Constant Pressure-gecontroleerde Extrusie werkwijze voor de bereiding van Nano-sized lipide bolletjes
22 juni 2012
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het bereiden extrusie lipide vesicles van sub-micron afmetingen met een hoge mate van homogeniteit. Deze methode maakt gebruik van een druk-gecontroleerd systeem met gecontroleerde stikstofstroom tarieven voor liposoom voorbereiding. De lipide voorbereiding 1,2, Zal liposoom extrusie, en de grootte karakterisering hierin worden gepresenteerd.
Het algemene doel van het volgende experiment is om een robuuste bereidingsmethode te presenteren voor biologisch relevante lipide vesiclen. Dit wordt bereikt door fosfolipiden te mengen en over te brengen naar glazen flacons en ze te hydrateren met aqueuze buffer om een multi lamella SLE-suspensie te creëren. Als tweede stap wordt een vries- en ontdooimethode uitgevoerd, wat vervolgens resulteert in de productie van Ella Vesicles uit multi lamella vesiclen.
Vervolgens wordt de liposoomsuspensie door een extruder geleid met behulp van de bepaalde optimale druk om homogene lipide vesiclen van een gewenste grootte te produceren. Resultaten werden verkregen die consistente submicronische vesiclengroottes laten zien op basis van dynamische lichtverstrooiing en nanodeeltjestraceringsanalyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals sonificatie en sedimentatie, is dat deze methode een drukcontrolesysteem gebruikt met optimaal bepaalde stikstofstroomsnelheden voor efficiënte lipide vesiclengroottebereiding.
Om deze procedure te starten, haal een glasflesje van 20 milliliter met een Teflon-beklede dop, maak alle glaswerk en spuiten schoon met chloroform voor gebruik om besmetting te voorkomen. Breng 100 microliter reagensgraad chloroform over naar de glazen fles met behulp van een luchtdichte glazen spuit van 250 microliter. Voeg 30 microliter reagensgraad methanol toe aan dezelfde glazen fles met behulp van een luchtdichte glazen spuit van 100 microliter.
Bereid een twee millimolare pop C papaver cholesterol lipideoplossing door 216 microliter van 10 milligram per milliliter pop C 42 microliter van 10 milligram per milliliter. Pop e en 20 microliter van 11 milligram per milliliter. Cholesteroloplossingen over te brengen naar de glazen fles van 20 milliliter. Laat de organische oplosmiddelen verdampen met langzame argon of stikstofgasstroom totdat een dunne laag lipiden op de bodem van de fles wordt waargenomen, plaats de onbedekte glazen fles in een vacuümdroger gedurende ten minste 30 minuten.
Om restoplosmiddel te verwijderen, breng twee milliliter buffer over die eerder is gepasseerd door een 0,2 micron filter naar de glazen fles om de lipiden te hydrateren. Incubeer het mengsel bij vier graden Celsius overnacht en gebruik binnen 48 uur voor liposoomgroottes van 30 tot 100 nanometer. Bevries de liposoomsuspensie in vloeibare stikstof gedurende 15 seconden.
Ontdooi vervolgens de liposoomsuspensie met behulp van een verwarmingsblok bij 42 graden SIUs gedurende ongeveer drie minuten. Herhaal het vries-ontdooiproces gedurende in totaal vijf cycli. Het bevriezen en vervolgens ontdooien produceert Ella Les uit multi lamella vesiclen en verbetert de lipide opvangefficiëntie tijdens extrusie.
Bereid vervolgens de extrusie voor door de Avastin-instructies te volgen om de lipo zo snel mogelijk te monteren. LF 50 extruder. Correcte montage is van cruciaal belang om stikstoflekkage te voorkomen, wat de gewenste stroomsnelheden beïnvloedt. Voer de volgende stappen zorgvuldig uit om succes te garanderen.
Om een luchtdichte afdichting te produceren. Plaats het steunscherm met het grote gat in de steunfilterbasis, gevolgd door de ronde centrale schotel, een afvoerschijf en een polycarbonaatmembraan. Plaats de kleine zwarte O-ring bovenop het membraan en bevestig het aan de steunfilterbasis.
Bevestig de bovenste filterextruder door vier schroeven in de vier bijbehorende gaten vast te draaien. Monteer de filterextrudereenheid onder de grote extrudervat. Voeg de liposoomoplossing toe aan de cilindervat bovenop de extrusievat.
Plaats een grote ronde O-ring, smalle dop, grote ronde O-ring en ronde dop. Bevestig de gasregelaar aan de bovenkant van de extrudervat en sluit alle kleppen om luchtlekkage te voorkomen, inclusief de overdrukklep. Plaats een glazen fles van 20 milliliter of een erlenmeyerkolf van 50 milliliter onder de extruderfiltereenheid.
Een veiligheidsklep is verbonden met de regelaar en zal openen als de druk 600 PSI overschrijdt. Schakel het stikstofgas in en open de gasklep verbonden met de extruder. Verhoog de stikstofdruk naar 25 PSI voor liposomen van 400 nanometer tot 125 PSI voor liposomen van 100 nanometer, en naar 400 tot 500 PSI voor liposomen van 30 nanometer. Houd de liposoomsuspensie in de gaten totdat deze in de container wordt uitgestoten terwijl deze wordt geduwd door het stikstof.
Laat het stikstof blijven stromen totdat er geen vloeistof meer wordt waargenomen. Door de extruderfilter in de glazen map om DLS-analyse uit te voeren. Bereid eerst 50 microliter van een 20 micromolair liposoomoplossing verdund in fosfaatgebufferd zoutwater of PBS.
Schakel vervolgens de voedingsbron en de lampbron in. Ga naar de dynapro-software. Stel de software in op het algoritmemodel om liposomen in de gewenste grootte te detecteren.
Na het aansluiten op de hardware pipet 14 microliter liposoommonster in de kwartsvete en steek deze in de celhouder, druk op start en volg ongeveer 20 tot 30 acquisities, druk op stop. Analyseer de gemiddelde liposoomdiameterpieken die op de histogram zijn geregistreerd. Nanodeeltjestraceringsanalyse begint met de bereiding van een 500 microliter 0,1 micromolair liposoomoplossing gesolubiliseerd in PBS, spoel het monstercompartiment met water en ethanol.
Droog vervolgens het monstercompartiment af met een pluisvrij papieren handdoek. Schakel de laservoedingsbron en de computer in en lever 300 microliter 0,1 molair liposoomoplossing aan het monstercompartiment. Open de temperatuurregeling en de nanodeeltjestraceringsanalysesoftware.
Druk op de opnameknop om de laser in te schakelen. Gebruik de horizontale en verticale aanpassingen om het podium te verplaatsen en de microscoopfocus aan te passen. Stel de gewenste temperatuur en opnametijd in.
Druk op de opnameknop om meerdere beeldframes van de liposoomdeeltjes gedurende een bepaalde tijd te nemen. Analyseer de pieken die overeenkomen met de diameter van de liposoomgroottes op het histogram terwijl het de
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een robuuste methode voor het bereiden van biologisch relevante lipide-vesikels met behulp van een op druk gecontroleerd systeem. De methode zorgt voor een hoge mate van homogeniteit in sub-micron gedimensioneerde lipide-vesikels.
Belangrijke onderdelen van het onderzoek
Wetenschapsgebied
- Biochemie
- Biofysica
- Nanotechnologie
Achtergrond
- Lipide-vesikels zijn cruciaal voor verschillende biologische toepassingen.
- Traditionele methoden zoals sonicatie kunnen mogelijk niet consistente groottes opleveren.
- Op druk gecontroleerde systemen kunnen het bereidingsproces verbeteren.
- Dynamische lichtverstrooiing en nanoparticle tracking worden gebruikt voor groottekarakterisering.
Doel van het onderzoek
- Om een efficiënte methode voor lipide-vesikelvoorbereiding te presenteren.
- Om een hoge mate van homogeniteit in vesikelgroottes te bereiken.
- Om de effectiviteit van deze methode te vergelijken met traditionele technieken.
Gebruikte methoden
- Het mengen van fosfolipiden met aqueuze buffer om een multi-lamella SLE suspensie te creëren.
- Het toepassen van een bevriezen en ontdooien methode om Ella Vesikels te produceren.
- Het gebruik van een extruder met optimale druk voor liposomen suspensie.
- Het karakteriseren van vesikelgroottes door dynamische lichtverstrooiing en nanoparticle tracking analyse.
Belangrijkste resultaten
- Consistente submicron vesikelgroottes werden bereikt.
- De methode toonde voordelen aan ten opzichte van sonicatie en sedimentatie.
- Optimale stikstofstromingssnelheden verbeterden de voorbereidingsefficiëntie.
- Resultaten bevestigden de homogeniteit van de geproduceerde lipide-vesikels.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare aanpak voor lipide-vesikelvoorbereiding.
- Het biedt significante verbeteringen in grootteconsistentie en homogeniteit.
- Het op druk gecontroleerde systeem is een belangrijke innovatie in dit protocol.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Consistent preparation of nano-sized lipid vesicles is critical for biopharma R&D, enabling reliable modeling of membrane dynamics and drug encapsulation studies. The constant pressure-controlled extrusion method addresses longstanding challenges in vesicle size homogeneity, supporting predictive confidence in early discovery and formulation workflows. This capability enhances translational continuity from mechanistic studies to preclinical evaluation of lipid-based delivery systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of membrane curvature effects on protein-lipid and protein-protein interactions.
- Supports functional validation of membrane-associated targets by providing uniform vesicle platforms.
- Facilitates mechanistic de-risking in studies of endocytosis, exocytosis, and membrane fusion.
Screening & Assay Development
- Delivers reproducible, size-defined liposomes for standardized assay development.
- Improves assay reliability by minimizing vesicle heterogeneity and batch variability.
- Enables scalable preparation of vesicles for high-throughput compound screening and encapsulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Provides stable vesicle formulations for drug delivery and encapsulation research.
- Ensures continuity in vesicle properties from in vitro mechanistic studies to preclinical models.
- Supports risk-adjusted advancement of lipid-based delivery candidates by demonstrating vesicle stability and size fidelity.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both mechanistic studies and formulation development for lipid-based therapeutics.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on membrane curvature and protein trafficking using uniform vesicle systems.
- Screening: Provides assay-ready liposomes with validated size distributions for compound evaluation.
- Analytics: Employs DLS and NTA for quantitative vesicle size measurement and batch-to-batch comparability.
- Translational Research: Maintains vesicle stability and size for downstream preclinical and encapsulation studies.
- Enterprise Reuse: Offers a robust, scalable platform for repeated vesicle preparation across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in membrane biology and drug delivery research.
- Operational Value: Standardizes vesicle preparation, reducing variability and manual error.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by ensuring reliable vesicle properties for downstream studies.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of lipid-based candidates through reproducible formulation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid chemistry and vesicle characterization techniques.
- Needs access to pressure-controlled extrusion apparatus and analytical tools such as DLS and NTA.
- Demands rigorous cleaning protocols to prevent sample contamination.
- Adaptable to various lipid compositions and vesicle sizes as supported by protocol.
- Instrumental limitations in size measurement (e.g., DLS bias) should be considered in data interpretation.
