Fabricage en gebruik van micro-omgeving microarrays (MEArrays)

Het algemene doel van het volgende experiment is om de effecten van verschillende micro-omgevingen op de cellulaire functies van adherente celtypen te meten door deze parallel bloot te stellen aan een diverse collectie Combinator micro-omgevingen. Dit wordt bereikt door eerst printsubstraten te vervaardigen die de absorptie van mengsels van micro-omgevingsproteïnen ondersteunen. Vervolgens worden masterplates van micro-omgevingsproteïnen klaargemaakt, die worden gebruikt om ME-arrays te printen met behulp van een microarray-printrobot met een quill- of capillairpin.

Vervolgens worden masterplates van micro-omgevingsproteïnen geprepareerd. Daarna worden adherente cellen gekweekt op de ME-array, waarbij de optie bestaat om het aantal cellen te beperken. De verkregen resultaten tonen de impact van de verschillende micro-omgevingen op cellulaire functies, zoals differentiatie of proliferatie, op basis van immunofluorescentieanalyse.

We kregen voor het eerst het idee voor deze methode toen we de effecten van weefselmicro-omgevingen op het lot van menselijke geheugenstamcellen wilden kwantificeren, maar we realiseerden ons dat werken in vivo onmogelijk is. Nu de methode is ontwikkeld, heeft deze vele toepassingen in de celbiologie, het onderzoek en de geneesmiddelenontwikkeling. PDMS wordt gebruikt als substraat dat stijvere weefsels naboot, aangezien het goedkoop is, eenvoudig te bereiden is en gemakkelijk te printen is.

De hydrofobiciteit van PDMS kan het echter incompatibel maken met sommige cellijnen bij het werken met PDMS-domeinen. Gebruik handschoenen zonder latex, aangezien latex de polymerisatie van PDMS kan remmen. Combineer ter beginne in een wegwerpbeker van kunststof Sylgard 184 silicone elastomer base met het uithardingsmiddel in een verhouding van 10 op 1 en meng dit krachtig met een houten of plastic tongspatel.

Ontgas vervolgens het mengsel gedurende 30 minuten in een vacuümklok op kamertemperatuur. Plaats nu een standaard microscoopglas centraal op de aangedreven vacuümklem van een spin-coater, breng 0,5 milliliters van het gemengde elastomeerpolymeer aan op het centrum van het glasoppervlak en spin-coat dit bij 6.000 RPM gedurende 60 seconden. Hard de met PDMS gecoate glaasjes uit bij 70 °C gedurende vier uur tot een hele nacht.

De objectglazen kunnen luchtdicht bij kamertemperatuur gedurende enkele maanden bewaard worden. PA is een hydrogel die zachtere weefsels kan nabootsen in het bereik van PA cellen zullen alleen hechten aan plaatsen waar eiwitten aanwezig zijn die celadhesie ondersteunen. Begin met het etsen van de objectglazen met natriumhydroxide.

Plaats de objectglazen op een warmteblok bij 80 °C. Druppel één milliliter 0,1 normaal natriumhydroxide op elk objectglas. Zorg ervoor dat het gehele oppervlak van het objectglas bedekt is, anders zal de PA mislukken.

Laat het natriumhydroxide verdampen zodat er een witte film achterblijft. Herhaal dit proces als het oppervlak niet volledig bedekt is. Het objectglas kan indien nodig enkele dagen bij kamertemperatuur worden bewaard.

Coat daarna de objectglazen met PES in een zuurkast. Plaats de objectglazen in een schaal van 15 milliliter. Voeg 300 µL PES toe aan elk met natriumhydroxide geëtst objectglas.

Laat het APES precies vijf minuten reageren met de natriumhydroxide-objectglazen. Niet langer. Spoel het APES grondig af met gedeïoniseerd water, twee tot drie keer aan beide zijden van de objectglazen.

Anders zal het oxideren, waardoor in de volgende stap een bruine neerslag op de objectglazen ontstaat. Aspireer nu alle oplossingen van de oppervlakken van de objectglazen naar de respectievelijke schaaltjes. Voeg 25 milliliters 0,5% glutaraldehyde in PBS toe.

Plaats de objectglazen in het donker en wacht 30 minuten. Aspireer na 30 minuten alle glutaaraldehyde-oplossing van het oppervlak van het objectglas. Droog de objectglazen vervolgens voorzichtig met absorberend pluisvrij papier.

De objectglazen kunnen nu, indien nodig, gedurende de nacht bij kamertemperatuur worden bewaard. Plaats de PA-mengsels na bereiding en ontgassen op ijs om de polymerisatie te vertragen. Voeg vlak voor het aanbrengen van de mengsels op de objectglazen ammoniumpersulfaat en TEMED toe aan elk mengsel op ijs en tritiumeer deze met een pipet gedurende vijf tot 10 seconden.

Pipette nu het PA-mengsel op de oppervlakken van het objectglas. De hoeveelheid PA varieert afhankelijk van de vereiste gelhardheid. Plaats vervolgens glazen dekglasplaatjes bovenop de PA zonder druk uit te oefenen om luchtbelvorming te voorkomen.

Laat de PA-gel twee uur polymeriseren en verwijder vervolgens de dekglasjes onder gedeïoniseerd water. Was de PA-gelslides een nacht lang met water in grote coplan-potten. Om de niet-reactieve acrylamiden de volgende dag te verwijderen, worden de slides gedroogd tot de PA-gel volledig is uitgehard.

De objectglazen kunnen vervolgens gedurende één maand bij vier graden Celsius worden bewaard in een afgesloten objectglazenbakje. Om te beginnen wordt een plastic kamer bevestigd rond de geprinte array van een objectglas met twee kamers. Verwijder de kamers en snijd ze met een scheermesje doormidden.

Gebruik een pipetpunt van één milliliter om een dunne kraal aquariumsiliconen op de rand van een kamer aan te brengen en druk deze op het oppervlak van een Emmy-array. Vermijd dat de siliconen in contact komen met enig deel van de array-kenmerken. Het waarborgen van een goede hechting van de kweekwanden aan de Emmy-array is cruciaal, omdat slecht hechtende wanden ervoor kunnen zorgen dat medium uit de kamers lekt, wat kan leiden tot wijdverspreide celdood.

Voor met PDMS gecoate objectglazen worden de glazen geblokkeerd door ze voor beide geltypen 15 minuten onder vacuüm te incuberen in een waterige oplossing van 1%onic F 108; spoel de arrays vervolgens drie keer gedurende vijf minuten per wasbeurt met celkweekmedium met antibiotica. Dit verwijdert niet-reactieve monomeren, die in het geval van PA-gels toxisch kunnen zijn voor de cellen. Laat de gel na de derde wasbeurt nog 30 minuten incuberen in het medium om deze te rehydrateren.

Plaats nu vier tot vijf arrays in een steriele Petrischaal van 15 centimeter. Voeg aan de schaal de helft van het uiteindelijke mediumvolume toe, met de betreffende cellen in de voor de toepassing vereiste concentratie. ME-arrays moeten worden geplaatst in een incubator die geschikt is voor het onderhoud van het gebruikte celtype.

Controleer elke 15 tot 20 minuten onder een microscoop of de cellen uniform zijn gehecht aan de geprinte structuren. Schud de ME-arrays voorzichtig om onderscheid te maken tussen gehechte en zwevende cellen. De hechtingstijd varieert, maar is gewoonlijk binnen twee uur voltooid op een PA-gecodeerde ME-array.

Nadat de verzadiging van de aanhechting is bereikt of de tijdslimiet is verstreken, aspireert u de niet-gebonden cellen en vult u de schaal aan tot het eindvolume op met PDMS gecoate ME-arrays. Het verwijderen van al het medium zal de cellen doden. Vervang daarom bij alle mediumwissels op deze slides opeenvolgend de helft van het mediumvolume en vul de schaal vervolgens aan tot het eindvolume.

De kweek kan gedurende vele dagen worden voortgezet met normale mediumverversingen. Gangbare fixatiemiddelen zoals paraformehyde, aldehyde en methanol-aceton zijn compatibel met de Emmy array-systemen. Vergeet niet dat ME-arrays nat moeten blijven, zelfs bij het kleuren van PDMS-gecoate oppervlakken.

Ga verder met de techniek voor vervanging van het halve volume om preparaten van de gekleurde ME-arrays voor te bereiden. Gebruik een scheermesje om de kamers te verwijderen en monteer dekglasplaatjes met flora. G-eiwit werd afgezet op een geprinte PDMS-gecodeerde ME-array met behulp van vierkantgetipte siliciumpinnen op een quill-pen.

De depositie van diverse eiwitten door de microarray-printrobot werd geverifieerd via immunofluorescentie met behulp van antilichamen. De verdunningen van de eiwitoplossingen in de masterplaat waren representatief voor de hoeveelheid die werd gedeponeerd op het oppervlak van het printsubstraat; cellen hechtten zich op een duidelijk patroon aan de geprinte structuren. Evenzo treedt hetzelfde duidelijke patroon van celhechting op wanneer een Emmy-array wordt geprint op een schaal van 40.000 passes.

Twee micro-omgevingsproteïnen uit een PA-gel veroorzaakten concentratieafhankelijke expressieprofielen van keratine in een humane multipotente mammaire epitheliale progenitorcellijn. De log-ratio van keratine 8-signalen ten opzichte van keratine 14-signalen illustreert de variatie en reproduceerbaarheid van het signaal. Na 24 uur cultuur worden ongebonden cellen weggewassen in een analyse van 12 me-arrays.

Standaard statistische analyses werden gebruikt om vast te stellen of de verschillende verdunningen van type one collageen en recombinant menselijk p-cadherine leidden tot veranderingen in de keratinexpressie. Aanvankelijk was er geen variatie ten opzichte van het gemiddelde tussen cellen op de kenmerken direct na hechting. Na 24 uur riepen hoge concentraties type one collageen echter een significant hogere expressie van keratin acht op.

Daarentegen riepen hoge PCA-concentraties hier een sterk keratin 14-signaal op. Deze bevinding is consistent met eerdere rapporten over bipotente geheugenprogenitorcellen. Vanwege de dynamische en reciproke aard van deze interacties in de celmicro-omgeving, kunnen deze cellen zelf de samenstelling van de geprinte micro-omgevingen veranderen.

Om daarom de acute effecten van de door u geprinte micro-omgevingen te begrijpen, mag de blootstellingstijd na deze procedure 48 uur niet overschrijden. Elk theoretisch proces dat fluorescentie- of kleurgebaseerd gemeten kan worden, kan worden beoordeeld als functie van de micro-omgeving om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: hoe beïnvloeden verschillende micro-omgevingen de medicijnrespons in kankercellijnen? Dit kan worden gemeten aan de hand van veranderingen in apoptose en proliferatie.

Of hoe micro-omgevingen de differentiatie van progenitorcellen beïnvloeden.