effecten van de hyaluronaatrijke extracellulaire matrix op neurale topcelmigratie

We presenteren een driedimensionaal (3D) in vitro differentiatieprotocol dat neurosferen van reproduceerbare grootte genereert om craniale neurale lijstcellen te produceren uit embryonale stamcellen van muizen. We laten zien dat deze methodologie de variabiliteit vermindert in vergelijking met eerdere protocollen en hoe deze kan worden gebruikt voor multiplexed assay om de ontwikkeling van craniale neurale lijstcellen te bestuderen.

Het craniale Neurale Protocol van de Lijstcellen Driedimensionaal in vitro Differentiatie voor Gemultiplexte Analyse

Leer neurale lijstcellen isoleren en kweken uit embryonale muizenneurale buis zonder FACS of feederlagen. Deze methode levert 96% zuivere premigratoire cellen op voor ontwikkelingsbiologisch onderzoek.

Isolatie en Cultuur van neurale lijst cellen van embryonale Murine Neural Tube

Meer video's verkennen