Name: Drie-dimensionale Cultuur van de Cel Model voor het meten van de effecten van het interstitiële vocht Flow op tumorcel invasie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Leer een 3D-celcultuurmethode om de effecten van interstitiële vloeistofstroming op tumorcelinvasie te meten. Deze techniek gebruikt collageen en matrigel zonder gespecialiseerde apparatuur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Test Set-up <ol><li> Dooi een kleine hoeveelheid (&lt;500 ul) van Matrigel op ijs bij 4 ° C (ongeveer 2 uur). </li><li> Bereid gel recept (zie voorbeeld volumes in onderstaande tabel): 10 x PBS (1x in het totale volume), 1 N natriumhydroxide (gelijk aan 0.023 volumes van toegevoegde collageen, of per het collageen aanbevelingen van de fabrikant, indien van toepassing), Matrigel en collageen type I tot en met eindconcentraties van 1 mg / ml en 1,3 mg / ml (andere matrix formuleringen kunnen worden afhankelijk van celtype en experiment). </li></ol> Voorbeeld gel recept <table border="1"><tbody><tr><td> Componenten </td><td> Stock Concentratie </td><td> Eindconcentratie </td><td> Voeg volume </td></tr><tr><td> 10X PBS </td><td> 10X </td><td> 1X </td><td> 0.090 ml </td></tr><tr><td> Steriel water </td><td></td><td></td><td> 0.346 ml </td></tr><tr><td> 1N NaOH </td><td></td><td></td><td> 0.008 ml </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 9,90 mg / ml </td><td> 1 mg / ml </td><td> 0.101 ml </td></tr><tr><td> Rat staart type I collageen </td><td> 3,66 mg / ml </td><td> 1,3 mg / ml </td><td> 0.355 ml </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Meng componenten van de gel op ijs in dezelfde volgorde als hierboven incubeer uiteindelijke oplossing gedurende 1 uur bij 4 ° C. In onze ervaring van 1 uur incubatie voor cel zaaien resulteert in een meer uniform gelering van het collageen. Zorg ervoor dat u Matrigel en collageen te houden op het ijs te allen tijde en om zo snel mogelijk werken om gelering te voorkomen. </li><li> Place 12 mm diameter 8 urn poriën celkweek voegt in een 12-wells plaat met een steriele tang. </li><li> Tel cellen en hersuspenderen in serum-vrij medium met 5 x 10 6 cellen / ml (totaal volume te 10% van de gel oplossing). </li><li> Voeg 100 ul van de cel suspension tot 900 ul van gel-oplossing (laatste cel concentratie 5 x 10 5 cellen / ml) en meng goed door pipetteren lichtjes op en neer. </li><li> Voeg 150 pi van het uiteindelijke mengsel elk inzetstuk overgebracht in een 37 ° C, 5% CO2 incubator gedurende 30 minuten tot gel polymeriseert. </li><li> Met behulp van serum-vrije media, </li></ol><ul><li> Voeg 100 ul boven de gel en 1200 pi onder het inzetstuk voor het statische toestand. De vloeistof niveau binnen het inzetstuk en buiten de put is ongeveer gelijk er nauwelijks drukverschil over de gel en niet interstitiële stromen. </li><li> Voeg 100 ul onder de insert en 650 ul boven gel voor de doorstroming. Wees voorzichtig om eventuele luchtbellen onder de insert te vermijden, want zij zullen cellen voorkomen migreren door het membraan op deze locaties. Het drukverschil die door deze volumes ongeveer 1,3 cm H2O (of 1 mm Hg). </li></ul><ol start="9"><li> Plaats plaat in een 37° C, 5% CO2 incubator gedurende 24 uur. </li></ol> 2. Cel Beitsen en tellen <ol><li> Voeg 500 ul van PBS per putje 1X in nieuwe 24-wells plaat, die wordt gebruikt om de inzetstukken te wassen. </li><li> Verwijder het medium nog in het bovenste gedeelte van de stroom transwells en bepalen van het volume. Bereken de totale volume geëlueerd door aftrekken van de resterende hoeveelheid van het totale volume oorspronkelijk toegevoegde, 650 pi (dit wordt gebruikt debiet berekeningen, zie hieronder). Gebruik wattenstaafje de gel uit de inzetstukken en het bovenvlak van het membraan vegen niet-invasie cellen te verwijderen. Plaats de inserts in de 24-wells plaat met 1X PBS gedurende 15 s om inserts te wassen. </li><li> Verwijder PBS en voeg 500 pi 4% paraformaldehyde (PFA) onder ieder inzetstuk en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om het transmigrated cellen vast te stellen. </li><li> Verwijder de PFA en spoel een keer met 500 ul 1X PBS om de resterende fixeermiddel te verwijderen. </li><li> Voeg 500 pi of 0,5% Triton X-100-oplossing onder de inzetstukken Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur aan de cellen permeabilize. </li><li> Snij membranen uit de insert met behulp van een scheermesje en plaats in 100 ul van 2 ug / ml DAPI in 1X PBS-oplossing, let daarbij goed op de onderkant van het membraan naar beneden te plaatsen (transmigrated cellen naar beneden). </li><li> Wrap plaat aluminiumfolie en op een schudinrichting bij 150 rpm gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Was de membranen in 500 ul 1X PBS op shaker (herhaal 3 keer gedurende 10 minuten elk) om gratis DAPI te verwijderen. </li><li> Plaats membranen op glas dia&#39;s met transmigrated cellen naar boven, voeg de montage oplossing en dekglas. </li></ol> 3. Data-analyse <ol><li> Tel DAPI gekleurde kernen op 5 willekeurig gekozen locaties van elk membraan (blijf uit de buurt van de randen en gebruik een 10X of 20X objectief). </li><li> Bereken de gemiddelde cellen en het percentage verkregen invasie met de volgende formule: Percentage invasie = 100% x (gemiddelde cellen x membraanoppervlak) / (oppervlak van de microscoop beeld x aantal cellen gezaaid) Het percentage invasie kan worden genormaliseerd om enige controle staat (meestal de statische toestand) om te kunnen vergelijken tussen onafhankelijke experimenten. </li><li> Bereken de gemiddelde debiet: verdeel het totale geëlueerde volume in de stroom staat door de incubatietijd (bijv. 24 uur). </li><li> Bereken de gemiddelde stroomsnelheid: verdelen de gemiddelde stroomsnelheid door de doorsnede van de gel / membraan (in dit geval 60 mm 2). </li></ol> 4. Representatieve resultaten Om tumorcel invasie onder interstitiële te meten, we hebben onze 3-D stroming invasie test met behulp van MDA-MB-435S uitgezaaide melanoom cellen. Deze cellen hebben eerder aangetoond vallen in reactie op interstitiële fluïdumstroming 13-14. De cellen werden ingebed in een matrix bestaande uit 1,3 mg / ml rat tail pees collageen type I en 1 mg / ml Matrigel basaalmembraan matrix bij een uiteindelijke cel concentratie van 5 x 10 5 cellen / ml. Twee verschillende omstandigheden werden vergeleken: (1) gemiddeld interstitiële stroom = 0,1 um en -1 en (2) rusttoestand = geen meetbare debiet (figuur 1). Na 24 uur werden de cellen die bezet door de poriën van het membraan met DAPI kleurt bij celtellingen vergemakkelijken. Figuur 2 toont een representatief beeld van de bezette cellen. Onder brightfield alleen de poriën van het membraan zichtbaar. Met fluorescentie de DAPI gekleurde kernen werden gebruikt voor celtellingen en phalloidin gekleurde F-actine structuren werden gebruikt om het cellichaam (optioneel) visualiseren. Met behulp van een Student&#39;s t-test bij gelijke varianties, hebben we aangetoond dat interstitiële doorstroming aanzienlijk MDA-MB-435S celinvasie stijgt met 2,3-voudige boven een statische condities (p = 0,003) (Figuur 3). Dit corroborasysteem coördineert soortgelijke bevindingen (maar met verschillende matrix voorwaarden en daarom stroomsnelheden) met behulp van deze cellijn 13-14. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig1.jpg" /> Figuur 1. Schematische weergave van de 3-D interstitiële stroming invasie assay. Maak eerst gel oplossing met behulp van geschikte concentraties en volumes. Voeg cellen gel oplossing en overbrengen celcultuur inserts. Voeg ten slotte juiste volume van de media om elke voorwaarde en incubeer. Interstitiale fluïdum debiet wordt gestuurd door een vloeistofdruk kop. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig2.jpg" /> Figuur 2. Transmigrated MDA-MB-435S-cellen op de membraan. Binnengevallen cellen werden vastgesteld na onze interstitiële vloeistofstroom invasie test en gekleurd met DAPI en Alexa Fluor 488-geconjugeerd phalloidin te vergemakkelijken telling van binnengedrongen cellen; A) Afbeelding van het membraan onder helderveld; B) DAPI staINED kernen (in blauw), c) Alexa Fluor 488-phalloidin gekleurde F-actine (in groen). Schaal balk vertegenwoordigt 50 um. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4159/4159fig3.jpg" /> Figuur 3. Verhoogde invasie van MDA-MB-435S cellen onder stroom. Cell invasie na 24 uur aanzienlijk verbeterd door interstitiële flow (p = 0,003). De resultaten zijn genormaliseerd om de gemiddelde rusttoestand en waarden vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM van 6 celkweek inzetstukken.

<ol><li>Cichon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironmental+influences+that+drive+progression+from+benign+breast+disease+to+invasive+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mammary+Gland.+Biol.+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Microenvironmental influences that drive progression from benign breast disease to invasive breast cancer.</a> J. Mammary Gland. Biol. Neoplasia. 15, 389-3897 (2010).</li>
<li>Proia, D. A., Kuperwasser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroma%3A+tumor+agonist+or+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Stroma: tumor agonist or antagonist.</a> Cell Cycle. 4, 1022-1025 (2005).</li>
<li>Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+.Surg.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment and progression.</a> J .Surg. Oncol. 103, 468-474 (2011).</li>
<li>Provenzano, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+density+promotes+mammary+tumor+initiation+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression.</a> BMC Med. 6, 11(2008).</li>
<li>Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Paszek, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+homeostasis+and+the+malignant+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional homeostasis and the malignant phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Levental, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+crosslinking+forces+tumor+progression+by+enhancing+integrin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling.</a> Cell. 139, 891-906 (2009).</li>
<li>Butler, T. P., Grantham, F. H., Gullino, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bulk+transfer+of+fluid+in+the+interstitial+compartment+of+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Bulk transfer of fluid in the interstitial compartment of mammary tumors.</a> Cancer Res. 35, 3084-3088 (1975).</li>
<li>Dafni, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+vascular+endothelial+growth+factor+165+drives+peritumor+interstitial+convection+and+induces+lymphatic+drain%3A+magnetic+resonance+imaging%2C+confocal+microscopy%2C+and+histological+tracking+of+triple-labeled+albumin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Overexpression of vascular endothelial growth factor 165 drives peritumor interstitial convection and induces lymphatic drain: magnetic resonance imaging, confocal microscopy, and histological tracking of triple-labeled albumin.</a> Cancer Res. 62, 6731-6739 (2002).</li>
<li>Chary, S. R., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+interstitial+convection+and+diffusion+of+albumin+in+normal+and+neoplastic+tissues+by+fluorescence+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of interstitial convection and diffusion of albumin in normal and neoplastic tissues by fluorescence photobleaching.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 5385-5389 (1989).</li>
<li>Heldin, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+interstitial+fluid+pressure+-+an+obstacle+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">High interstitial fluid pressure - an obstacle in cancer therapy.</a> Nat. Rev. Cancer. 4, 806-813 (2004).</li>
<li>Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microvasculature+and+microenvironment%3A+novel+insights+through+intravital+imaging+in+pre-clinical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Tumor microvasculature and microenvironment: novel insights through intravital imaging in pre-clinical models.</a> Microcirculation. 17, 206-225 (2010).</li>
<li>Shields, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+chemotaxis+as+a+mechanism+of+tumor+cell+homing+to+lymphatics+via+interstitial+flow+and+autocrine+CCR7+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Autologous chemotaxis as a mechanism of tumor cell homing to lymphatics via interstitial flow and autocrine CCR7 signaling.</a> Cancer Cell. 11, 526-538 (2007).</li>
<li>Shieh, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cell+invasion+is+promoted+by+interstitial+flow-induced+matrix+priming+by+stromal+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor cell invasion is promoted by interstitial flow-induced matrix priming by stromal fibroblasts.</a> Cancer Res. 71, 790-800 (2011).</li>
<li>Shi, Z. D., Wang, H., Tarbell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparan+sulfate+proteoglycans+mediate+interstitial+flow+mechanotransduction+regulating+MMP-13+expression+and+cell+motility+via+FAK-ERK+in+3D+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Heparan sulfate proteoglycans mediate interstitial flow mechanotransduction regulating MMP-13 expression and cell motility via FAK-ERK in 3D collagen.</a> PLoS One. 6, e15956(2011).</li>
<li>Fleury, M. E., Boardman, K. C., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+morphogen+gradients+by+subtle+interstitial+flow+and+matrix+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Autologous morphogen gradients by subtle interstitial flow and matrix interactions.</a> Biophys J. 91, 113-121 (2006).</li>
<li>Miteva, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmural+flow+modulates+cell+and+fluid+transport+functions+of+lymphatic+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Transmural flow modulates cell and fluid transport functions of lymphatic endothelium.</a> Circ. Res. 106, 920-931 (2010).</li>
<li>Ng, C. P., Hinz, B., Swartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+fluid+flow+induces+myofibroblast+differentiation+and+collagen+alignment+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Interstitial fluid flow induces myofibroblast differentiation and collagen alignment in vitro.</a> J. Cell. Sci. 118, 4731-4739 (2005).</li>
<li>Kunder, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-derived+particles+deliver+peripheral+signals+to+remote+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Mast cell-derived particles deliver peripheral signals to remote lymph nodes.</a> J. Exp. Med. 206, 2455-2467 (2009).</li>
<li>Helm, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+interstitial+flow+and+VEGF+directs+capillary+morphogenesis+in+vitro+through+a+gradient+amplification+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Synergy between interstitial flow and VEGF directs capillary morphogenesis in vitro through a gradient amplification mechanism.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15779-15784 (2005).</li>
<li>McGuire, P. G., Seeds, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+plasminogen+activator+with+a+reconstituted+basement+membrane+matrix+and+extracellular+macromolecules+produced+by+cultured+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">The interaction of plasminogen activator with a reconstituted basement membrane matrix and extracellular macromolecules produced by cultured epithelial cells.</a> J Cell Biochem. 40, 215-227 (1989).</li>
<li>Kleinman, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+type+IV+procollagen%2C+laminin%2C+and+heparan+sulfate+proteoglycan+from+the+EHS+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of type IV procollagen, laminin, and heparan sulfate proteoglycan from the EHS sarcoma.</a> Biochemistry. 21, 6188-6193 (1982).</li>
<li>Haessler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+dynamics+of+breast+cancer+cells+in+a+tunable+3D+interstitial+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Migration dynamics of breast cancer cells in a tunable 3D interstitial flow chamber.</a> Integr. Biol. (Camb). , (2011).</li>
<li>Polacheck, W. J., Charest, J. L., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+flow+influences+direction+of+tumor+cell+migration+through+competing+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Interstitial flow influences direction of tumor cell migration through competing mechanisms.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 11115-11120 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Hier hebben we beschreven een methode voor het kwantificeren van het effect van de interstitiële doorstroming op de tumorcel invasie, met behulp van cellen ingebed in een 3-D matrix in een cel cultuur insert. Deze en soortgelijke methoden toegepast om het effect van interstitiële stroom bestuderen op verschillende celtypen 13-15, 17. Onze aanpak bootst een deel van de matrix micro-omgeving van de tumor met behulp van type I collageen en Matrigel welke eiwitten in de basale membraan van het epitheel weefsel en...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Collageen (Rat Tail) </td><td> BD </td><td> 354236 </td><td> Houd steriel </td></tr><tr><td> Millicell celkweek insert </td><td> Millipore </td><td> PI8P01250 </td><td> 8 urn poriëngrootte polycarbonaat </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD </td><td> 354234 </td><td> Houd steriel </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 100M-8202 </td><td> 10x voor het bereiden gel oplossing 1x voor wasstappen </td></tr><tr><td> Natriumhydroxide, 1.0N Solution </td><td> Sigma Aldrich </td><td> S2770 </td><td> Houd steriel </td></tr><tr><td> DMEM 1X </td><td> CellGro </td><td> 10 tot 013-CV </td><td> Houd steriel </td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Atlanta Biologicals </td><td> 511150 </td><td> Houd steriel </td></tr><tr><td> Penicilline Streptomycine </td><td> CellGro </td><td> 30002CI </td><td> Houd steriel </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> X100-500 ml </td><td> 0,5% in PBS </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Fisher Scientific </td><td> 04042-500 </td><td> 4% PBS </td></tr><tr><td> Gedeïoniseerd water </td><td></td><td></td><td> Houd steriel </td></tr><tr><td> 4 &#39;,6-diaminido-2-fenylindool (DAPI) </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0215757401 </td><td> 1 mg / ml stockoplossing </td></tr><tr><td> Montage Oplossing </td><td> Thermo Scientific </td><td> TA-030-FM </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine-EDTA </td><td> CellGro </td><td> 25 tot 052-CI </td><td> Houd steriel </td></tr></tbody> &lt;/ Table&gt;

drie-dimensionale cultuur van de cel model voor het meten van de effecten van het interstitiële vocht flow op tumorcel invasie

Three-dimensional Cell Culture Model for Measuring the Effects of Interstitial Fluid Flow on Tumor Cell Invasion

De groei en progressie van solide tumoren meest afhangen van de eerste transformatie van de kankercellen en hun reactie op stroma-geassocieerde signalering in de tumor micro 1. Eerder heeft onderzoek gedaan naar de tumor micro-omgeving zich vooral gericht op de tumor-stroma interacties 1-2. Echter, de tumor micro-omgeving omvat ook een aantal biofysische krachten, waarvan de gevolgen nog steeds slecht begrepen. Deze krachten zijn biomechanische gevolgen van de groei van tumoren die leiden tot veranderingen in genexpressie, celdeling, differentiatie en invasie 3. Matrix dichtheid 4, stijfheid 5-6, en de structuur 6-7, interstitiële vloeistofdruk 8, en interstitiële vloeistofstroming 8 zijn allemaal veranderen tijdens de voortgang van kanker. Interstitiële fluïdumstroom in het bijzonder hoger in tumoren ten opzichte van normale weefsels 8-10. De geschatte interstitiële vloeistof flow snelheden werden gemeten en in het gebied van 0,1-3 um en -1, afhankelijk tumorgrootte en differentiatie 9, 11. Dit is te wijten aan hoge interstitiële druk door tumor geïnduceerde angiogenèse-en verhoogde vasculaire permeabiliteit 12. Interstitiale fluïdum debiet is aangetoond invasie van kankercellen 13-14 vasculaire fibroblasten en gladde spiercellen 15 verhogen. Dit invasie kan het gevolg autologe chemotactische gradiënten die rond cellen 3-D 16 of meer matrix metalloproteinase (MMP) expressie 15 chemokine secretie en cell adhesion molecule expressie 17. Echter, het mechanisme waardoor cellen voelen stroming niet goed begrepen. Naast het veranderen van het gedrag van tumorcellen, interstitiële vloeistofstroming moduleert de werking van andere cellen in de tumor micro-omgeving. Het is gekoppeld met (een) rijden differentiatie van fibroblasten in tumor-bevorderende myofibroblasts 18 (b) transporteren van antigenen en andere oplosbare factoren lymfeknopen 19 en (c) moduleren lymfatische endotheelcellen morfogenese 20. De techniek die hier stelt interstitiële vloeistofstroom op cellen in vitro en kwantificeert het effect ervan op invasie (figuur 1). Deze methode is gepubliceerd in meerdere studies het effect van de vloeistofstroom meten stromale en kankercel invasie 13-15, 17. Door de matrixsamenstelling, celtype en celconcentratie Deze methode kan worden toegepast op andere ziekten en fysiologische systemen om de effecten van interstitiële stroom bestuderen op cellulaire processen zoals invasie, differentiatie, proliferatie en genexpressie.

Interstitiële vloeistof stroom wordt verhoogd in solide tumoren en kan moduleren tumorcel invasie. Hier beschrijven een techniek interstitiële fluïdumstroming toepassing cellen ingebed in een matrix en meet de gevolgen celinvasie. Deze techniek kan gemakkelijk worden aangepast aan andere te bestuderen.

Drie-dimensionale Cultuur van de Cel Model voor het meten van de effecten van het interstitiële vocht Flow op tumorcel invasie

De groei en progressie van de meeste solide tumoren zijn afhankelijk van de initiële transformatie van de kankercellen en hun respons op stroma-geassocieerde signalering ...

Het doel van deze procedure is om in 3D gekweekte cellen bloot te stellen aan interstitiële vloeistofstroom en om de door de stroom gemedieerde effecten op celinvasie te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een gellopossing voor te bereiden die bestaat uit type one collagen en matrigel. De tweede stap is het toevoegen van een gespecificeerde concentratie cellen aan de gellopossing.Vervolgens wordt de celsuspensie toegevoegd aan een transwell met een diameter van 12 millimeter en een poriegrootte van acht micron, en geïncubeerd bij 37 °C totdat de matrix stolt. De laatste stap bij het opzetten van de assay is het toevoegen van specifieke hoeveelheden medium aan de transwells om statische en flowcondities te creëren. 24 uur later worden de transwellmembranen gefixeerd, gekleurd en gevisualiseerd voor de kwantificering van het aantal geïnvadeerde cellen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals microfluïdische interstitiële stroomkamers, is dat er geen pompen of gespecialiseerde apparatuur nodig zijn en dat onderzoekers meerdere condities of behandelingen eenvoudig en snel kunnen testen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in cell

three-dimensional-cell-culture-model-for-measuring-effects

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Modellen van de tumorcel invasie in drie-dimensionale extracellulaire matrix beter aansluiten bij...

Modeling and Imaging 3-Dimensionale Collectief Cell Invasion

This video demonstrates a method to establish a three-dimensional tumor spheroid and T cell co-culture. An agarose cast with microwells containing tumor spheroids is prepared, followed by the addition of T cells. After incubation, this setup allows studying the interaction of T cells with tumor spheroids in a controlled three-dimensional environment.

A Three-Dimensional Co-culture Model of Infiltrating T Cells in Tumor Spheroids

Dit artikel geeft gedetailleerde methodologieën voor het gebruik van driedimensionale (3D) assays om borstkanker cel invasie kwantificeren. Concreet bespreken we het nodig om dergelijke assays procedures, kwantificering en gegevensanalyse, alsook werkwijzen voor het verlies van membraan integriteit die ontstaat wanneer cellen binnendringen onderzoeken.

Kwantificering van de Breast Cancer Cell Invasiviteit met een drie-dimensionale (3D) Model

Hier presenteren we een protocol voor co-cultuur in drie dimensies, wat nuttig is voor het onderzoeken van interacties tussen meerdere cellen en het beïnvloeden van het gedrag van kankercellen door de extracellulaire matrix. In dit experimentele model worden kankercellen gekweekt op collageengels ingebed met humane kanker-geassocieerde fibroblasten.

Driedimensionale Co-cultuur Model voor Tumor-stromale Interactie

Invasie van omliggende normale weefsels is een typerend kenmerk van kwaadaardige tumoren. We bieden hier een eenvoudige, semi-geautomatiseerde microplaattest van invasie in een natuurlijke 3D biomatrix die met een aantal modellen van gevorderde menselijke kankers is geëxemplifeerd.

Driedimensionale (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Deze methode evalueert de invasie van kankercellen uit sferoïden in een omringende 3D-matrix.  Sferoïden worden gegenereerd via de hanging drop-kweekmethode en vervolgens ingebed in een matrix bestaande uit basement membraanmaterialen en type I collageen.  Invasie uit de sferoïden wordt vervolgens gemonitord.

Een Cancer Cell Sferoïde Assay om Invasion beoordelen in een 3D-instelling

Kankercellen worden ingebed in een collageengel en vervolgens tussen een acellulair fibrinegel gedaan om een 3D-kweeksysteem te genereren waarin de invasiviteit en vorming van satelliettumoren kunnen worden gemonitord.

Driedimensionale Culture Assay te ontdekken Cancer Cell Invasiviteit en Satellite tumorvorming

De processen die blaas kanker invasie vertegenwoordigen mogelijkheden voor biomerker en therapeutische ontwikkeling. Hier presenteren we een blaas kanker invasie model waarin 3D-cultuur tumor spheroïden, time-lapse beeldvorming en confocale microscopie. Deze techniek is handig voor het definiëren van de kenmerken van de invasieve proces en voor het screenen van therapeutische agenten.

3D-celcultuur voor het bestuderen van de invasie en evalueren van Therapeutics in blaaskanker

Het doel van dit protocol is om een 3D in vitro model te vestigen om de differentiatie van met kanker geassocieerde fibroblasten (CAFs) in een tumor bulk-achtige omgeving te bestuderen, die kan worden aangepakt in verschillende analysesystemen, zoals immunofluorescentie, transcriptionele analyse en Life Cell Imaging.

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

De gepresenteerde aanpak evalueert tegelijkertijd kankercelinvasie in 3D-sferoïde testen en T-celcytotoxiciteit. Sferoïden worden gegenereerd in een steiger-vrije agarose multi-microwell gegoten. Co-cultuur en inbedding in type I collageen matrix worden uitgevoerd in hetzelfde apparaat dat het mogelijk maakt om kankercel invasie en T-cel gemedited cytotoxiciteit te controleren.

Monitoring Cancer Cell Invasion en T-Cell Cytotoxicity in 3D Cultuur

Invasie is een belangrijk biologisch fenomeen bij de ontwikkeling en progressie van kanker. Dit proces wordt beïnvloed door niet-neoplastische cellen en componenten van de micro-omgeving van de tumor. Het doel van deze studie is het beschrijven van een alternatieve methode voor het analyseren van tumorcelinvasie in vitro met behulp van driedimensionale (3D) culturen.

Alternatieve strategie om in vitro celinvasie van 3D-culturen te analyseren

Leer een 3D-celcultuurmethode om de effecten van interstitiële vloeistofstroming op tumorcelinvasie te meten. Deze techniek gebruikt collageen en matrigel zonder gespecialiseerde apparatuur.

Drie-dimensionale Cultuur van de Cel Model voor het meten van de effecten van het interstitiële vocht Flow op tumorcel invasie

Meer video's verkennen