Microdialyse van alcohol tijdens de operante ethanol zelftoediening en ethanol bepaling door gaschromatografie
5 september 2012
Een methode om het tijdsverloop van ethanol concentratie in de hersenen van ratten te bepalen tijdens operant ethanol zelftoediening beschreven. Gaschromatografie met vlamionisatiedetectie wordt gebruikt om ethanol te kwantificeren in het dialysaat monsters, omdat het de gevoeligheid vereist voor kleine volumes die worden gegenereerd.
Het algemene doel van deze procedure is om ethanolniveaus in hersendialysaat te monitoren tijdens een ethanol zelftoedieningssessie. Om deze meting te vergelijken met synchrone zelftoedieningsgedragingen, wordt dit bereikt door eerst chirurgisch een microdialysegids, canule en verankeringsbout te implanteren, en vervolgens ratten te trainen om operant ethanol zelf toe te dienen. De tweede stap is om de ratten te laten wennen aan de hoofdtrapverankering, zodat deze de ethanol zelftoediening tijdens microdialyse niet zal belemmeren.
Vervolgens wordt microdialyse uitgevoerd tijdens een ethanol zelftoedieningssessie waarbij een deel van het dialysaat wordt voorbereid voor ethanolanalyse. Vervolgens worden de dialysaatmonsters geanalyseerd op ethanolconcentratie met behulp van een gaschromatograaf met vlamionisatiedetectie. Uiteindelijk tonen de verkregen resultaten de tijdsverloop van ethanol die het hersengebied van belang bereikt tijdens een ethanol zelftoedieningssessie.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals staart- of saphenusvenepunctie is dat deze procedure minimaal verstoort op het moment van monsterneming en het mogelijk maakt om het medicijn in de loop van de tijd in het hersengebied van belang te meten terwijl het dier een gedragstaak uitvoert. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat het een aantal gespecialiseerde vaardigheden vereist, waarvan vele alleen kunnen worden verworven door herhaalde oefening of ervaring. Ook zal Jeffrey Dilley, een onderzoeksassistent in ons laboratorium, de procedure demonstreren.
Alle getoonde dierproeven zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Texas en volgen alle richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren. De Universiteit van Texas in Austin is een ALAC geaccrediteerde faciliteit waar goed behandelde Long Evans ratten die chirurgisch zijn geïmplanteerd met een 21 gauge canule boven het hersengebied van belang worden gebruikt voor deze gedragsmicrodialyse experimenten. Alle dieren moeten ten minste een week post-operatieve zorg en herstel krijgen en gezond zijn voordat ze met de volgende procedures beginnen.
Plaats de rat in een med associates operant kamer, uitgerust met een lichter intrekbare hendel en tipperbuis en train hem om de hendel in te drukken voor toegang tot een 10% sucrose oplossing. Nadat de rat is getraind om te reageren op de sucrose oplossing, begin met een geschikt trainingsschema waarbij ethanol geleidelijk over meerdere drink sessies de nacht voor de voorlaatste operante sessie in de oplossing wordt toegevoegd. Na het verdoven van het dier en het controleren van de sedatie, bevestig de verankeringsveer aan de verankeringsbout op de kop van de rat om hem te laten wennen aan het apparaat dat bestaat uit een contragewichthendel, arm, draaibare verankering, veer en ringstandaard.
Laat de rat de nacht in de operant kamer doorbrengen in zijn eigen kooi met ad libitum, voedsel en water, en voltooi de volgende dag de trainingssessie met de verankering en het bijbehorende apparatuur op de dag voor het microdialyse experiment. Na het verdoven van de rat met isoflurine, controleer op sedatie door een teenprik uit te voeren en breng een microdialyse sonde aan die is gevuld met kunstmatige hersenvocht. Bevestig de sonde op de juiste manier en pas vervolgens de sonde doorstroomsnelheid aan naar 0,2 microliter per minuut.
Plaats de rat in zijn eigen kooi in de operant kamer om de nacht door te brengen met alle dialyseapparatuur op zijn plaats en voeg ad libitum, voedsel en water toe. De dag na het inbrengen van de sonde, minstens twee uur voordat het experiment begint, draai de sonde naar zijn werkdoorstroomsnelheid. Gebruik een Hamilton spuit om te controleren of de sonde doorstroomsnelheid consistent is en minimaal 90% van de ingestelde stroomsnelheid is.
Indien neurotransmitters in de dialysemonsters worden geëvalueerd, neem monsters tijdens alle fasen van het experiment. Begin met het verzamelen van dialysemonsters terwijl het dier in zijn eigen kooi is. Bewaar de monsters op een geschikte manier voor latere analyse.
Breng de rat voorzichtig over naar de operant kamer en start het operant programma dat de kamer bestuurt. Blijf monsters nemen terwijl het dier wacht tot de hendel zich in de kamer uitstrekt, twee monsters voordat de hendel zich uitstrekt. Begin met het verzamelen van een deel van elk dialysaat monster voor ethanol analyse door een geschikte aliquot van dialysaat in een twee milliliter glazen fles te pipetten en de fles te verzegelen met een luchtdichte septum, pipet en verzegel de ethanol monsters snel.
Aangezien ethanol vluchtig is en het monstervolume klein is, zullen inconsistente of langzame monstervoorbereiding leiden tot onnauwkeurige resultaten. Bewaar de resterende hoeveelheid voor neurotransmitteranalyse. De 20 minuten durende drinkperiode begint nadat het Med Associates computerprogramma de hendel in de kamer heeft uitgestrekt en de rat deze indrukt om toegang te krijgen tot een fles drinkoplossing.
Ga door met het nemen van monsters gedurende de hele drinkperiode. Na de drinkperiode trekt het computerprogramma de fles uit de kamer. Houd het dier nog eens 20 minuten na de drinkperiode in de kamer aan het einde van het microdialyse experiment. Na het verdoven van de rat, verwijder de sonde.
Als het dier niet onmiddellijk humanitair wordt geëuthanaseerd, plaats de obturator terug om de visualisatie van de sonde kanaal te garanderen. Verzamel de hersenen binnen drie dagen na het experiment. Analyseer de monsters samen met externe ethanol standaarden met behulp van een gaschromatograaf met een vlamionisatiedetector, een headspace autosampler, verwarmd tot 50 graden Celsius, en een capillaire kolom met helium als mobiele fase.
Gebruik chromatografie werkstation software voor het opnemen en analyseren van de chromatogrammen om het systeem voor te bereiden op ethanol analyse. Gebruik een recirculerend waterbad om de autosampler plaat te verwarmen en open de lucht- en waterstoftanks. Start vervolgens het opstart programma.
Wanneer het klaar is, start een 20 minuten durende brand, die de vezel ontsmet. Maak standaarden met behulp van een 100 milliliter volumetrische kolf om 238 microliters 95% ethanol te verdunnen met water tot een eindvolume van 100 milliliters. Gebruik een een-op-een seriële verdunning om standaarden
Overzicht
Dit artikel beschrijft een methode voor het monitoren van ethanolgehaltes in de hersenen van ratten tijdens operante zelfadministratie. De techniek maakt gebruik van gaschromatografie met vlamionisatiedetectie om ethanolconcentraties in dialysaatmonsters te analyseren.
Belangrijkste Onderzoekscomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Neurowetenschappen
- Gedragsfarmacologie
- Microdialysetechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van de effecten van ethanol op de hersenen is cruciaal voor verslavingsonderzoek.
- Traditionele methoden voor het meten van ethanolgehaltes kunnen invasief zijn en verstoringen veroorzaken.
- Deze studie beoogt een minder invasief alternatief te bieden voor real-time monitoring.
- Microdialyse maakt continue bemonstering mogelijk tijdens gedragstaken.
Doel van de studie
- Om het verloop van de ethanolconcentratie in de hersenen tijdens zelftoediening te bepalen.
- Om ethanolspiegels te vergelijken met zelftoedieningsgedrag.
- Om een methode voor monstername vast te stellen die een minimale verstoring veroorzaakt.
Gebruikte Methoden
- Chirurgische implantatie van een microdialyse-geleider en canule.
- Training van ratten voor zelftoediening van ethanol.
- Microdialyse uitgevoerd tijdens sessies van zelftoediening.
- Gaschromatografie met vlamionisatiedetectie voor ethanolanalyse.
Belangrijkste resultaten
- De ethanolconcentratie werd succesvol in realtime gemonitord.
- De methode vertoonde minimale verstoring van het gedrag van de ratten.
- De resultaten wezen op een duidelijk tijdverloop van de ethanol die de hersenen bereikt.
- De techniek bleek voordeliger dan traditionele methoden voor bloedafname.
Conclusies
- De microdialysemethode is effectief voor het bestuderen van de effecten van ethanol op de hersenen.
- Het maakt continue monitoring tijdens gedragstaken mogelijk.
- Deze benadering kan het begrip van verslavingsmechanismen verbeteren.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het monitoren van ethanolconcentraties in de hersenen tijdens operante zelftoediening maakt een mechanische risicoreductie van therapeutische hypothesen met betrekking tot ethanol mogelijk door farmacokinetiek te koppelen aan gedragsmatige uitkomsten. Deze aanpak ondersteunt de validatie van targets in verslavingsonderzoek door kwantitatieve, tijdopgeloste gegevens te verschaffen over de blootstelling van de hersenen tijdens vrijwillige consumptie. De methode verhoogt het voorspellend vertrouwen in preklinische modellen door variabiliteit die geassocieerd is met perifere bemonstering en door stress veroorzaakte confounders te verminderen.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door ethanolgehaltes in de hersenen te correleren met zelfadministratiegedrag om target engagement te valideren.
- Operationele waarde: Maakt functionele target-validatie mogelijk via real-time neurochemische monitoring tijdens doelgericht gedrag.
- Translationele waarde: Ondersteunt het voorspellende vertrouwen door menselijke drinkpatronen te modelleren in een gecontroleerd preklinisch systeem.
Screening en assay-ontwikkeling
- Klaarzetten van de analyse: Bereidt gevalideerde biologische systemen voor op downstream neurochemische screening door basislijnen voor ethanolkinetiek vast te stellen.
- Kwantitatieve output: Genereert reproduceerbare ethanolmetingen in het dialysaat die geschikt zijn voor standaardisatie van de analyse en vergelijkingen tussen laboratoria.
- Hergebruik van het platform: Faciliteert de screeningbereidheid voor verbindingen die de ethanolmetabolisme of beloningspaden beïnvloeden door middel van consistente monstername.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Modelleert zelftoediening van ethanol om de farmacologische mechanismen ten grondslag aan alcoholgebruisstoornissen te bestuderen.
- Translationele continuïteit: Verbindt neurochemische gegevens uit de ontdekkingsfase met preklinische validatie via gekoppelde gedragsmatige en biochemische meetwaarden.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Informeert go/no-go-beslissingen door drempelwaarden voor blootstelling in de hersenen vast te stellen die bepalend zijn voor versterking.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode integreert in het ontdekkingscontinuüm, van hypothesetoetsing tot lead-identificatie, door real-time neurochemische monitoring tijdens operant gedrag mogelijk te maken.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetoetsing en verduidelijking van signaalpaden door het meten van de ethanol-dynamiek in de hersenen tijdens vrijwillige inname.
- Screening: Waarborgt de gereedheid en reproduceerbaarheid van de assay via gestandaardiseerde dialysaatbemonstering en GC-FID-analyse.
- Analytics: Levert kwantitatieve uitlezingen van de ethanolconcentratie die vergelijking tussen experimentele condities en tijdspunten mogelijk maken.
- Translationeel onderzoek: Verbindt met preklinische continuïteit door blootstellingsgegevens van de hersenen te verschaffen die relevant zijn voor doserings- en effectiviteitsstudies.
- Enterprise Reuse: Functioneert als een herbruikbaar platform voor het evalueren van CNS-actieve verbindingen in gedragsparadigma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen door mechanische ambiguïteit in relaties tussen ethanol, hersenen en gedrag te verminderen.
- Operationele waarde: Verbetert de standaardisatie en reproduceerbaarheid door middel van minimaal disruptieve, longitudinale bemonstering bij wakker, bewegende dieren.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming door directe gegevens over de blootstelling van de hersenen te leveren, waardoor biologische risico's in een late fase worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van verbindingen mogelijk op basis van de interactie met het hersendoelwit tijdens zelftoediening.
Overwegingen voor Implementatie
- Vereist expertise in stereotaxische chirurgie, gedragstraining en microdialyse-technieken.
- Is afhankelijk van instrumentatie, waaronder microdialysepompen, gaschromatografen met FID en analysesoftware.
- Vereist standaardisatie tussen de chirurgie-, gedrags- en analyseteams voor een consistente monsterverwerking.
- Houdt rekening met aanpassingen bij uitbreiding naar andere hersenregio's of drugsklassen naast ethanol.
- Wordt beperkt door de noodzaak van langdurige habituatie- en herstelperioden voor de dieren om een stabiel basisgedrag te garanderen.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:05
Title
1:39
Operant Training and Pre-microdialysis Tethering and Probe Insertion
3:54
Collection of Samples during Self-administration Sessions with Appetitive and Consummatory Phases Separated
6:16
Preparation and Analysis of Ethanol in the Dialysis Sample
8:22
Representative Ethanol Data
9:30
Conclusion
