Name: Muis Islet van Langerhans Isolatie met behulp van een combinatie van Gezuiverde Collagenase en neutraal protease (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Leer een geoptimaliseerde methode voor het isoleren van eilandjes van Langerhans uit de muis alvleesklier met behulp van gezuiverde collageenase en neutrale protease. Deze techniek verbetert de opbrengst en morfologie en vermindert variabiliteit tussen batches.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door NIH subsidie ​​R01 DK060581, R01 DK083583 (zowel voor RGM).

A. Benodigde materialen: zie tabel 1 (reagentia) voor de bereiding <ol><li> HBSS (P / S) 100 ml 10X HBSS + 900 ml H 2 0 + 1% penicilline / streptomycine (opgeslagen in de koelkast bewaard op ijs). </li><li> 20% BSA stock wordt in water en in porties verdeeld en bewaard bij -20 ° C. </li><li> HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml 20% BSA (BSA uiteindelijke concentratie 0,3%) </li><li> Islet medium: RPMI + 10% FBS + 1% glutamine + 1% penicilline / streptomycine </li><li> Histopaque 1100: 240 ml 1119 Histopaque + 200 ml 1077 Histopaque </li><li> 4-0 Suture (McKesson): gesneden in 2 ¾ inch stukjes en opgeslagen in een 10 cm Petrischaal </li><li> Instrumenten: Buig de tang van Fine Science Tools tot 90 °, en vijl langs de gekartelde tanden van alle drie paar van de tang. Het doel is om saai de tanden, niet om ze te verwijderen. </li><li> Canule voor toediening van collagenase / protease mengsel: 27G ½ inch naald, 30 ½ inchnaald, PE50 leidingen gesneden in 12 inch stukken. Bestand beide naalden tot een gladde afgeronde einde dat geen scherpe randen heeft. Steek de 27G naald in het ene uiteinde van een 12 inch stuk PE50 leidingen. Verwijder de 30G naald uit de behuizing door het inslaan van de behuizing met een tang, het draaien van de behuizing ¼ draai per keer. Verwijder de naald met de tang uit de behuizing en plaats deze in het andere uiteinde van de buis PE50 onder een dissectie microscoop. Zorg ervoor dat u geen knikken in de slang als je de naald in de PE50 slang. De 27G naald is het einde dat u de spuit van collagenase hechten. </li><li> Collagenase (CI zyme MA) en neutraal protease (CI zyme BP). Reconstitueer de TDE volgens de instructies van de fabrikant. Raadpleeg de veel specifieke Analysecertificaat om de enzymactiviteit concentratie te berekenen. Breng een totaal van 350.000 collageen afbrekende activiteit (CDA) eenheden van de gereconstitueerde collagenase en 100.000 neutraal protease eenheden van de reconstitdeeld BP Protease in een conische buis en verdund tot 15 ml totaal in HBSS (P / S) </li></ol> B. Stap-voor-stap protocol 1. De inflatie van de alvleesklier met collagenase / Protease Mengsel <ol><li> Euthanaseren de muis door cervicale dislocatie, verzadigen de muis torso met 70% EtOH, open buikholte volledig uit anus te membraan met een dissectie schaar en pincet. </li><li> Plaats de muis op het platform van een dissectie microscoop. </li><li> Trek het caecum en colon ascendens uit en zet ze buiten het lichaam holte aan uw linkerhand. Zie figuur 1 voor een overzicht van de volgende stappen. </li><li> Plaats de lobben van de lever tegen het membraan, en moet er blijven als de lichaamsholte ver genoeg geopend. Vind de leverslagader, poortader en galgang bundel die naar de lever door het vastgrijpen van de twaalfvingerige darm met gebogen tang. Met een paar gebogen forceps, handen onder de slagader, ader en kanaal bundle en trek een 2 ¾ inch stuk van 4-0 hechtdraad onder de slagader, ader, galgang en een keer bind het en trek deze strak zo dicht mogelijk bij de lever mogelijk te maken. </li><li> Gebruik van twee paar gebogen forceps voorzichtig pak de duodenum en vindt de galbuis aan de twaalfvingerige darm in de papil. Gebruik een tang van de tang te porren door de alvleesklier en het bindweefsel vlak onder de galwegen in de buurt van de papil. Snel Poke uw pincet door het orgaan van een gat te maken en zet beide tangen van een tang door en pak nog eens 2 ¾ inch stuk van 4-0 hechtdraad door en bind het een keer en trek hem naar een kleine cirkel, maar trek dan niet strak. </li><li> Ga naar de 90 ° forceps en de Superfine Vannas schaar. Met de 90 ° tang voorzichtig knijpen en trek de dunne darm tot de galwegen strak staat. Maak een horizontale snede over de papil met de schaar door steken de open schaar in de darm en dan snijden met een beweging. Probeer alleen one dwars door de papil zonder loskomen van de galwegen van de papil. </li><li> Terwijl u de darm van de 90 ° forceps, de canule op te voegen in de galbuis aan de halve lengte van de galwegen, en trek de hechtdraad strak om de canule. </li><li> Vul een 3 ml spuit met 2,0 ml collagenase / protease mengsel en injecteren in de canule langzaam en constant tempo. </li><li> Na het opblazen van de alvleesklier is voltooid, verwijdert de canule uit galwegen en het gebruik van de gebogen tang en gebogen veer schaar om de opgeblazen alvleesklier te verwijderen door te beginnen bij de colon descendens en knippen het bindweefsel als je trek de darmen omhoog. Blijf de alvleesklier te verwijderen uit de darmen tot aan de galwegen, verwijder vervolgens de alvleesklier van de milt, dan is de maag en vervolgens van de ingewanden van de buikholte. Eindig het verwijderen van door knippen weg de hechtingen. Voeg de pancreas een 50 ml buis met 5 ml HBSS(P / S). Deze buis moet op ijs. </li><li> Herhaal de procedure hierboven voor elk dier tot vier dieren. Voor een optimaal resultaat, dissociëren slechts vier pancreata in een keer. Typisch, terwijl de eerste vier in de 37 ° C waterbad we opgeblazen eens vier pancreata. </li></ol> 2. Pancreas Dissociatie <ol><li> Plaats de 50 ml buisjes met de pancreata in een 37 ° C waterbad gedurende 15 minuten. </li><li> Schud de buis en controleer weefsel dissociatie, lees dan zeker weefsel komt gemakkelijk uit elkaar, dan wervelen de buizen 12 keer terwijl u houden van de buis door het deksel. </li><li> Voeg niet meer dan 30 ml HBSS (BSA) (dit kan een kleinere hoeveelheid zijn, afhankelijk van hoeveel moet de buizen balans voor de centrifugestap) en centrifugeer bij 290 xg gedurende een min. </li><li> Zorgvuldig aspireren supernatant en laat een kleine hoeveelheid supernatant (2-3 ml) onder om zo niet de cel pellet te verstoren. </li><li> Met behulp van een 30 ml spuit attached tot 14G naald, voeg niet meer dan 10 ml HBSS (BSA) en zuig de suspensie op en neer 2 keer. </li><li> Filtreer het mengsel door een cel plastic theezeefje in een 50 ml buis en spoelen met nog eens 10 ml HBSS (BSA). </li><li> Centrifugeer bij 330 xg gedurende 2 minuten. </li><li> Decanteer supernatant en omkeren buizen uitlekken op een absorberende papieren handdoek gedurende 1 min. </li><li> Resuspendeer elke buis in 10 ml koud 1100 Histopaque. </li><li> Bedekken de Histopaque met 10 ml HBSS (BSA) en centrifugeer bij 900 xg gedurende 18 min. </li><li> Verwijder de gehele 20 ml van de bovenstaande met behulp van een grote boring 25 ml pipet en laat de bovenstaande vloeistof op een omgekeerde 70 pm filter. </li><li> Spoel de eilandjes in een 10 cm Petrischaal door pipetteren 10 ml eilandje media door het filter terwijl u hem rechtop over het gerecht. </li><li> Cultuur de eilandjes in een 37 ° C, 5% CO2 weefselcultuurincubator tot aan experimenten. Typisch, worden eilandjes met de hand geplukt en voorafgaand aan de expertise geteldimentation. </li></ol> 3. Representatieve resultaten Islet opbrengsten, morfologie, en kwaliteit zijn de algemene parameters die worden gebruikt om het succes van eilandje isolatie te beoordelen. In onze handen eilandje opbrengst van de gemiddelde C57BL / 6 muis in het bereik van 150-250 eilandjes met dit protocol (zie tabel 2) en vergelijkbaar gegevens verkregen met geoptimaliseerde Sigma type XI collagenase. Echter kunnen de opbrengsten variëren afhankelijk van de gebruikte muizenstam en de leeftijd van de muis. De meeste dieren we gebruiken zijn in de week 8-16 leeftijd Dit protocol is getest op meerdere muizenstammen, waaronder C57BL / 6 (180-250 eilandjes / muis), CD1 (200-300 eilandjes / muis), 129 / B6 (200-300 eilandjes / muis), BLKS-db/db (120-200 eilandjes / muis), NOD (10 weken oud, 100-150 eilandjes / muis) en NOD-SCID (100-150 eilandjes / muis ). Typische eilandje morfologie weergegeven in figuur 2, waarin eilandjes een ronde vorm te langwerpig met relatief uniforme grootte (hoewel size uniformity kan variëren van stam tot) stam. Figuur 3 toont onze typische analyse van glucose-gestimuleerde insulinesecretie uit C57BL / 6 muizen die eilandjes met gezuiverd TDes vs Sigma type XI collagenase. Typisch een hoge kwaliteit eilandje preparaat resulteert in een insulinestimulatie bij 25 mM glucose die 6-20 maal groter dan waargenomen bij 2,5 mM glucose. Andere toepassingen kunnen ook worden gebruikt om de kwaliteit van geïsoleerde eilandjes testen en deze omvatten het gebruik van technieken perifusion, Ca 2 + imaging (met fura2) en reverse-transcriptie PCR, onder anderen 11. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Een samenvatting van de canulatie van de galwegen. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Typisch uiterlijk van C57BL / 6 eilandjes op 24 uur na isolatie. Beelden werden verkregen op een inomgezet microscoop bij 40X vergroting. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Glucose-gestimuleerde insuline secretie van C57BL / 6 eilandjes. Na 24 uur na isolatie werden 100 eilandjes geïncubeerd in een 12-well schaal 1 uur bij 37 ° C in Krebs-Ringer-HEPES gebufferde oplossing die 2,5 mM glucose. Eilandjes werden vervolgens overgebracht naar Krebs-Ringer HEPES bij 2,5 mM glucose tegen uur, waarna de supernatant werd verzameld voor insuline meting met een twee-site immuunkleuring enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Crystal Chem). Dezelfde eilandjes werden vervolgens overgebracht naar Krebs-Ringer-HEPES gebufferde oplossing die 25 mM glucose en insuline in het medium werd gemeten door ELISA na 1 uur incubatie.

<ol><li>Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Liang, Q. -L., Dai, L. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255(2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).</li>
<li>Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience+of+islet+isolation+without+neutral+protease+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Experience of islet isolation without neutral protease supplementation.</a> Islets. 2, 278-282 (2010).</li>
<li>Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+purified+tissue+dissociation+enzyme+mixtures+for+human+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation.</a> Cell Transplant. , Forthcoming (2012).</li>
<li>McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+collagen+degradation+assay+to+assess+purified+collagenase+used+in+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation.</a> Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).</li>
<li>Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+pancreatic+ductal+collagenase+injection+for+isolation+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets.</a> Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).</li>
<li>Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+in+islet+yield+from+a+cold-preserved+pancreas+by+pancreatic+ductal+collagenase+distention+at+the+time+of+harvesting%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting.</a> Transplantation. 51, 566-570 (1991).</li>
<li>McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopaque+provides+optimal+mouse+islet+purification+kinetics%3A+comparison+study+with+Ficoll%2C+iodixanol+and+dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran.</a> Islets. 3, 144-149 (2011).</li>
<li>Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+dissociation+enzyme+neutral+protease+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment.</a> Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).</li>
<li>Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPAR-%7Bgamma%7D+Activation+Restores+Islet+Function+in+Diabetic+Mice+Through+Reduction+of+ER+Stress+and+Maintenance+of+Euchromatin+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).</li>
</ol>

NDS, SAT, en RGM hebben niets te onthullen. Auteur AGB is in dienst van VitaCyte. Auteur RCM heeft een eigendomsbelang in VitaCyte.

In dit protocol hebben we onze procedure beschreven voor de canules, collagenase perfusie en dissociatie van de muizen pancreas, met als doel het isoleren van de eilandjes van Langerhans. Technisch onze methode eenmaal beheerst, dienen van pancreas isolatie binnen 4 min van euthanasie de dieren en op 1 uur moet leiden tot de isolatie van eilandjes van een dier. De snelheid van de techniek kunnen we isoleren van eilandjes tot 12 muizen in een typisch stuk, hetgeen resulteert in de isolatie tot 3.000 eilandjes. In tegenstelling tot andere protocollen die ruwe preparaten van collagenase gebruiken ons protocol biedt het gebruik van gezuiverde proteasen, CI zyme Collagenase MA en CI zyme BP Protease. Variaties in de samenhang van TDE preparaten die in de handel verkrijgbaar is dat elke partij afzonderlijk worden getest en geoptimaliseerd voor algemeen gebruik. Dit lot-to-lot variabiliteit leidde ons naar het gebruik van puri overwegenceerde TDES van VitaCyte. Deze sterk gezuiverde TDes worden gekenmerkt door verschillende methoden met inbegrip van het gebruik van gevoelige fluorescentie gemerkt substraat assays. De fluorescentie CDA assay is gevoelig voor verschillende moleculaire vormen van collagenase dat verschillende kinetiek in verval natief collageen. Historische peptidesubstraat testen leveren een onvolledige beoordeling van de collagenase. Kenmerkend collagenase door meerdere methoden zorgt voor een grotere enzymactiviteit tussen partijen. Gebaseerd op onze eigen test met verschillende collagenase commercieel verkrijgbare preparaten, bleek dat het gezuiverde enzym combinaties reproduceerbaar lot-tot-lot resultaten opgeleverd. De belangrijkste voordelen van het gebruik van zeer zuiver en streng gekenmerkt TDES in deze toepassing worden eenmaal de optimale enzymsamenstelling is gedefinieerd, wordt het lot-to-lot prestaties consistentie verzekerd. Deze consistentie elimineert de arbeidsintensieve proces van veel kwalificatie vereist bij normaal gebruikvoor ruwe of verrijkte collagenase producten. Gezuiverd TDes ook een extra modificaties van de samenstelling om de opbrengst en kwaliteit van eilandjes teruggewonnen uit verschillende muizenstammen verbeteren. Rapportage optimale enzymsamenstellingen voor isolatie van eilandjes van verschillende muizenstammen kunnen veel effectiever gecommuniceerd. Dit op zijn beurt leidt tot beter gebruik van middelen en verbeterde flexibiliteit in proefopzet. Er zijn vele kritische stappen dat het resultaat van gebruik van onze eilandje isolaties protocol kunnen beïnvloeden. De eerste is de noodzaak effectieve opblazen van de pancreas die gedurende de perfusie van het enzympreparaat. Het is belangrijk om inflatie te beginnen met zachte kracht op de spuit en de kracht als de pancreas opgeblazen verhogen. Het is nuttig om de darmen te verplaatsen en de alvleesklier te tillen tijdens het opblazen zodat de collagenase perfuses het gehele orgaan. Een andere belangrijke stap is de kracht waarmee men schudt de buizen after incubatie bij 37 ° C (Stap 2.2). We hebben gevonden dat de pancreas schudden hard tegen de schroefdop fragmentatie van eilandjes veroorzaakt, maar zonder enige vorm van mechanische dissociatie tijdens deze stap eilandje opbrengst kan aanzienlijk dalen. Het is ook noodzakelijk dat tijdens de dissociatiestap met de spuit (stap 2,5), een middel-kracht wordt uitgeoefend tijdens de op en neer beweging van de plunjer, hetgeen zorgt voor voldoende weefsel dissociatie voor de filtratiestap (2,6), waar weinig weefsel moet worden bewaard op het theezeefje filter. Ten slotte is de laatste stap zorgvuldig volgen is het streven van de gehele 20 ml van het Histopaque gefractioneerde eilandjes. Hoewel eilandjes zijn meestal op het grensvlak van de Histopaque en HBSS, hebben we ontdekt dat we eilandjes te verliezen wanneer we proberen om alleen de interface te verwijderen, in plaats daarvan hebben we nu verwijderen van de hele 20 ml met behulp van een grote boring 25 ml pipet. We hebben de filtratie door de omgekeerde 70 urn filter (stap 2.11) aan de noodzaak om cherhaaldelijk entrifuge de eilandjes weg te wassen de Histopaque.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van de Reagens </td><td> Vennootschap </td><td></td><td> Catalogus # </td></tr><tr><td> 10X HBSS </td><td> Life Technologies </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10 tot 040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> een </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 Suture 100 m rol </td><td> McKesson </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> 14 g stomp uiteinde naald </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Vannas Superfine schare </td><td> Fisher Scientific </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Gebogen Spring Schaar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> Gebogen tang (2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> Gebogen pincet (voor 90 °) </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2 inch naald </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> 30G 1/2 inch naald </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> PE buis </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase MA </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP Protease </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml spuit </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml spuit </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 urn filter </td><td> Fisher Scientific </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 cm 2 Petrischaal </td><td> Fisher Scientific </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Plastic theezeefje </td><td> Elke keuken levering </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 1. Reagentia en apparatuur </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510"><tbody><tr><td> Sigma type XI (L010M8618) </td><td> MA (100615) BP (110,329) </td><td> MA (081104) BP (100,823) </td><td> MA (091211) BP (101109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 2. Gemiddelde eilandje opbrengst (± SD) met behulp van verschillende TDE veel * * Gegevens zijn gemiddelde islet opbrengst van ten minste 10 muizen. Lot getallen tussen haakjes </td></tr></tbody></table>

muis islet van langerhans isolatie met behulp van een combinatie van gezuiverde collagenase en neutraal protease

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Ondervraging van beta genexpressie en functie in vitro is vierkant verschoven over de jaren de studie van knaagdieren tumorigene cellijnen de studie van geïsoleerde eilandjes knaagdieren. Primaire eilandjes bieden het onmiskenbare voordeel dat ze meer getrouw de biologie van intracellulaire signaalwegen en secretoire respons te geven. Dat de werkwijze eilandje isolatie met behulp van tissue dissociëren enzym (TDE) preparaten is goed vastgesteld in vele laboratoria 1-4, variaties in de consistentie van eilandje opbrengst en kwaliteit van een bepaalde stam knaagdier de draagwijdte en de haalbaarheid van primaire eilandje studies. Deze variaties vaak optreden als gevolg van de ruwe gedeeltelijk gezuiverde TDES in de isolatieprocedure eilandje; TDes vertonen vaak veel te veel verschillen in activiteit en vaak aanpassingen van de dosering enzym. Een klein aantal rapporten hebben gebruikt gezuiverd TDES voor knaagdieren cel isolaties 5, 6 </sup&gt;, maar de praktijk is niet wijdverspreid, ondanks het routinematig gebruik en de voordelen van gezuiverd TDES voor menselijke eilandje isolaties. In samenwerking met VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN), ontwikkelden we een gemodificeerde muis eilandje isolatie protocol gebaseerd op die beschreven door Gotoh 7, 8, waarbij de TDes rechtstreeks geperfuseerd in de ductus pancreaticus van muizen, gevolgd door ruwe tissue fractionering door een Histopaque gradiënt 9 en isolatie van gezuiverd eilandjes. Een significant verschil in ons protocol is het gebruik van gezuiverd collagenase (CI zyme MA) en neutraal protease (CI zyme BP) combinatie. De collagenase werd gekenmerkt door het gebruik van een 6 fluorescentie collageen afbrekende activiteit (CDA) assay die fluorescent gelabeld oplosbaar kalfshuid vezels als substraat 6 gebruikt. Dit substraat is voorspellend de kinetiek van collageenafbraak in de weefselmatrix omdat het berust op natief collageen als substraat. De protease was laracterized met een gevoelige fluorescente kinetische test 10. Gebruik te maken van deze verbeterde testen, samen met meer traditionele biochemische analyse mogelijk te maken van de TDE om meer consistent worden vervaardigd, wat leidt tot betere prestaties consistentie tussen partijen. De hierin beschreven protocol werd geoptimaliseerd voor maximale opbrengst en optimale islet islet morfologie met C57BL / 6 muizen. Tijdens de ontwikkeling van dit protocol werden verschillende combinaties van collagenase en neutrale proteasen in verschillende concentraties geëvalueerd en de uiteindelijke verhouding van collagenase: neutraal protease enzym van 35:10 geeft prestatie vergelijkbaar Sigma Type XI. Omdat significante variabiliteit in gemiddelde islet opbrengst van verschillende stammen van ratten en muizen gemeld, aanvullende modificaties van de TDE samenstelling worden om de opbrengst en kwaliteit van eilandjes teruggewonnen uit verschillende soorten en stammen verbeteren.

Een gedetailleerde beschrijving van muis eilandje isolatie wordt beschreven door de techniek van in situ pancreas ductaal infusen en perfusie van een combinatie van gezuiverd collagenase en neutrale protease.

Muis Islet van Langerhans Isolatie met behulp van een combinatie van Gezuiverde Collagenase en neutraal protease

Het onderzoek naar de genexpressie en functie van bètacellen in vitro is in de loop der jaren definitief verschoven van de studie naar tumorigenische cellijnen van knaagdieren ...

Het algemene doel van deze procedure is om succesvol eilandjes van Langerhans te isoleren uit een muizenpancreas. Dit wordt bereikt door eerst de pancreas te isoleren van het omliggende weefsel. Vervolgens wordt de galgang gecannuleerd, zodat de pancreas kan worden opgeblazen met het collagenase-proteasemengsel.Zodra de pancreas is opgeblazen, wordt deze verwijderd en worden de eilandjes zorgvuldig gedissocieerd. Ten slotte worden de geïsoleerde eilandjes gefilterd en uitgeplaat voor toekomstig gebruik. Uiteindelijk wordt deze methode van eilandjesisolatie met gezuiverde collagenase en neutraal protease gebruikt om een maximale opbrengst aan eilandjes en een optimale morfologie van de eilandjes te verkrijgen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor de isolatie van eilandjes van Langerhans is dat we de variabiliteit tussen verschillende batches hebben geëlimineerd door gebruik te maken van gezuiverde enzymen. Daarnaast hebben we enkele protocollen gewijzigd of verbeterd om de morfologie van de eilandjes te optimaliseren. Bedek na euthanasie de romp met 70% ethanol voordat de buikholte volledig wordt geopend, van de anus tot het diafragma.Plaats de muis vervolgens op het platform van een dissectiemicroscoop. Trek het caecum en het colon ascendens naar buiten en leg deze buiten de lichaamsholte aan de linkerzijde; verschuif de leverloben tegen het diafragma aan. Als deze daar niet uit zichzelf blijven liggen, vergroot dan de opening van de lichaamsholte.Pak het duodenum vast met een gebogen pincet en lokaliseer het bundel van de arteria hepatica, de vena portae en de galgang die naar de lever leidt. Gebruik een ander paar gebogen pincetten om een hechtdraad onder de bundel van slagader, ader en gang aan te brengen en trek deze zo dicht mogelijk bij de lever aan.Pak met twee paren gebogen pincetten voorzichtig het duodenum vast en zoek de galgang op ter hoogte van de papil. Gebruik één poot van het pincet om door de pancreas en het bindweefsel direct onder de galgang en nabij de papil te prikken. Plaats het pincet snel door het gat en breng een hechtdraad in. Knoop de hechtdraad losjes rond de galgang om met behulp van een 90-graden pincet een kleine cirkel te vormen.Trek de dunne darm strak tot de galgang gespannen is. Maak met superscherpe scharen één horizontale snede door de papil, terwijl u de darm vasthoudt en ervoor zorgt dat de galgang niet losraakt van de papil. Voer een canule in de galgang in en trek vervolgens voorzichtig de hechtdraad rond de canule aan.Vul vervolgens een spuit van drie milliliter met 2,0 milliliters van het collagenase-protease-mengsel. Injecteer dit mengsel met een langzaam, constant tempo in de canule. Nadat de pancreas volledig is opgeblazen, wordt de canule uit de galgang verwijderd.Begin bij de neergaande dikke darm en knip het bindweefsel door terwijl de darmen worden opgetild totdat de galgang is bereikt. Scheid vervolgens de pancreas van de milt en het omringende weefsel. Knip tot slot de hechtingen door en verwijder de pancreas.Plaats de pancreas na verwijdering in een buis van 50 milliliter met vijf milliliter HBSS op ijs. Wanneer alle monsters zijn verzameld, worden alle buizen van 50 milliliter met pancreasweefsel in een waterbad van 37 graden Celsius geplaatst. Schud de buis gedurende 15 minuten voorzichtig en controleer of het weefsel is gedissocieerd.Zorg ervoor dat het weefsel gemakkelijk uiteenvalt door de buis bij het dopje vast te houden. Draai de buis 12 keer rond om het weefsel verder te dissociëren. Voeg maximaal 30 milliliters HBSS toe en centrifugeer.Aspirer het supernatant voorzichtig en laat een kleine hoeveelheid supernatant op de bodem achter om het celpellet niet te verstoren. Voeg met een spuit van 30 milliliter voorzien van een naald van 14 gauge niet meer dan 10 milliliter HBSS toe en aspireer de suspensie twee keer op en neer. Filtreer het celmengsel door een plastic T-zeef in een buis van 50 milliliter.Spoel met nog eens 10 milliliters HBSS en centrifugeer. Giet het supernatant af en keer de buisjes om zodat ze gedurende één minuut kunnen uitlekken op een absorberend papieren handdoekje. Resuspendeer elk buisje in 10 milliliters.Koud 1100. Zijn ondoorzichtige overlay, de zijn ondoorzichtige Met 10 milliliter HBSS en centrifugeer. Verwijder de volledige 20 milliliter supernatant met een 25 milliliter pipette met grote boring en leid de supernatant door een omgekeerd filter van 70 micron.Filter de eyelets direct in een Petrischaal en spoel door 10 milliliters eyelet-medium via pipetteren door de filtercultuur te leiden. Bewaar de eyelets in een weefselkweekincubator tot ze klaar zijn voor experimentatie. De opbrengst, morfologie en kwaliteit van de eyelets zijn de algemene parameters die worden gebruikt om het succes van de eyelet-isolatie te beoordelen.De typische morfologie van de eilandjes wordt hier getoond. De eilandjes hebben een ronde tot langwerpige vorm met een relatief uniforme grootte. Geïsoleerde eilandjes werden geanalyseerd op glucose-gestimuleerde insulinesecretie.De insulinestimulatie was vergelijkbaar tussen de eilandjes die waren geprepareerd met Sigma Type 11 in vergelijking met ci zyme TM, MABP, wat duidt op een hoge kwaliteit van de eilandjespreparatie. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een galgang van een muis canneleert. Werk met zyme collagenase en neutroproteasen om uw eilandjes te isoleren voor elke assay.

mouse-islet-langerhans-isolation-using-combination-purified

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Murine eilandjes van Langerhans Isolatie

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. This protocol explains a method for isolating pancreatic islets by first perfusing collagenase via Ampulla of Vater to digest the exocrine pancreatic tissue and a simplified density gradient centrifugation to purify the islets from mice.

Pancreatic Islets Isolation through Collagenase Perfusion: An Enzymatic Method to Isolate Pancreatic Islet Cells

Het testen in vitro β-celfunctie met geïsoleerde eilandjes van Langerhans muis is een belangrijke component in de studie van diabetes pathofysiologie en therapie. Terwijl veel downstream applicaties beschikbaar zijn, dit protocol beschrijft specifiek de meting van intracellulaire cyclische adenosine monofosfaat (cAMP) als een essentiële parameter bepalen van β-cel functie.

Een methode voor muis eilandjes van Langerhans Isolatie en intracellulaire cAMP Bepaling

We presenteren hier een protocol voor de isolatie van eilandjes uit het muismodel van type 2 diabetes, Leprdb en details van een live-cel assay voor het meten van insulinesecretie uit intacte eilandjes dat gebruikmaakt van 2 foton microscopie.

LepR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Model van Type 2 Diabetes: eilandjes van Langerhans Isolatie en live-cell 2-Photon Imaging van intacte Eilandjes

We beschrijven een protocol hierin voor het isoleren van intacte eilandjes van neonatale muizen. Pancreata werden gedeeltelijk gedigereerd met collagenase, gevolgd door wassen en handmatige oogst. 20-80 eilandje clusters verkrijgbaar per pancreas van pasgeboren muizen, die geschikt zijn voor verschillende eilandje studies.

Effectieve Isolatie van Functionele eilandjes van neonatale muis alvleesklier

Dit eilandje isolatie protocol beschreef een roman route van Collagenase injectie om het exocriene weefsel te verteren en een vereenvoudigde gradiënt procedure om de eilandjes van muizen te zuiveren. Het gaat om enzymatische spijsvertering, gradiënt scheiding/zuivering en eilandje hand-picking. Succesvolle isolatie kan 250 – 350 hoge kwaliteit en volledig functionele eilandjes per muis opleveren.

Een eenvoudig hoog rendement protocol voor isolatie van de alvleesklier eiland van muizen

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van de alvleesklier eilandjecellen muis voor het screenen van de ROS inducties door de xenobiotica teneinde de potentiële diabetogenic xenobiotische chemische stoffen.

Een lymfkliertest alvleesklier Islet cel-gebaseerde Screening voor Diabetogenic milieu chemische stoffen

In dit protocol wordt een methode van murineeilandisolatie en transplantatie in het inguinal onderhuids wit vetweefsel beschreven. Geïsoleerde synogenische murine eilandjes worden getransplanteerd in een murine ontvanger met behulp van een kelder membraan hydrogel. De bloedsuikerspiegel van de ontvangers wordt gecontroleerd en de histologieanalyse van de levensperie-transplantaties wordt uitgevoerd.

Inguinal Subcutane white Adipose Tissue (ISWAT) Transplantatie Model van Murine Eilandjes

Hier schetsen en demonstreren we een protocol voor primaire muis lever sinusoïdale endotheelcel (LSEC) isolatie. Het protocol is gebaseerd op levercollageaseperfusie, niet-parenchymale celzuivering door centrifugeren met lage snelheid en CD146 magnetische kraalselectie. We fenotyperen en karakteriseren deze geïsoleerde LSEC's ook met behulp van flowcytometrie en scanning elektronenmicroscopie.

Isolatie en karakterisering van primaire leverbijholteelcellen van muizen

Deze studie ontwikkelde een vereenvoudigde methode om efficiënt functionele primaire eilandjes en acinaire cellen uit de muizenalvleesklier te extraheren, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor het bestuderen van intercellulaire communicatie in de pathogenese van Acute Pancreatitis-geïnduceerde Diabetes.

Een eenvoudige en snelle methode voor gelijktijdige isolatie van primaire eilandjes en primaire alvleesklier-acinaire cellen van muizen

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode voor chirurgische oogst, enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntzuivering van Lewis rat-pancreaseilandjes, waardoor hoogopbrengst- en hoogzuiverheidspreparaten mogelijk zijn voor direct gebruik in transplantatie- of in vitrostudies .

Isolatie en zuivering van het pancreaseiland door Lewisratten met behulp van enzymatische vertering en dichtheidsgradiëntscheiding

Leer een geoptimaliseerde methode voor het isoleren van eilandjes van Langerhans uit de muis alvleesklier met behulp van gezuiverde collageenase en neutrale protease. Deze techniek verbetert de opbrengst en morfologie en vermindert variabiliteit tussen batches.

Muis Islet van Langerhans Isolatie met behulp van een combinatie van Gezuiverde Collagenase en neutraal protease

Meer video's verkennen