Muis Islet van Langerhans Isolatie met behulp van een combinatie van Gezuiverde Collagenase en neutraal protease
7 september 2012
Een gedetailleerde beschrijving van muis eilandje isolatie wordt beschreven door de techniek van in situ pancreas ductaal infusen en perfusie van een combinatie van gezuiverd collagenase en neutrale protease.
Het algemene doel van deze procedure is om oogjes succesvol te isoleren van een muizenpancreas. Dit wordt bereikt door eerst het pancreas van omliggend weefsel te isoleren. Vervolgens wordt de galgang gecanuleerd zodat het pancreas kan worden opgeblazen met het collagenase-protease mengsel.
Eenmaal opgeblazen, wordt het pancreas verwijderd en worden de oogjes zorgvuldig gedissocieerd. Ten slotte worden de geïsoleerde oogjes gefilterd en geplaatst voor toekomstig gebruik. Uiteindelijk wordt deze methode van oogjesisolatie met gezuiverd collagenase en neutraal protease gebruikt om maximale oogjesopbrengst en optimale oogjesmorfologie te verkrijgen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden voor oogjesisolatie is dat we de lot-tot-lot variabiliteit hebben geëlimineerd door gebruik te maken van gezuiverde enzymen. En bovendien hebben we enkele protocollen gewijzigd of verbeterd om de oogjesmorfologie te verbeteren. Na euthanasie, bedek de romp met 70%ethanol voordat u de buikholte volledig opent van anus tot diafragma.
Plaats de muis vervolgens op de platform van een dissectiemicroscoop. Trek het blinddarm en de opgaande dikke darm uit en zet ze buiten de lichaamsholte naar links, verplaats de lobben van de lever tegen het diafragma. Als ze niet vanzelf daar blijven, verhoog de opening van de lichaamsholte.
Pak het duodenum met gebogen pincetten en lokaliseer de leverarterie, portaalvene en galgangbundel die naar de lever leidt. Met een ander paar gebogen pincetten. Breng een naald onder het arterie-ader- en ductbundel en draai deze zo dicht mogelijk bij de lever vast.
Gebruik twee paar gebogen pincetten om voorzichtig het duodenum vast te pakken en vind de galgang bevestigd Bij de papilla, gebruik een van de tangen van de pincetten om door het pancreas en bindweefsel direct onder de galgang en nabij de papilla te prikken. Snel, plaats de pincetten door het gat en plaats een naald. Losjes. Bind de naald rond de galgang om een kleine cirkel te maken met behulp van 90-graads pincetten.
Trek aan de dunne darm tot de galgang tau is. Maak een horizontale snede door de papilla met superfijne schaar zonder de galgang van de papilla te ontdoen terwijl u de darm vasthoudt. Breng een canule in de galgang in en trek vervolgens voorzichtig de naald strak rond de canule.
Vul vervolgens een drie milliliter spuit met 2,0 milliliter collagenase-protease mengsel. Injecteer dit mengsel in de canule met een langzame, constante snelheid. Nadat het opblazen van het pancreas voltooid is, verwijdert u de canule uit de galgang.
Beginnend bij de aflopende dikke darm, snijd het bindweefsel terwijl u de darmen omhoog trekt tot de galgang bereikt is. Scheid vervolgens het pancreas van de milt en omliggend weefsel. Snijd ten slotte de naalden door en verwijder het pancreas.
Zodra het is verwijderd, plaats het pancreas in een 50 milliliter buis met vijf milliliter HBSS op ijs. Zodra alle monsters zijn verzameld, plaatst u eventuele 50 milliliter buizen met pancreasweefsel in een waterbad van 37 graden Celsius. Schud de buis gedurende 15 minuten zachtjes heen en weer en controleer op weefseldissociatie.
Zorg ervoor dat het weefsel gemakkelijk loskomt terwijl u de buis bij de dop vasthoudt. Draai 12 keer om het weefsel verder te dissociëren. Voeg niet meer dan 30 milliliter HBSS toe en centrifugeer.
Zuig voorzichtig het supernatant af en laat een kleine hoeveelheid supernatant achter op de bodem om de celpalette niet te verstoren. Gebruik een 30 milliliter spuit bevestigd aan een 14 gauge naald, voeg niet meer dan 10 milliliter HBSS toe en zuig de suspensie twee keer op en neer. Filtreer de celmengsel door een plastic T-zeef in een 50 milliliter buis.
Spoel met nog eens 10 milliliter HBSS en centrifugeer. Giet het supernatant af en draai de buizen om om een minuut op een absorberend papieren handdoek te drogen. Resuspendeer elke buis in 10 milliliter.
Koude 1100. Zijn ondoorzichtige overlay, de ondoorzichtige Zijn met 10 milliliter HBSS en centrifugeer. Verwijder de volledige 20 milliliter supernatant met behulp van een grootboorgat 25 milliliter pipet en voer het supernatant door een omgekeerde 70 micron filter.
Filter de oogjes direct in een petrischaal en spoel door 10 milliliter oogjesmedia door de filtercultuur te pipetten. De oogjes in een weefselkweekincubator tot ze klaar zijn voor experimenten. Oogjesopbrengst, morfologie en kwaliteit zijn de algemene parameters die worden gebruikt om de succes van oogjesisolatie te beoordelen.
Typische oogjesmorfologie wordt hier getoond. De oogjes hebben een ronde tot langwerpige vorm met een relatief uniforme grootte. Hier. Geïsoleerde oogjes werden geanalyseerd op glucose gestimuleerde insulinesecretie.
Insulinestimulering was vergelijkbaar tussen oogjes bereid door Sigma Type 11 in vergelijking met ci zyme TM, MABP, wat wijst op een hoge kwaliteit van oogjesvoorbereiding. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een muizengalgang kunt canuleren. Werk met zyme collagenase en neutro proteasen om uw oogleden te isoleren voor elke test.
Overzicht
Dit artikel beschrijft een gedetailleerde procedure voor het isoleren van eilandjes uit een muizenpancreas met behulp van in situ canuleringstechnieken van de pancreasductus en een collageenase-protease mengsel. De methode beoogt het verbeteren van de opbrengst en morfologie van eilandjes, terwijl de variabiliteit wordt geminimaliseerd.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Endocrinologie
Achtergrond
- Eilandjescellen zijn cruciaal voor insulineproductie.
- Traditionele isolatiemethoden kunnen leiden tot variabiliteit in de resultaten.
- Het gebruik van gezuiverde enzymen kan de kwaliteit van geïsoleerde eilandjes verbeteren.
- Verbeterde protocollen kunnen leiden tot betere eilandjesmorfologie.
Doel van de studie
- Om eilandjes effectief uit muizenpancreas te isoleren.
- Om de variabiliteit tussen verschillende batchs in enzympreparaten te verminderen.
- Om de eilandjesmorfologie te optimaliseren voor onderzoekstoepassingen.
Gebruikte methoden
- Isolatie van het muizenpancreas van omliggende weefsels.
- Canuleringstechniek van de galgang voor enzyminfusie.
- Inflatie van het pancreas met een collageenase-protease mengsel.
- Filtratie en platering van geïsoleerde eilandjes voor experimenten.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle dissociatie en isolatie van eilandjes.
- Verbeterde eilandjesmorfologie waargenomen na isolatie.
- Hoge kwaliteit eilandjespreparaten, aangetoond door insulinesecretietests.
- De methode vertoont verminderde variabiliteit vergeleken met traditionele technieken.
Conclusies
- De beschreven methode is effectief voor het isoleren van hoogwaardige eilandjes.
- Het gebruik van gezuiverde enzymen verbetert de betrouwbaarheid van de resultaten.
- Deze techniek kan voordelig zijn voor verschillende assays die eilandjes omvatten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolation of primary pancreatic islets enables physiologically relevant assessment of beta cell function, which is critical for diabetes target validation and mechanistic de-risking. Variability in enzyme lot performance compromises reproducibility across discovery campaigns, impacting lead identification and predictive confidence. This protocol addresses lot-to-lot inconsistency through purified collagenase and neutral protease, supporting scalable, standardized islet preparation for preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of intracellular signaling pathways and secretory responses in primary islets, improving target hypothesis validation.
- Operational Value: Reduces biological noise from enzymatic variability, increasing confidence in target engagement readouts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides consistent islet yield and morphology for reliable glucose-stimulated insulin secretion assays.
- Operational Value: Standardized enzyme composition supports assay reproducibility across laboratories and screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains disease-relevant beta cell biology for preclinical efficacy and toxicity studies.
- Operational Value: Facilitates cross-strain comparability when enzyme ratios are adjusted for species-specific tissue characteristics.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, where primary islet function informs go/no-go decisions.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation using physiologically relevant human-like islet responses.
- Screening: Enables standardized, quantitative assessment of compound effects on insulin secretion.
- Analytics: Generates measurable dependent variables such as insulin secretion levels and islet yield for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects discovery-phase target modulation to preclinical outcomes through preserved islet morphology and function.
- Enterprise Reuse: Purified enzyme lots allow protocol reuse across projects, reducing re-optimization burden.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reduced mechanistic ambiguity in beta cell responses.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of islet isolation across sites and studies.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in diabetes programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable islet-derived functional data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine dissection and pancreatic duct cannulation.
- Dependent on access to purified collagenase (CIzyme MA) and neutral protease (CIzyme BP) with characterized activity.
- Necessitates standardization of enzyme ratios (e.g., 35:10 collagenase:protease) for consistent performance.
- Adaptation may be needed for non-C57BL/6 strains or rat models based on tissue density and enzyme accessibility.
- Practical limitation: Manual dissection and inflation steps constrain throughput without automation.
