Name: Constant Pressure-gecontroleerde Extrusie werkwijze voor de bereiding van Nano-sized lipide bolletjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Leer een drukgecontroleerde extrusiemethode voor het bereiden van homogene nano-liposomen met consistente submicron groottes. Deze techniek biedt betrouwbaardere resultaten dan sonificatie voor biologische toepassingen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Collaborative Innovation Award. LAM werd gesteund door de Signalering en Cellulaire verordening National Institute of Health opleiding subsidie ​​(T32 GM008759) en de NIH Ruth L. Kirschstein Pre-doctoraal onderzoeker (CA165349-01). We willen graag prof. Michael Stowell (CU Boulder), prof. dr. Douglas Rees en prof. dr. Rob Phillips (Caltech) bedanken voor hun waardevolle commentaar.

1. Liposoompreparaat <ol><li> Haal een 20 ml glazen flacon met een Teflon beklede kap. </li><li> Maak voor al het glaswerk en spuiten met chloroform te gebruiken om besmetting te voorkomen. </li><li> Breng 100 pl van pa chloroform om het glazen flesje met een 250 ul luchtdichte glazen injectiespuit. </li><li> Voeg 30 ul van pa methanol om dezelfde glazen flesje met een 100 ul luchtdichte glazen injectiespuit. </li><li> Fosfatidylethanolamine (Paus):: Om een ​​2 mm 7:1.5:1.5 fosfatidylcholine (POPC) voor te bereiden cholesterol lipide oplossing in 216 pi van 10 mg / ml POPC, 42 pl van 10 mg / ml PAUS en 20 ul van 11 mg / ml cholesterol oplossingen in CHCI3 de 20 ml glazen flesje. </li><li> Damp organische oplosmiddelen met langzame doorstroming argon of stikstofgas tot een dunne film van lipiden waargenomen op de bodem van de flacon. </li><li> Plaats de afgetopte glazen flesje in een vacuümexsiccator ten minste 30 minuten achtergebleven oplosmiddel te verwijderen. </li><li> Transfer 2 ml buffer, eerder geleid door een 0,2 micron filter met het glazen flesje te hydrateren lipiden. </li><li> Incubeer het mengsel bij 4 ° C geroerd en gebruiken binnen 48 uur. </li></ol> 2. Freeze-en-dooi: Voor Liposome Maten van 30 - 100 nm Alleen <ol><li> Freeze liposoom suspensie in vloeibare stikstof gedurende 15 seconden. </li><li> Ontdooien liposoom suspensie met een opwarmsnelheid blok 42 ° C temperatuur tot 3 minuten. </li><li> Herhaal stap 2.1 en 2.2 in totaal 5 cycli. </li></ol> 3. Extrusie Volg de instructies om Avestin juiste montage van de Liposofast LF-50 extruder, met behulp van het instrument geeft in hun gids. <ol><li> Plaats de grote opening steun scherm (met ronde gaten) in de steun filter base, gevolgd door de cirkelvormige gesinterde schaal (zonder gaten), een afvoer schijf (25 mm diameter), en een polycarbonaat (25 mm diameter). </li><li> Plaats de kleine, zwarteO-ring op het membraan om deze vast aan de steun filterhouder. </li><li> Bevestig de bovenste filter extruder door het aandraaien van vier schroeven in de vier corresponderende gaten. </li><li> Monteer het filter extruder toestel aan op de onder de grote extruder vat. Voeg de liposoom oplossing de cilindermantel. Plaats de volgende op de top van de extrusie vat in volgorde: grote ronde O-ring, smalle kap, grote ronde O-ring, ronde dop. </li><li> Sluit de gasregelaar de extrudercilinder top en sluit alle kleppen om luchtlekkage, waaronder de overdrukklep voorkomen. Plaats een 20 ml glazen flacon of 50 ml erlenmeyer onder de extruder filter. Een veiligheidsklep is verbonden met de regelaar en laat als de druk groter is dan 600 psi. Zet de stikstofgas en opent de gasklep aangesloten op de extruder. </li><li> Verhoog de stikstof druk om 25 psi voor 400 nm liposomen, 125 psi voor 100 nm liposomen, en 400-500 psi gedurende 30 nm liposomen. </li><li> Bekijk de liposoom suspension als werpt in de houder tijdens geduwd door stikstof. Houd de doorstromende stikstof totdat je niet meer in acht te nemen vloeistof die door de extruder filter in de glazen flacon. </li></ol> 4. Dynamische Lichtverstrooiing (DLS) Analysis <ol><li> Bereid 50 ul van een 20 pM oplossing liposoom. </li><li> Zet de stroombron en de lamp bron. </li><li> Open de Dynapro software. </li><li> Stel de software om de MS / X-algoritme model om liposomen van 30 nm en 100 nm en MS800 algoritme model om&gt; 100 nm liposomen te sporen op te sporen. </li><li> Verbinding maken met de hardware. </li><li> Pipetteer 14 ul van liposoom monster in de kwarts cuvet en steek deze in de cel houder. </li><li> Druk op start. </li><li> Druk op Stop na ~ 20 tot 30 acquisities. </li><li> Analyseer de gemiddelde liposoom diameter pieken opgenomen op het histogram. </li></ol> 5. Nanodeeltje Tracking Analyse (NTA) <ol><li> Bereid een 500 pL, 0,1 uM liposoomoplossing. </li><li> Spoel het monster compartiment met water en ethanol. </li><li> Droog het monster compartiment met een niet-pluizende papieren handdoek. </li><li> Zet de laser voedingsbron en de computer. </li><li> Lever 300 pi van 0,1 uM liposoom oplossing van het monster compartiment. </li><li> Open de temperatuurregeling en de Nanodeeltje Tracking Analyse software. </li><li> Druk op Capture-toets om de laser. </li><li> Gebruik de horizontale en verticale aanpassingen van de fase over te gaan en de microscoop scherp te stellen. </li><li> Stel de gewenste temperatuur (20 ° C) en opnametijd (ten minste 30 seconden). </li><li> Druk op de knop Opnemen om meerdere lijsten van het liposoom deeltjes voor een bepaalde hoeveelheid tijd in beslag nemen. Analyseren pieken overeenkomt met de diameter liposoom maten op de histogram zoals de beweging van elk deeltje volgt. </li></ol> 6. Representatieve resultaten Een schema waarin de extrusie methode is paanstoot in figuur 1. Om optimale resultaten te verkrijgen, bereiding van liposomen met een diameter van 30 nm is een hoge druk van ~ 500 psi en een diameter van 100 nm heeft een druk van 125 psi tot een snelle filter snelheid bereiken. Voor diameters van 400 nm, wordt een lage druk van ~ 25 psi aanbevolen een lagere filter snelheid, waarmee de vesicles verlengen en tot grotere homogene liposomen bereiken. Wij hebben een reeks experimenten om de optimale druk voor het produceren van consistente sub-micron blaasje maten te bepalen. We gevarieerd de druk en het aantal extrusie passeert polycarbonaat filters met poriën van 30, 100 en 400 nm en ontdekte geschikte druk voor elke gewenste grootte. Voor 30 nm poriën zal de druk lager is dan 500 psi verminder de luchtstroming, waardoor rek en dus groter blaasje maten. Voor 100 nm poriën, is er een constante stroom bereikt bij 125 psi. Voor 400 nm poriën, lage druk (25 psi) kan de blaasjes te rekken in grotere blaasje sizes. Een druppelsgewijs filtratie doorstroming optimaal is om grotere sub-micron blaasjes 13 te creëren. We voerden DLS aan het liposoom maten geëxtrudeerd door drie verschillende diameters, namelijk 30, 100 en 400 nm te bepalen. DLS is een gevestigde methode die verstrooid licht verzamelt het bepalen van de deeltjesdiameter. We geëxtrudeerde gehydrateerd liposomen 2 mM door een polycarbonaat 30 nm membraan 500 psi met 5 doorgangen door de filter poriën, een 100 nm polycarbonaat bij 125 psi met 5 doorgangen door de filter poriën en een 400 nm polycarbonaat bij 25 psi met 2 door het filter porie. De diameters van de liposomen en gemeten DLS 30, 100 en 400 nm poriegrootte was 66 ± 28 138 ± 18 en ± 25 360 nm (figuur 2). Een suspensie van 50 nm polystyreenparels werd gebruikt als kalibratiestandaard zoals getoond in figuur 2, waarin het opgenomen een diameter van 47 ± 16 nm. Het percentage polydispersity toont aan dat er geen overlap in liposoom maten. Het is typisch voor een diameter groter dan 30 nm bij het ​​gebruik van DLS-analyse te wijten aan de bekende vooroordelen dit instrument heeft de richting van grotere deeltjes 12. Lichtverstrooiing intensiteiten van grote en kleine deeltjes worden gelijktijdig verzameld van een detectiemethode en dus moeilijker te liposomen in suspensie 12 op te lossen. Ondanks deze instrumentale beperking, de kalibratiecurve beschrijft een bijna lineaire correlatie. NTA is een nieuwe technologie die de grootte van de deeltjes uit directe waarneming van diffusie in een vloeibaar medium, onafhankelijk van deeltjes brekingsindex of dichtheid gemeten. Deze hoge resolutie techniek kan worden gebruikt voor het meten van liposomen met DLS vullen. De NTA opgenomen diameters van 95 ± 48 en ± 51 356 nm, twee 100 nm en 400 nm polystyreen oplossingen werden gebruikt voor kalibratie. Lipid oplossingen van 30 nm en 100 nm werden waargenomen een Comp<html> bouwland diameter ten opzichte van de DLS zoals getoond in figuur 3, waardoor de gemiddelde grootte van 29 ± 14 95 ± 17 en ± 73 359 nm. 1000 nm - NTA kan een algemene karakteristiek techniek microscopische deeltjes kwantificeren omdat de gevoeligheid kan het meten deeltjes van 50. De kalibratiecurve toont een lineaire correlatie tussen de polycarbonaat poriën versus opgenomen NTA diameter. <table border="1"><tbody><tr><td> Liposome Maten </td><td> Detectiegrens </td><td> Verwachte minimale deeltjesgrootte (nm) </td></tr><tr><td> 30 nm </td><td> 11 </td><td> 30 </td></tr><tr><td> 100 nm </td><td> 11 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> 400 nm </td><td> 21 </td><td> 400 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. NanoSight Parameters. ad/4151/4151fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Stroomschema van de extrusie methode beschreven hoe de druk en stikstofstroom regelt de homogeniteit van verschillende diameters liposoom. Na liposoom hydratatie unilamellaire vesicles van verschillende grootte zijn geëxtrudeerd door verschillende polycarbonaat filterporiën bij verschillende drukken. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig2.jpg" /> Figuur 2. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) gegevens die de kwantitatieve liposoom afmetingen na extrusie. (A) een staafgrafiek is aangetoond dat de diameters van de drie monsters liposoom beschrijven. Kalibratiestandaard 50 nm polystyreen (PS) korrels werd gebruikt als referentie. De gemiddelde diameter liposoom zijn aangegeven boven de balk voor elk monster. De x-as wordt de poriën waarvan de oplossingen werden geëxtrudeerd door. De y-as geeft de diameter opgenomen door DLS. Hoewel de 30 nm en 100 nm maten opnemened waarden hoger dan de poriegrootte terwijl de grotere 400 nm grootte opgenomen iets kleinere grootte, de ijkgrafiek (b) toont een bijna lineaire relatie, waarbij de x-as geeft het polycarbonaat poriegrootte en de y-as wordt de opgenomen liposoom met een diameter van DLS. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig3.jpg" /> Figuur 3. Nanodeeltje Tracking Analyse (NTA) gegevens die de liposoom maten na extrusie. (A) De grafieken geven de diameter van elke liposoom monster. De x-as wordt de poriën waarvan de oplossingen werden geëxtrudeerd door. De y-as wordt de grootte diameter opgenomen door de NTA. De gemiddelde liposoom diameters zijn voorzien boven elk monster. (B) de NTA ijkgrafiek toont een lineaire correlatie dan DLS ijkcurve van de filtermembraanmodules poriegrootte versus de opgenomen diameter. De x-as wordt de polycarbonaat poriegrootten. De y-as wordt de opgenomen liposoom diameter NTA. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig4.jpg" /> Figuur 4. Negatieve kleuring transmissie elektronen microscopie (TEM) beelden die elk liposomengrootte (500 uM), gevolgd door extrusie. Carbon Formvar mesh rasters zijn negatief voor ontladen monster kleuring, waarbij 1% uranylacetaat in water werd gebruikt om de monsters vlek voor het drogen en beeldvorming in 34.000 x vergroting. Maten 30, 100, en 400 nm duidelijk los van elkaar. De vergroting was ingesteld op 25.000 ×. De schaal balk vertegenwoordigt 0,5 micrometer. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/4151/4151fig5.jpg" /> Figuur 5. Een tijdsverloop experiment werd uitgevoerd met drie liposoom maten. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) werd gemeten voor elke liposoom oplossing onmiddellijk na extrusie. Alle liposoom oplossingen werden opgeslagen in 4 °C geroerd. De diameters zijn door de DLS na een nacht incubatie. Weinig tot geen verandering werd waargenomen na een 16 uur durende incubatieperiode.

<ol><li>Connor, J., Bucana, C., Fidler, I. J., Schroit, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation-dependent+expression+of+phosphatidylserine+in+mammalian+plasma+membranes%3A+quantitative+assessment+of+outer-leaflet+lipid+by+prothrombinase+complex+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Differentiation-dependent expression of phosphatidylserine in mammalian plasma membranes: quantitative assessment of outer-leaflet lipid by prothrombinase complex formation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3184-3188 (1989).</li>
<li>Smith, S. A., Morrissey, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+incorporation+of+tissue+factor+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient incorporation of tissue factor into liposomes.</a> J. Thromb. Haemost. 2, 1155-1162 (2004).</li>
<li>Hui, E., Johnson, C. P., Yao, J., Dunning, F. M., Chapman, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptotagmin-mediated+bending+of+the+target+membrane+is+a+critical+step+in+Ca%282%2B%29-regulated+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synaptotagmin-mediated bending of the target membrane is a critical step in Ca(2+)-regulated fusion.</a> Cell. 138, 709-721 (2009).</li>
<li>Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+procedures+for+the+coupling+of+proteins+to+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes.</a> J. Immunol. Methods. 132, 25-35 (1990).</li>
<li>Mui, B., Chow, L., Hope, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrusion+technique+to+generate+liposomes+of+defined+size%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Extrusion technique to generate liposomes of defined size.</a> Methods Enzymol. 367, 3-14 (2003).</li>
<li>Gruner, S. M., Cullis, P. R., Hope, M. J., Tilcock, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+polymorphism%3A+the+molecular+basis+of+nonbilayer+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biophys.+Biophys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Lipid polymorphism: the molecular basis of nonbilayer phases.</a> Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 14, 211-238 (1985).</li>
<li>Guven, A., Ortiz, M., Constanti, M., O'Sullivan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+method+for+the+size+separation+of+homogeneous+fluorescein-encapsulating+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Liposome.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient method for the size separation of homogeneous fluorescein-encapsulating liposomes.</a> J. Liposome. Res. 19, 148-154 (2009).</li>
<li>Zimmerberg, J., Kozlov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+proteins+produce+cellular+membrane+curvature%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">How proteins produce cellular membrane curvature.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7, 9-19 (2006).</li>
<li>Chonn, A., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+liposomal+drug-delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Recent advances in liposomal drug-delivery systems.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 698-708 (1995).</li>
<li>Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicles+of+variable+sizes+produced+by+a+rapid+extrusion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure.</a> Biochim. Biophys. Acta. 858, 161-168 (1986).</li>
<li>Matsuoka, K., Schekman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+liposomes+to+study+COPII-+and+COPI-coated+vesicle+formation+and+membrane+protein+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The use of liposomes to study COPII- and COPI-coated vesicle formation and membrane protein sorting.</a> Methods. 20, 417-428 (2001).</li>
<li>Dragovic, R. A., Gardiner, C., Brooks, A. S., Tannetta, D. S., Ferguson, D., Hole, P., Carr, B., Redman, C., Harris, A. L., Dobson, P. J., Harrison, P., Sargent, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+and+phenotyping+of+cellular+vesicles+using+Nanoparticle+Tracking+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis.</a> Nanomedicine. , (2011).</li>
<li>Hunter, D. G., Frisken, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+extrusion+pressure+and+lipid+properties+on+the+size+and+polydispersity+of+lipid+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Effect of extrusion pressure and lipid properties on the size and polydispersity of lipid vesicles.</a> Biophys J. 74, 2996-3002 (1998).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Met behulp van de Avestin Liposofast LF-50 Extruder, hebben we laten zien hoe de kleine, synthetische liposomen zijn bereid door middel van een druk-gestuurd systeem. Het is belangrijk op te merken dat multilamellaire blaasjes spontaan te vormen naar aanleiding liposoom hydratatie, wat kan leiden tot productie van kleinere nanodeeltjes. Deze kleine multilamellaire blaasjes zal onvermijdelijk stromen door de grotere polycarbonaat membraan poriën, waardoor de heterogeniteit in oplossingen van unilamellaire blaasjes die do...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Chloroform </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 02432-25ML </td><td> 95% stabilisatoren </td></tr><tr><td> High Grade Methanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 179337-4L </td><td></td></tr><tr><td> Liposofast LF-50 Extruder </td><td> Avestin, Inc </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fosfolipiden </td><td> Avanti Polar Lipiden </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polycarbonaat Poriën </td><td> Avestin, Inc </td><td></td><td> 25 mm </td></tr><tr><td> Laat discs PE </td><td> Avestin, Inc </td><td> 230600 </td><td> 25 mm </td></tr></tbody></table>

constant pressure-gecontroleerde extrusie werkwijze voor de bereiding van nano-sized lipide bolletjes

Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomen zijn kunstmatig bereid vesicles bestaande uit natuurlijke en synthetische fosfolipiden die algemeen gebruikt worden als membraan nabootsen platform eiwit-en eiwit-interacties lipide 3 beeldscherm drug delivery 4,5 en inkapseling 4 bestuderen. Fosfolipiden van nature te creëren gebogen lipidendubbellagen onderscheiden zich van een micel. 6 Liposomen worden traditioneel ingedeeld naar grootte en het aantal dubbellagen, dat wil zeggen grote unilamellaire blaasjes (LUVS), kleine unilamellaire blaasjes (SUV&#39;s) en multilamellaire blaasjes (MLV&#39;s) 7. Met name de bereiding van homogene liposomen van verschillende grootte is van belang voor het bestuderen membraan kromming die een belangrijke rol speelt bij celsignalering, endo-en exocytose, membraanfusie en eiwit handel 8. Verscheidene groepen gaan hoe eiwitten gebruikt voor het moduleren processen membraan kromming omvat en dus bereiden liposomen diameters &lt;100-400nm tot hun gedrag op de mobiele functies 3 te bestuderen. Anderen richten zich op liposoom-drug inkapseling, het bestuderen van liposomen als dragers voor het uitvoeren en leveren een geneesmiddel van belang 9. Drug inkapseling kan worden bereikt, zoals gerapporteerd tijdens de vorming van liposomen 9. De extrusie niet de ingekapseld geneesmiddel beïnvloeden om twee redenen, dat wil zeggen dat (1) geneesmiddel inkapseling voorafgaand verwezenlijkt deze stap (2) liposomen moeten hun natuurlijke biofysische stabiliteit behouden, stevig die het geneesmiddel in de waterige kern. Deze onderzoeksdoelstellingen verder wijzen op de noodzaak voor een optimale manier van stabiele sub-micron lipide vesicles ontwerpen. Toch maar met de huidige liposoombereiding technologieën (sonicatie 10, vries-en dooi-10, sedimentatie) niet toe dat de voorbereiding van liposomen met een sterk gebogen oppervlak (dat wil zeggen een diameter van &lt;100 nm) met een hoge consistentie en efficiëntie 10,5, die de biofysische grenzen studies van een emerging gebied van membraan kromming sensing. Hierin stellen we een robuuste bereidingswijze voor een verscheidenheid van biologisch relevante liposomen. Handmatig met behulp van extrusie gasdichte spuiten en polycarbonaat membranen 10,5 is een veel voorkomende praktijk, maar heterogeniteit wordt vaak waargenomen bij het ​​gebruik van poriegrootte &lt;100 nm als gevolg van de variabiliteit van de toegepaste manuele druk. We gebruikten een constante druk gecontroleerde extrusieinrichting synthetische liposomen die diameters variëren tussen 30 en 400 nm te bereiden. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) 10, elektronenmicroscopie 11 en nanodeeltjes tracking analyse (NTA) 12 werden gebruikt om de afmetingen liposoom kwantificeren beschreven in onze protocol met commerciële polystyreen (PS) korrels als kalibratiestandaard. Een bijna-lineaire correlatie werd gevonden tussen de werknemers poriegrootte en de experimenteel bepaalde liposomen, met vermelding van high fidelity van onze druk-gecontroleerde liposoombereiding voldaanHod. Voorts hebben we aangetoond dat deze lipidesamenstelling bereidingswijze is algemeen toepasbaar, onafhankelijk van verschillende afmetingen liposoom. Tot slot hebben we ook aangetoond in een tijdsverloop studie dat deze voorbereid liposomen stabiel waren voor maximaal 16 uur. Een representatieve nanoformaat liposoompreparaat protocol wordt hierna aangetoond.

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het bereiden extrusie lipide vesicles van sub-micron afmetingen met een hoge mate van homogeniteit. Deze methode maakt gebruik van een druk-gecontroleerd systeem met gecontroleerde stikstofstroom tarieven voor liposoom voorbereiding. De lipide voorbereiding<sup&gt; 1,2</sup&gt;, Zal liposoom extrusie, en de grootte karakterisering hierin worden gepresenteerd.

Constant Pressure-gecontroleerde Extrusie werkwijze voor de bereiding van Nano-sized lipide bolletjes

Liposomen zijn kunstmatig geprepareerde blaasjes bestaande uit natuurlijke en synthetische fosfolipiden die veelvuldig worden gebruikt als platform dat de celmembraan nabootst ...

Het algemene doel van het volgende experiment is het presenteren van een robuuste preparatiemethode voor biologisch relevante lipide-vesikels. Dit wordt bereikt door fosfolipiden te mengen en over te brengen naar glazen vials en deze te hydrateren met een waterige buffer om een multilamellaire SLE-suspensie te creëren. Als tweede stap wordt een vries-dooi-methode uitgevoerd, wat vervolgens resulteert in de productie van unilamellaire vesikels vanuit multilamellaire vesikels.Vervolgens wordt de liposoomsuspensie door een extruder geleid met gebruik van de bepaalde optimale druk om homogene lipidovesikels van een gewenste grootte te produceren. Er zijn resultaten verkregen die consistente submicron-vesikelgroottes aantonen op basis van dynamische lichtverstrooiing en nanoparticle tracking-analyse. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals sonicatie en sedimentatie, is dat deze methode gebruikmaakt van een drukregelsysteem met optimaal bepaalde stikstofstroomsnelheden voor een efficiënte bereiding van de lipidovesikelgrootte.Om deze procedure te starten, neemt u een glazen flacon van 20 milliliter met een Teflon-gevoerde dop; reinig al het glaswerk en de spuiten vóór gebruik met chloroform om contaminatie te voorkomen. Breng 100 µL chloroform van reagentia-kwaliteit over naar de glazen flacon met een luchtdichte glazen spuit van 250 µL. Voeg 30 µL methanol van reagentia-kwaliteit toe aan dezelfde glazen flacon met een luchtdichte glazen spuit van 100 µL.Bereid een twee millimolaire PopC-poppy-cholesterollipide-oplossing door 216 µL van 10 mg/mL PopC, 42 µL van 10 mg/mL PopE en 20 µL van 11 mg/mL cholesteroloplossing over te brengen naar een glazen flesje van 20 mL. Laat de organische oplosmiddelen verdampen met een langzame stroom argongas of stikstofgas totdat er een dunne lipidefilm op de bodem van het flesje zichtbaar is. Plaats het open glazen flesje gedurende ten minste 30 minuten in een vacuümdesiccator.Om resterend oplosmiddel te verwijderen, brengt u twee milliliter buffer die vooraf door een 0,2 micron filter is gehaald over in het glazen vial om de lipiden te hydrateren. Incubeer het mengsel gedurende één nacht bij vier graden Celsius en gebruik dit binnen 48 uur voor liposoomgroottes van 30 tot 100 nanometer. Vries de liposoomsuspensie gedurende 15 seconden in vloeibare stikstof.Ontdooi vervolgens de liposoomsuspensie met behulp van een warmteblok bij 42 degrees SIUs gedurende ongeveer drie minuten. Herhaal het vries-dooi-proces voor in totaal vijf cycli. Bevriezen en vervolgens ontdooien produceert Ella Les uit multilamellaire vesikels en verhoogt de efficiëntie van lipideninvanging tijdens extrusie.Bereid vervolgens de extrusie voor door de instructies voor Avastin te volgen om de lipo so fast LF 50-extruder zorgvuldig te assembleren. Een correcte assemblage is cruciaal om stikstoflekkage te voorkomen, aangezien dit de gewenste stroomsnelheden beïnvloedt. Voer de volgende stappen zorgvuldig uit om succes te garanderen.Om een luchtdichte afsluiting te creëren: plaats het zeefscherm met grote gaten in de basis van de ondersteuningsfilter, gevolgd door de ronde centrale schaal, één drainageschijf en één polycarbonaatmembraan. Plaats de kleine zwarte O-ring bovenop het membraan en bevestig deze aan de basis van de ondersteuningsfilter.Bevestig de bovenste filterextruder door vier schroeven in de vier bijbehorende gaten aan te draaien. Monteer de filterextruderunit onder het grote extrudervat. Voeg de liposoomoplossing toe aan het cilindervat bovenop het extrudervat.Plaats een grote ronde O-ring, een smalle dop, een grote ronde O-ring en een ronde dop. Bevestig de gasregelaar aan de bovenkant van de extrudervat en sluit alle afsluiters, inclusief het overdrukventiel, om luchtlekkage te voorkomen. Plaats een glazen vial van 20 milliliter of een erlenmeyer van 50 milliliter onder de filtereenheid van de extruder.Een veiligheidsventiel is verbonden met de regelaar en zal openen als de druk 600 PSI overschrijdt. Ik zet het stikstofgas aan en open het gasventiel dat verbonden is met de extruder. Verhoog de stikstofdruk naar 25 PSI voor 400 nanometer liposomen, naar 125 PSI voor 100 nanometer liposomen, en naar 400 tot 500 PSI voor 30 nanometer liposomen. Houd de liposoomsuspensie in de gaten totdat deze, voortgestuwd door de stikstof, in de opvangbak wordt gespoten.Blijf stikstof doorvoeren totdat er geen vloeistof meer zichtbaar is. Laat de oplossing door het extruderfilter in het glazen bestand lopen om DLS-analyse uit te voeren. Bereid eerst 50 µL van een 20 µM liposomenoplossing voor, verdund in fosfaatgebufferde zoutoplossing of PBS.Zet vervolgens de stroomvoorziening en de lampbron aan. Open daarna de Dynapro-software. Stel de software in op het algoritmische model om liposomen van de gewenste grootte te detecteren.Pipetteer, na aansluiting van de hardware, 14 µL liposoommonster in de kwartsvete en plaats deze in de celhouder. Druk op start en druk na ongeveer 20 tot 30 acquisities op stop. Analyseer de gemiddelde liposoomdiameterpieken die op het histogram zijn geregistreerd. Nanopartikel-trackinganalyse begint met de bereiding van een 500 µL 0,1 µM liposoomoplossing gesolubiliseerd in PBS; spoel het monstercompartiment met water en ethanol.Droog vervolgens het monstercompartiment af met een pluisvrije papieren handdoek. Zet de laserstroombron en de computer aan en breng 300 µL 0,1 M liposoomoplossing aan in het monstercompartiment. Open de temperatuurregeling en de software voor nanoparticle tracking analysis.Druk op de capture-knop om de laser in te schakelen. Gebruik de horizontale en verticale verstellingen om de tafel te bewegen en de focus van de microscoop af te stellen. Stel de gewenste temperatuur en opnametijd in.Druk op de opnameknop om gedurende een gespecificeerde tijd meerdere beeldframes van de liposoomdeeltjes vast te leggen. Analyseer de pieken die overeenkomen met de diameter van de liposomen op het histogram terwijl de beweging van elk deeltje wordt gevolgd. DLS is een gevestigde methode die verstrooid licht verzamelt om de deeltjesdiameter te bepalen en werd uitgevoerd om de grootte van de liposomen vast te stellen.Gehydrateerde liposomen werden geëxtrudeerd door polycarbonate membranen van verschillende groottes en onder verschillende drukken, zoals beschreven in het geschreven protocol. De diameters van de liposomen gemeten via DLS bedroegen 66 ± 28 nanometer voor een poriegrootte van 30 nanometer. Voor een poriegrootte van 100 nanometer was dit 138 ± 80 nanometer, en voor een poriegrootte van 400 nanometer was dit 360 ± 25 nanometer.Een suspensie van gepolijste Irene-beads van 50 nanometer werd gebruikt als kalibratiestandaard, waarbij een diameter van 47 ± 16 nanometer werd geregistreerd. De procentuele polydispersiteit laat zien dat er geen overlap is in de liposoomgroottes. Het is gebruikelijk om diameters groter dan 30 nanometers waar te nemen bij DLS-analyse vanwege de bekende bias van dit instrument voor grotere deeltjes.Ondanks deze instrumentele beperking beschrijft de kalibratiecurve een lineaire correlatie. Nanodeeltjes-trackinganalyse is een nieuwe technologie die de grootte van elk deeltje meet op basis van directe observaties van diffusie in een vloeibaar medium, onafhankelijk van de brekingsindex of dichtheid van het deeltje. Deze techniek met een hoge resolutie kan worden gebruikt als aanvulling op de meting van liposomen met DLS; de NTA registreerde diameters van 95 ± 48 nanometers en 356 ± 51 nanometers voor twee polystyreenoplossingen van 100 nanometer en 400 nanometer die voor kalibratie werden gebruikt.Lipide-oplossingen hebben een meer vergelijkbare diameter relatief aan DLS, waarbij gemiddelde groottes van 29 plus of minus 14 nanometer werden gemeten voor een poriegrootte van 30 nanometer, 95 plus of minus 17 nanometer voor een poriegrootte van 100 nanometer en 359 plus of minus 73 nanometer voor een poriegrootte van 400 nanometer. NTA kan een meer algemene karakteriseringstechniek zijn om microscopische deeltjes te kwantificeren, aangezien de gevoeligheid metingen van deeltjes van 50 tot 1000 nanometer mogelijk maakt. De kalibratiecurve vertoont een lineaire correlatie tussen de poriën van het polycarbonaatmembraan en de geregistreerde NTA-diameter. Negatief gekleurde transmissie-elektronenmicroscopische beelden laten zien dat elke liposoomgrootte na extrusie naar groottes van 3, 100 en 400 nanometer duidelijk van elkaar te onderscheiden is.De vergroting werd ingesteld op 25.000 maal, waarbij de schaalbalk 0,5 µm vertegenwoordigt. Er werd een tijdreeksexperiment uitgevoerd met drie liposoomgroottes. DLS werd voor elke liposoomoplossing gemeten direct na extrusie.Alle liposoomoplossingen werden gedurende de nacht bij vier graden Celsius bewaard. De diameters werden na een incubatie van een nacht opnieuw vastgesteld met DLS. Na een incubatieperiode van 60 uur werd er weinig tot geen verandering waargenomen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat meerdere passages door het extrusiefilter de homogeniteit van de liposoomoplossing verbeteren.Vergeet bovendien niet om glazen flacons en spuiten te gebruiken voor de monstervoorbereiding om contaminatie door uitloging van polypropyleenbuizen door chloroform te voorkomen.

constant-pressure-controlled-extrusion-method-for-preparation-nano

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Biochemisch gedefinieerde grote unilamellaire vesicles (LUV's) zijn een handig modelsysteem om interacties van de BCL-2-familie te analyseren, met directe implicaties voor een beter begrip van de mitochondriale route van apoptose. Er wordt een methode gepresenteerd voor het produceren van LUV's, samen met standaard combinaties van eiwitten uit de BCL-2-familie en controles om de permeabilisatie van LUV's te onderzoeken.

Het onderzoeken van Bcl-2 familie functie met grote unilamellaire blaasjes

We beschrijven een protocol voor de bereiding van ondersteunde lipide-dubbellagen en de karakterisering ervan met behulp van atoomkrachtmicroscopie en krachtspectroscopie.

Atomic Force Microscopy Imaging en Force Spectroscopie van Ondersteunde lipidendubbellagen

Liposomen met single-keten amfifielen, vertonen met name de vetzuren, verschillende eigenschappen ten opzichte van deze met diacylphospholipids als gevolg van de unieke chemische eigenschappen van één keten amfifielen. Hier beschrijven we technieken voor de voorbereiding, zuivering, en gebruik van liposomen bestaat gedeeltelijk of geheel van deze amfifielen.

Voorbereiding, zuivering, en het gebruik van vetzuur-bevattende liposomen

Solid-ondersteund, eiwit-vrij, dubbele fosfolipide dubbelgelaagde membranen (DLBM) kunnen worden omgezet in complexe en dynamische lipide nanobuis netwerken en kunnen dienen als 2D onderop modellen van het endoplasmatisch reticulum.

Spontane vorming en omlegging van kunstmatige lipide nanobuis netwerken als een Bottom-Up-Model voor endoplasmatisch Reticulum

Deze studie beschrijft klassieke hydratatie met behulp van de dunne lipide-film methode voor de bereiding van nanoliposome gevolgd door nanodeeltjes karakterisatie. Een 47 kDa-hydrofiele en bolvormige proteïne, Tarin, is met succes ingekapseld als een strategie om de stabiliteit te verbeteren, snelle klaring te voorkomen en gecontroleerde afgifte te bevorderen. De methode kan worden aangepast aan hydrofobe moleculen inkaping.

Voorbereiding en karakterisering van Nanoliposomes voor de Entrapment van bioactieve hydrofiele bolvormige eiwitten

Het doel van het protocol is om de mechanische eigenschappen van de membraan van gigantische blaasjes betrouwbaar te meten met micro pipet aspiratie.

Het verkrijgen van gigantische Unilamellaire hybride blaasjes door elektro vorming en meting van hun mechanische eigenschappen door micropipet aspiratie

Dit artikel beschrijft de protocollen voor monstervoorbereiding, gegevensreductie en gegevensanalyse in neutronenspinecho (NSE) studies van lipidemembranen. Verstandige deuteriumetikettering van lipiden maakt toegang tot verschillende membraandynamiek op mesoscopische lengte- en tijdschalen mogelijk, waarover vitale biologische processen plaatsvinden.

Neutron Spin Echo Spectroscopie als een unieke sonde voor lipidemembraandynamiek en membraan-eiwitinteracties

Dit protocol beschrijft de vorming van cel nabootsende uni-lipide en multi-lipide blaasjes, ondersteunde lipide bilayers en gesuspendeerde lipide bilayers. Deze in vitro modellen kunnen worden aangepast om een verscheidenheid aan lipidetypen op te nemen en kunnen worden gebruikt om verschillende molecuul- en macromolecuulinteracties te onderzoeken.

Assemblage van cellimitiek ondersteunde en gesuspendeerde lipide bilayer modellen voor de studie van moleculaire interacties

Hier wordt een nanobar-ondersteund lipide bilayer-systeem ontwikkeld om een synthetisch membraan te bieden met een gedefinieerde kromming die de karakterisering van eiwitten met krommingsdetectievermogen in vitro mogelijk maakt.

Een nanobar-ondersteund lipide bilayer-systeem voor de studie van membraankrommingsgevoelige eiwitten in vitro

Er wordt een experimenteel protocol gepresenteerd om gramicidine A-gedoopeerde druppelinterface-dubbellagen samen te stellen, elektrisch te stimuleren en te analyseren. Relaties tussen lipide-eiwitstructuur en -functie worden gekwantificeerd door veranderingen in membraanoppervlakte, ionische flux en enkelkanaalgeleidbaarheid te meten, en deze responsen te relateren aan plasticiteitsachtige veranderingen in ionische geleiding in een membraanmodel geïnspireerd door elektrische synapsen.

Lipid-eiwitmembraan structuur-functie karakterisering met behulp van druppelinterface-dubbellagen

Leer een drukgecontroleerde extrusiemethode voor het bereiden van homogene nano-liposomen met consistente submicron groottes. Deze techniek biedt betrouwbaardere resultaten dan sonificatie voor biologische toepassingen.

Constant Pressure-gecontroleerde Extrusie werkwijze voor de bereiding van Nano-sized lipide bolletjes

Meer video's verkennen