Lensfree On-chip Tomografische Microscopie Gebruikmakend van Multi-angle Verlichting en Pixel Super-resolutie

Het algemene doel van deze procedure is om lensvrije driedimensionale on-chip beeldvorming van biologische specimens over een groot beeldvolume te bereiken. Dit wordt gerealiseerd door eerst het monster direct op de sensorchip te plaatsen en gedeeltelijk coherente verlichting te bieden. De tweede stap is om de lichtbron zijdelings over verschillende posities te verschuiven om opnamen te maken.

Holografische beelden van het monster met subpixelverschuiving. Volgende subpixelverschuivingen. Holografische beelden worden geregistreerd bij veelvouden van de belichting voor tomografische beeldvorming.

De laatste stap is de gegevensverwerking, waarbij de verkregen dataset digitaal wordt gereconstrueerd om uiteindelijk driedimensionale tomografische beelden van het monster te verkrijgen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals conventionele lichtmicroscopie, is dat het high-throughput imaging biedt in een compacte architectuur. Dit maakt ons platform bijzonder geschikt voor integratie met Lebanon chip-platforms.

In dit verslag wordt de basisopstelling voor beeldvorming beschreven voor een benchtop-implementatie gericht op tomografie van statische monsters. Een monochromator met een xenonlamp werd ingesteld om een output te genereren met een spectrale breedte van ongeveer 1 tot 10 nanometer rond een centrumgolflengte van 450 tot 650 nanometer. Deze gedeeltelijk coherente output wordt vervolgens gekoppeld aan een multi-mode optische vezel om gedeeltelijk coherent licht naar het systeem te geleiden.

De optische vezel is gemonteerd op een gemotoriseerde rotatietafel om de belichtingshoek te variëren. De gemotoriseerde tafel, waaraan de lichtbron is bevestigd, is gemonteerd op een tweedimensionale lineaire XY-tafel, die wordt gebruikt om verschuivingen in het vlak van de lichtbron bij een gegeven hoek voor detectie te realiseren. Er wordt gebruikgemaakt van een CMOS-sensorschikking van vijf megapixels met een pixelgrootte van 2,2 microns.

De detector wordt gebruikt om holografische beelden van monsters met een breed gezichtsveld vast te leggen. Het is essentieel dat de sensorarray zich in hetzelfde axiale vlak bevindt als de rotatieas van de lichtbron, om te controleren of de sensor voldoende licht ontvangt bij grote verlichtingshoeken. Hoewel lensvrije optische tomografie een verscheidenheid aan objecten kan afbeelden, zoals cellen en micro-organismen, worden de basisprincipes hier gedemonstreerd door middel van driedimensionale microscopie van een monster van een zeepissepot met behulp van een scalpel of een spatel.

Neem een klein stukje AGA uit de Petrischaal met de kweek van de sealer-organen. Een kubusvormig stukje van enkele millimeters in elke dimensie bevat honderden nematoden. Plaats het kleine stukje agar in een polypropyleen buisje met één milliliter gedeïoniseerd water.

Vortex voorzichtig gedurende 30 seconden tot één minuut. Na 10 tot 15 minuten zou de worm uit de agar in het gedeïoniseerde water moeten kruipen. Let op dat de wormen hier te klein zijn om te zien om de wormen tijdelijk te immobiliseren en één milliliter van vijf tot 10 millimolair Lima.

Los de oplossing op en wacht 10 minuten. Pipetteer vijf tot 10 µL monster vanaf de bodem van het vial en plaats dit tussen twee dekglasjes. Dit monster, dat een groot aantal tijdelijk geïmmobiliseerde wormen bevat, kan op de detector worden geplaatst om de gegevensverwerving te starten.

Voor demonstratiedoeleinden worden de stappen voor beeldacquisitie van een typisch lensvrij optisch tomografie- of LOT-experiment in deze sectie samengevat; het volledige proces is echter geautomatiseerd met behulp van de speciaal ontwikkelde LabVIEW-interface. Om met de handmatige stappen te beginnen, stelt u de beginhoek van de rotatietabel in op -50 graden, waarbij nul graden overeenkomt met de verticale positie van de lichtbron. Stel de beginpositie van de XY-tafel in op 0,0, wat de homepositie is.

Pas de belichtingstijd van de detector aan om het dynamisch bereik optimaal te benutten, zodat het beeld zo helder mogelijk is zonder verzadigde pixels, zonder de hoek van de rotatietafel te wijzigen. Leg negen beelden vast voor elk beeld. Verplaats de XY-tafel naar een nieuwe positie in een raster van drie bij drie, zodat elk beeld ongeveer een kwart pixel verschuift ten opzichte van het vorige.

Afhankelijk van het type object en de signaal-ruisverhouding kan het verkrijgen van meer beelden per hoek de resolutie verbeteren. Nadat er negen beelden bij de beginhoek zijn verzameld, wordt de positie van de XY-tafel teruggezet naar de nulpositie. Verhoog vervolgens de hoek van de rotatietafel in stappen van twee graden totdat positief 50 graden is bereikt.

Herhaal na elke stap bij elke nieuwe hoek de beschreven stappen. De hoekstappen kunnen fijner of grover zijn, afhankelijk van de optimalisatie van de acquisitietijd ten opzichte van de beeldresolutie. Na de gegevensacquisitie wordt een set van 459 beelden verkregen, bestaande uit negen subpixel-verschoven beelden voor elk van de 51 verschillende belichtingshoeken.

Elke set van negen afbeeldingen wordt digitaal verwerkt met behulp van pixel-superresolutie-algoritmen om één projectie met een hoge resolutie te verkrijgen. De resultaten van de pixel-superresolutie per hologram per hoek worden vervolgens digitaal gereconstrueerd om 51 projectiebeelden te verkrijgen. De gegevensverwerking wordt hier getoond met behulp van een laptop.

De reconstructie zou minder dan één seconde in beslag nemen voor het volledige gezichtsveld met behulp van grafische verwerkingseenheden. Deze set van 51 projectiebeelden wordt vervolgens teruggeprojecteerd met behulp van de Tom OJA-plug-in. Voor Image J worden de projectiebeelden eerst in Image J geladen, waarna de Tom OJ-plug-in wordt aangeroepen.

Een opzoektabel die de kijkhoek voor elk projectiebeeld biedt, wordt geladen in OJ. Met behulp van de gewogen terugprojectiemethode kunnen driedimensionale tomografische beelden van het specimen worden verkregen. Het grote gezichtsveld van lensvrije optische tomografie wordt hier gedemonstreerd doordat het monster direct bovenop de detectorgroep wordt geplaatst. Holografische beelden van de objecten kunnen worden geregistreerd over een gezichtsveld van 24 millimeter vierkant, wat verder kan worden vergroot door gebruik te maken van nieuwe detectorgroepen met grotere actieve gebieden.

Hoewel de pixelgrootte van de detectoraarray de resolutie van de vastgelegde holografische beelden beperkt, verzachten technieken voor pixel-superresolutie dit probleem; hier worden pixel-superresolutie-hologrammen getoond, samen met de gereconstrueerde projectiebeelden die een sub-micrometer ruimtelijke resolutie bieden voor drie verschillende belichtingshoeken. De projectiebeelden kunnen worden gecombineerd met behulp van tomografische beeldreconstructietechnieken om TOM-doorsneden van het specimen te berekenen. Drie coupes in het XY-vlak door het anterieure deel van de worm worden hier getoond, waarbij de faryngeale buis alleen zichtbaar is in de coupe bij Z equals 8 µm, zoals verwacht bij deze ruwweg cilindrische structuur met een buitenste diameter van ongeveer 5 µm.

Bovendien toont het doorsnedebeeld in het XZ-vlak duidelijk de grenzen van de worm en de faryngeale buis erin, wat een succesvolle 3D-beeldvorming van de farynx demonstreert. Met verdere ontwikkeling kan deze techniek de weg vrijmaken voor onderzoekers om driedimensionale microscopie uit te voeren over beeldvolumes van buizen van tientallen millimeters. Daarom kan lensvrije optische tomografie een nuttig instrument zijn voor high-throughput beeldvormingstoepassingen in lab-on-a-chip-platforms.