Drie-dimensionale Cultuur van de Cel Model voor het meten van de effecten van het interstitiële vocht Flow op tumorcel invasie

Het doel van deze procedure is om cellen die in 3D zijn gekweekt bloot te stellen aan interstitiële vloeistofstroming en om de door stroming gemedieerde effecten op celinvasie te kwantificeren. Dit wordt bereikt door eerst een geloplossing te bereiden die bestaat uit type één collageen en matrigel. De tweede stap is het toevoegen van een opgegeven concentratie cellen aan de geloplossing.

Vervolgens wordt de celsuspensie toegevoegd aan een transwell met een diameter van 12 millimeter, een poriegrootte van acht micron en geïncubeerd bij 37 graden Celsius totdat de matrix is gaan geleren. De laatste stap in de opstelling van de assay is het toevoegen van specifieke hoeveelheden medium aan de transwells om statische en stromingsomstandigheden te creëren. 24 uur later worden de transwellmembranen gefixeerd, gekleurd en gevisualiseerd voor de kwantificering van het aantal geïnvadeerde cellen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals microfluïdische, interstitiële stromingskamers, is dat het geen pompen of gespecialiseerde apparatuur vereist en dat het onderzoekers in staat stelt om gemakkelijk en snel meerdere omstandigheden of behandelingen te testen. Hoewel deze methode inzicht kan geven in cellulaire migratie en invasie, kan het ook worden gebruikt of toegepast om het effect van interstitiële vloeistofstroming op ander relevant cellulair gedrag te bestuderen, zoals eiwitexpressie, celproliferatie en veranderingen in celsignalering. Het demonstreren van deze procedure zal een LIMA two chaa zijn.

Een afstudeerstudent in mijn laboratorium begint deze procedure door een kleine aliquot matri-gel op ijs bij vier graden Celsius te werpen. Vervolgens bereidt u het gelrecept voor met PBS steriele water, natriumhydroxide, matrigel en rattenstaart type één collageen. Meng vervolgens de componenten van het gel op ijs in dezelfde volgorde en incubeer de uiteindelijke oplossing gedurende één uur bij vier graden Celsius.

Plaats nu een cellcultuurinsert met een diameter van 12 millimeter en een microporegrootte van acht micrometer in een 12-wellplaat met behulp van een paar gesteriliseerde pincetten. Tel vervolgens de cellen en suspendeer ze opnieuw in serumvrij medium bij vijf keer 10 tot de zes cellen per milliliter, voeg 100 microliter celsuspensie toe aan 900 microliter geloplossing. Meng ze daarna grondig door voorzichtig op en neer te pipetteren.

Voeg vervolgens 150 microliter van de uiteindelijke mengsel toe aan elke insert. Breng vervolgens de inserts over naar een 37 graden Celsius 5% koolstofdioxide-incubator gedurende 30 minuten totdat het gel is gepolymeriseerd. Voor de statische conditie voegt u 100 microliter van het serumvrije medium bovenop het gel en 1.200 microliter onder de insert toe.

De vloeistofpeil binnen en buiten de insert in de well moet ongeveer gelijk zijn, wat resulteert in een minimale drukverschil over het gel en geen interstitiële stroming. Voor de stromingsconditie voegt u 100 microliter van het serumvrije medium onder de insert en 650 microliter boven het gel toe. Probeer tegelijkertijd geen luchtbellen te creëren onder de insert, omdat deze cellen ervan weerhouden om door de membraan op deze locaties te migreren.

Plaats vervolgens de plaat in een 37 graden Celsius 5% koolstofdioxide-incubator gedurende 24 uur. Voeg in deze stap 500 microliter van eenmaal PBS per well toe aan een nieuwe 24-wellplaat voor het wassen van de inserts. Verwijder vervolgens het medium dat overblijft in het bovenste gedeelte van de flow trends wells.

Gebruik vervolgens katoenen staafjes om het gel van de inserts te verwijderen. Veeg de bovenkant van het membraanoppervlak af om niet-VA cellen te verwijderen. Was vervolgens de inserts door ze 15 seconden in de 24-wellplaat met eenmaal PBS te plaatsen.

Verwijder vervolgens het PBS en voeg 500 microliter van 4% para formaldehyde toe onder elke insert. Incubeer ze gedurende 30 minuten op kamertemperatuur voor het fixeren van de transgemigreerde cellen. Verwijder vervolgens de PFA en spoel ze eenmaal met 500 microliter eenmaal PBS om het resterende fixatief te verwijderen.

Voeg vervolgens 500 microliter van 0,5% Triton X 100 oplossing toe onder de inserts en incubeer gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Om de cellen te permeabiliseren, snijdt u de membranen uit de insert met een scheermesje. Plaats ze vervolgens in 100 microliter van twee microgram per milliliter DPI in eenmaal PBS oplossing.

Zorg ervoor dat u de onderkant van het membraan naar beneden richt. De DPI-oplossing moet enkele minuten voor gebruik worden bereid en in het donker worden bewaard. Verpak nu de plaat in aluminiumfolie.

Plaats het op een shaker bij 150 RPM gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Was vervolgens de membranen in 500 microliter eenmaal PBS en plaats ze terug op de shaker gedurende 10 minuten. Herhaal de wassing nog twee keer om vrij jy te verwijderen.

De volgende stap is om de membranen op glazen platen te plaatsen met de transgemigreerde cellen naar boven. Voeg montageoplossing toe aan de membranen. Bedek ze vervolgens met deksels.

Tel vervolgens de Dappy-kleurstof op de kernen en bereken het aantal geïnvaseerde cellen volgens het bijbehorende manuscript. Deze figuur toont de transgemigreerde MDA MB 4 35 s cellen op het membraan. De geïnvaseerde cellen werden gefixeerd na de interstitiële vloeistofstroming invasie assay en gekleurd met DPI en Alexa Fluor 4 88 geconjugeerd foid om het tellen van geïnvaseerde cellen te vergemakkelijken.

Dit is het membraan onder lichtveld en hier zijn de Dappy-kleurstof kernen. De met Alexa Fluor 4 88 geconjugeerde foid in gestikte F-actine zijn hier getoond. Deze grafiek toont aan dat de invasie van MDA MB 4 35 s metastatische melanoomcellen significant werd verbeterd door interstitiële stroming.

Na 24 uur worden de resultaten genormaliseerd naar het gemiddelde van de statische