Name: Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Leer hoe je DNA-reparatieactiviteit in celkernlysaten kwantitatief meet met behulp van laesie-specifieke moleculaire beacons. Deze methode biedt real-time kinetische analyse van glycosylase- en AP-endonuclease-activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Pittsburgh Foundation en de National Institutes of Health (NIH) [GM087798, CA148629, ES019498] om RWS. Ondersteuning voor de UPCI Lentivirale faciliteit werd verstrekt aan RWS door de Cancer Support Grant van de National Institutes of Health [P30 CA047904]. Ook is steun verleend door de Universiteit van Pittsburgh Afdeling Farmacologie &amp; Chemical Biology naar de DS. Ook is steun verleend door de ESTRO aan CV.

<ol><li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li>
<li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li>
<li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li>
<li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O%28+6%29-methylguanine+DNA+methyltransferase%2C+methylpurine+DNA+glycosylase%2C+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities%3A+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li>
<li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li>
<li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li>
<li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li>
<li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+European+journal+of+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li>
<li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li>
<li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+probes%22%5BJournal%5D)">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li>
<li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li>
<li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li>
</ol>

RWS is een wetenschappelijk adviseur voor Trevigen, Inc De rest van de auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten.

Er zijn meer dan 600 citaten gebruik van de term &#39;moleculaire baken&#39; voor het detecteren en kwantificeren van tal van moleculen en enzymatische activiteiten, waaronder helicase activiteit 6, DNA-polymerase-activiteit 7,8, DNA-ligase activiteit 9, telomerase activiteit 10, DNA photolyase activiteit 11 en DNA / RNA hybriden 12, onder vele anderen. Naast het gebruik van moleculaire bakens voor het meten van het DNA bovengenoemde activiteiten, hebben ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Kalium Chloride </td><td> Visser </td><td> P217-500 </td><td> Moleculair-biologische kwaliteit </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Visser </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Visser </td><td> BP229-1 </td><td> Moleculair-biologische kwaliteit </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Visser </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-oplossing </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-zout </td><td> Sigma </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> Kalium Hydroxide </td><td> Sigma </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μM filter </td&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer Dialyse Producten </td><td> Doorboren </td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> Injectiespuit </td><td> Visser </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Naald </td><td> Visser </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml PCR </td><td> Visser </td><td> 05-408-129 </td><td> Zwart </td></tr><tr><td> 15 ml Falcon buizen </td><td> Visser </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBuster Protein Extraction Kit </td><td> Calbiochem </td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Molecular Beacons </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRad eiwit assay kleurstof remiddel concentraat </td><td> BioRad </td><td> Cat # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve, real-time analyse van base excisie reparatie activiteit in cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire beacons

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in celkernen lysaten met behulp van base excisie reparatie (BER) moleculaire bakens. Het substraat (baken) bestaat uit een deoxyoligonucleotide met een base laesie met een 6-carboxyfluoresceïne (6 FAM) groep geconjugeerd aan het 5&#39;-uiteinde en een Dabcyl groep geconjugeerd aan het 3&#39;-uiteinde van het oligonucleotide. De BER moleculaire baken is 43 basen lang en de sequentie is ontworpen om de vorming van een lusstructuur stam-met 13 nucleotiden in de lus en 15 basenparen in de steel 1,2 bevorderen. Wanneer gevouwen deze configuratie de 6-FAM groep gedoofd door Dabcyl een niet fluorescerende wijze via Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 3,4. Het letsel is zodanig dat na base laesie verwijderen en onderdeel splitsing de resterende 5 base oligonucleotide met de 6-FAM groep vrijkomt van de steel. Laat eennd onthechting van de quencher (Dabcyl) resulteert in een toename van de fluorescentie die evenredig is aan het niveau van DNA-herstel. Door het verzamelen van meerdere leest van de fluorescentie waarden, real-time beoordeling van de BER-activiteit is mogelijk. Het gebruik van standaard kwantitatieve real-time PCR-instrumenten maakt de gelijktijdige analyse van een groot aantal monsters. Het ontwerp van deze BER moleculaire bakens, met een enkele base laesie, vatbaar is voor kinetische analyses, BER kwantificering en validatie-remmer en is aangepast voor de kwantificering van DNA-reparatie-activiteit in het weefsel en tumor cellysaten of met gezuiverde eiwitten. De analyse van de groepsvrijstellingsverordening activiteit in de tumor lysaten of weefsel zuigt het gebruik van deze moleculaire beacons van toepassing kunnen zijn om functionele biomarker-metingen. Verder is de analyse van de BER activiteit met gezuiverde eiwitten met behulp van deze kwantitatieve test voor een snelle, high-throughput methode voor de identificatie en validatie van de BER-remmers.

We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in cel nucleaire lysaten. De test levert de tarieven van de DNA-reparatie-activiteit vatbaar zijn voor kinetische analyse en is aanpasbaar voor de kwantificering van DNA Repair activiteit in weefsel en tumor lysaten of met gezuiverde eiwitten.

Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons

We beschrijven een methode voor de kwantitatieve real-time meting van DNA-glycosylase- en AP-endonuclease-activiteiten in celkernlysaten met behulp van base ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de snelheden van DNA-herstel en celkernextracten in real-time te meten met behulp van moleculaire bakens die fluoresceren zodra ze zijn hersteld. Moleculaire bakens voor basische excisieherstel bestaan uit deoxy-oligonucleotiden in een stam-lusstructuur die een enkele basislaesie bevat, met zes curve oxy fluoresceïne-eenheden geconjugeerd aan de 5'-uiteinden en dil-eenheden geconjugeerd aan de 3'-uiteinden wanneer deze zijn gevouwen. De six fam-eenheid wordt op een niet-fluorescerende wijze gedoofd door dab sil via Förster-resonantie-energietransfer.Om de DNA-reparatieactiviteit te beoordelen, worden beacons geïncubeerd met nucleaire celextracten die reparatie-enzymen bevatten. DNA-glycosylase herkent en verwijdert de DNA-laesie in de beacon. De resulterende ABA-sites zijn substraten voor AP-endonucleasené een of ape één. Na herkenning splitst APE één de DNA-backbone bij de ABA-site, waardoor het DNA dat de six fam bevat vrij kan dissociëren van de hairpin.Loskoppeling van de quencher resulteert in een toename van de fluorescentie die proportioneel is aan het niveau van DNA-herstel en in real-time kan worden beoordeeld met behulp van een kwantitatieve real-time PCR-machine. Het vermogen om DNA-schade te herstellen is cruciaal voor elke cel en elk organisme. Van de talrijke cellulaire DNA-herstelpaden richt base excision repair zich op beschadigde basen die kunnen voortkomen uit oxidatieve of chemische aantastingen; het verduidelijken van de rol van individuele cellulaire elementen die base excision repair kunnen beïnvloeden, is een van de hoofddoelstellingen van onze laboratoriumstudies.Daarom is het nauwkeurig en gevoelig meten van de DNA-reparatieactiviteit een interessepunt geworden in ons laboratorium. Deze assay kan dergelijke gegevens verschaffen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals 32 PN-labeling en analyse via gelelektroforese, is dat onze techniek geen radioactief gelabelde substraten gebruikt, DNA-reparatiesnelheden in real-time kan meten en een zeer groot dynamisch bereik heeft.Verder kan deze aanpak gebruikmaken van verschillende fluoroforen en/of basisschade om de substraatspecificiteit te bepalen. Wij hebben aangetoond dat deze assay zeer kwantitatief en zeer gevoelig is in verschillende omgevingen. Deze moleculaire beacon-assay voor base-excisieherstel is geschikt voor kinetische analyse.De hoge sensitiviteit en specificiteit van de assay maken een nauwkeurige kwantificering van base-excisie-reparatie mogelijk, waardoor deze nuttig is voor screenings van reparatieremmers of voor validatie. Bovendien is de methode aanpasbaar voor het meten van de reparatieactiviteit in weefsels en tumorcellysaten voor functionele biomarkermetingen. Houd bij het ontwerpen van moleculaire beacons voor deze assay rekening met de volgende DNA-oligonucleotiden van 43 basen lang, zoals hier getoond.Werk goed. De DNA-sequentie is niet uniek, maar moet de vorming van een haarspeldstructuur mogelijk maken. Wanneer deze geknikt is zoals hier getoond, wordt specificiteit bereikt door de insertie van specifieke baseletsels zoals uracil of tetrahydrofuraan.Op positie X, zes basen vanaf het vijf-prime uiteinde, moet het GC-gehalte ten minste 32% bedragen en er mag geen GB-base op het vijf-prime uiteinde worden geplaatst. Zes carboxyfluoresceïne of zes fam moet worden geconjugeerd aan het vijf-prime uiteinde en het drie-prime uiteinde moet worden gemodificeerd met dab sil. Dit zal het substraat vormen voor de DNA-reparatie-eiwitten om de binding en activiteit van de glycosyl-releases te waarborgen.De positie van de letsel is gekozen om voldoende ruimte te laten tussen de haarspeldstructuur en het uiteinde van het DNA. De lengte van de stam of de haarspeld-duplex moet minimaal 15 basenparen bedragen. De aanbevolen luslengte is 13 basen.De controle-molecular beacon moet identiek zijn aan de experimentele molecular beacon, behalve dat deze geen DNA-laesie bevat. Daarom mag deze niet worden herkend door DNA-reparatie-enzymen. Zodra de molecular beacons beschikbaar zijn, moet een kwaliteitsbeoordeling worden uitgevoerd om er zeker van te zijn dat de beacons niet fluoresceren totdat ze worden verhit.En om de optimale smelttemperatuur te bepalen, moeten alle stappen tijdens de extractieprocedure op ijs of bij vier graden Celsius worden uitgevoerd. Om de eiwitstabiliteit te waarborgen, dient men zich voor te bereiden op het experiment door vooraf te koelen. Twee bekerglazen van één liter per monster, dialysebuffer, dialysekamers, microcentrifugebuisjes, spuiten en naalden.Label 15 milliliter conische buizen en plaats deze op ijs. Aspireer het groeimedium van de cellen en was ze vervolgens twee keer met 7,5 milliliter koud PBS. Voeg na de tweede wasbeurt vijf milliliter koud PBS toe aan elke schaal en gebruik een cell lifter om de cellen van de plaat te schrapen.Breng de cellen over naar een gekoelde conische buis van 15 milliliter en centrifugeer vervolgens bij 500 ×g bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Verwijder na het centrifugeren het supernatant en schat het gepakte celvolume door dit te vergelijken met bekende vloeistofvolumes in vergelijkbare buizen. Centrifugeer de buizen nog een minuut en verwijder vervolgens de resterende PBS met een pipet.Resuspendeer de celpellet in 150 µL nuke buster extractiereagens één voor elke 50 µL gepakt celvolume. Draag de geresuspendeerde cellen vervolgens over naar een vooraf gekoelde 1,5 mL buis en vortex deze 15 seconden op hoge snelheid. Incubeer de buis na het vortexen vijf minuten op ijs, vortex vervolgens nogmaals 15 seconden en centrifugeer 5 minuten bij 13.000 ×g bij 4 °C.Verwijder na het centrifugeren de supernatant, die de cytoplasmatische fractie bevat, en gooi deze weg. Resuspendeer de pellet in een mengsel van 1 µL resuspendeerde 100 x protease-remmercocktail, 1 µL 100 mM DTT en 75 µL Nuke Buster extractiereagens twee per 50 µL gepakte celvolume.Vortex de cellen 15 seconden op hoge snelheid. Incubeer vijf minuten op ijs en vortex opnieuw 15 seconden op hoge snelheid; centrifugeer vervolgens 5 minuten bij 13.000 ×g bij 4 °C. Gebruik na de centrifugatie een spuit om het supernatant, dat de kernproteïnen bevat, over te brengen naar een slide-dialyse cassette met een molecular weight cutoff van 7.000.Voeg vervolgens 500 µL van 1 M DTT toe aan 500 mL voorkoelde dialysebuffer en dialyseer het lysaat gedurende 90 minuten bij 4 °C onder voorzichtig roeren. Breng de dialysecassette na 90 minuten over naar een tweede bekerglas met 0,5 L voorkoelde dialysebuffer met DTT en dialyseer het lysaat gedurende 90 minuten bij 4 °C onder voorzichtig roeren. Na de dialyse kan het extract zijn gekristalliseerd als gevolg van hoge proteïneconcentraties.Plaats vervolgens een nieuwe spuit in een andere poort dan degene die is gebruikt om de cassette te injecteren en verzamel de gedialyseerde nucleaire eiwitoplossing uit de dialysecassette. Probeer troebel uitziende kristallen mee te nemen bij het verwijderen van de gedialyseerde nucleaire eiwitoplossing. Verdeel het monster in aliquoten van 20 µL in microcentrifugebuisjes, vries deze snel in op droogijs en bewaar ze vervolgens bij -80 °C tot gebruik.Bepaal de proteïneconcentratie en voer de kwaliteitscontrole uit zoals beschreven in het bijbehorende document. Om de molecular beacon-assay uit te voeren, worden de cellysaten ontdooid en verdund tot 2 µg per µL proteïne met basis excision repair reactiebuffer die 1 mM DTT bevat; verdun de molecular beacons tot 200 µM met basis excision repair reactiebuffer. Aangezien de quantitative real-time PCR-machine doorgaans niet als fluorimeter wordt gebruikt, dient de run-methode op de quantitative real-time PCR-machine te worden gewijzigd om elke 20 seconden gegevens te verzamelen bij 37 °C gedurende ten minste 180 cycli.Vervolgens elke 20 seconden gedurende 15 cycli bij de maximale fluorescentie van de molecular beacon om gegevens voor normalisatie te verkrijgen. Stel het reactievolume in op 25 µL. Stel daarna het plaatontwerp op het instrument in met behulp van de software van Applied Biosystems, waarbij de standaardcurve als experimenttype is geselecteerd, en voltooi de plaatlay-out.Een voorbeeld wordt getoond in deze tabel, die ook te vinden is in het bijbehorende document. Voeg niets toe aan de well die is geselecteerd als de standaardcurve. Plaats de basisexcisie-reparatiereactiebuffer, DTT, het cellysaat bij een concentratie van 2 µg/µL en alle moleculaire beacons die in het experiment worden gebruikt op ijs.Voeg vervolgens DTT toe aan de basis-excisieherstel-reactiebuffer tot een eindconcentratie van 1 mM. Pipetteer 15 µL van de basis-excisieherstel-reactiebuffer met DTT in elke put van een geschikte optische qPCR-plaat op ijs. Pipetteer daarna, volgens het plaatoverzicht, de beacons in de juiste putten.Elke combinatie van lysaat en molecular beacon of controle moet in drievoud worden geanalyseerd. Pipetteer tot slot vijf µL van het verdunde nucleaire lysaat per putje in de juiste putjes. Het is belangrijk om alle molecular beacon-reagentia koud te bewaren en de lysaten als laatste stap in de plaat te pipetteren.Onthoud dat de lysaten actieve eiwitten bevatten en dat deze direct met het herstellen van de moleculaire beacons zullen beginnen zodra ze in het reactiemengsel worden gepipetteerd. Daarom is het zeer belangrijk om alle reagentia koud te houden om de mate van beacon-herstel te minimaliseren voordat u begint met het uitvoeren van de metingen. Zodra alles is toegevoegd, verzegelt u de plaat met optische kleefilm en mengt u de inhoud door voorzichtig op de plaat te tikken.Voer vervolgens een korte centrifugeerstap van tien seconden uit om de oplossingen onderin de buisjes of plaat te verzamelen. Plaats na het centrifugeren de plaat in het quantitative realtime PCR-apparaat en start de assay. Exporteer na voltooiing de ruwe data bij voorkeur in Excel-formaat en volg de instructies in het bijbehorende document om de gegevens te analyseren zodra de benodigde berekeningen zijn uitgevoerd. Zet de genormaliseerde fluorescentiegegevens uit als percentage vrij fam tegenover de tijd in seconden in een scatterplot met de bijbehorende foutenbalken om de DNA-reparatieactiviteit en de kwaliteit van de nucleaire extracten van de LN 4 28-cellen en een MPG-overexpressie-cellijn, aangeduid als LN 4 28 MPG, te beoordelen. De in deze video beschreven assay werd uitgevoerd met gebruik van een molecular beacon die het APE one-substraat tetra furine bevat als positieve controle.Zoals in deze figuur wordt getoond, hebben beide cellijnen een robuuste APE1-activiteit, wat wordt aangegeven door de steile helling, en een DNA-glycosylase-activiteit die specifiek is voor de verwijdering van het MPG-substraat. Hypoxanthine, aangeduid als HX, werd gemeten in nucleaire lysaten van beide cellijnen. Elk lysaat werd geanalyseerd met gebruik van ofwel een base excision repair-controle-molecular beacon, ofwel een base excision repair HX-molecular beacon; voor de controle-beacon wordt LN 4 28 in het groen getoond en LN 4 28 MPG in het paars voor de hypo-beacon.LN 4 28 is in het blauw weergegeven en LN 4 28 MPG is in het oranje weergegeven. De resultaten worden gerapporteerd als A de gemiddelde fluorescentie-eenheden en B de genormaliseerde fluorescentie. In elke cel trad een tijdsafhankelijke toename van de fluorescentie op, wat duidt op HX-herstel.Het lysaat werd zoals verwacht geïncubeerd met de HX-molecular beacon. De LN 4 28 MPG-cellijn, aangegeven door de oranje curve, vertoonde een veel hogere herstelsnelheid, wat blijkt uit de snellere toename van de fluorescentie dan bij de ouderlijke LN 4 28-cellijn, die minimaal MPG-eiwit bevat. De herstelsnelheid van specifieke DNA-laesies door specifieke hersteleiwitten kan dus in real-time worden gemeten vanuit celextracten, met minimale achtergrondniveaus van aspecifieke DNA-splitsing.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u uw molecular beacons ontwerpt en realtime DNA-reparatiesnelheden meet met behulp van ofwel gezuiverde eiwitten of cellysaten. Met betrekking tot de analyse is het essentieel om het dynamische bereik en de achtergrondwaarden te beoordelen; doe dit door het opnemen van controle-reacties, zoals met of zonder de positieve en negatieve controle-beacons. Gezien de variabiliteit tussen de wells is het nuttig om de gegevens in de individuele wells te normaliseren ten opzichte van de inputwaarden.Deze worden bepaald door de fijnere stap bij de smelttemperatuur. Dit en de toevoeging van andere kleurstoffen, zoals een referentiekleurstof, zullen rekening houden met de variabiliteit die inherent is aan pipetteerfouten of verschillen in detectoren. Deze techniek stelde ons in staat om de invloed van individuele componenten van base-excisie-reparatie op de totale reparatieactiviteit en -capaciteit te verduidelijken.Het is gevoelig genoeg om kleine veranderingen te onthullen die met conventionele methoden niet detecteerbaar zouden zijn geweest.

quantitative-real-time-analysis-base-excision-repair-activity-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

gDNA-verrijking voor NGS-sequencing is een eenvoudig en krachtig hulpmiddel voor de studie van constitutionele mutaties. In dit artikel presenteren we de procedure om eenvoudig de volledige sequentie van 11 genen te analyseren die betrokken zijn bij DNA-schadeherstel.

gDNA Verrijking door een-Transposase gebaseerde technologie voor NGS analyse van de hele reeks van BRCA1, BRCA2, En 9 genen betrokken bij DNA-schade te herstellen

Hier wordt de studie van verschillende DNA-letselsherkenningsbenaderingen via enkele molecuul AFM-beeldvorming gedemonstreerd met het nucleotide-excisiereparatiesysteem als voorbeeld. De procedures van DNA- en eiwitmonstervoorbereidingen en experimentele evenals analytische details voor de AFM-experimenten worden beschreven.

Atomic Force Microscopy Onderzoek naar DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

Een systeem voor het opwekken van laesies op de gedefinieerde regio sub nucleaire's vereist studeren DNA schade reparatie kinetiek. Beschrijven we een methode om gelokaliseerde double-stranded einden met behulp van een laser-scanner confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser maken en leveren van geautomatiseerde procedures om te kwantificeren van de dynamiek van reparatie factoren bij deze letsels.

Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling

Het doel van dit protocol is te kwantificeren van het herstel van gedefinieerde DNA-proteïne crosslinks op plasmide DNA. Lesioned plasmiden zijn transfected in ontvangende zoogdieren cellijnen en laag-moleculair gewicht geoogst op meerdere tijd punten na transfectie. DNA repair kinetiek worden gekwantificeerd aan de hand van strand-specifieke primer uitbreiding gevolgd door qPCR.

Een eenvoudige, snelle en kwantitatieve bepaling aan maatregel reparatie van DNA-proteïne Crosslinks op plasmiden Transfected in zoogdiercellen

Een niet-label niet-radio-isotopische methode voor DNA-polymerase proeflezen en een DNA repair assay werd ontwikkeld met behulp van hoge-resolutie MALDI-TOF massa spectrometrie en een strategie voor de uitbreiding van één nucleotide. De test bleek te zijn van de zeer specifieke, eenvoudig, snel en gemakkelijk uit te voeren voor het proeflezen en reparatie patches korter dan 9-nucleotiden.

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

Hier gepresenteerd is sgRNA / CAS9 endonuclease en next-generation sequencing protocol dat kan worden gebruikt om de mutaties te identificeren die geassocieerd zijn met dubbelstrengs breukherstel in de buurt van de CD4-promotor.

Next Generation Sequencing gebruiken om mutaties te identificeren die verband houden met reparatie van een cas9-geïnduceerde dubbelstrengsbreuk in de buurt van de CD4-promotor

De D-loop capture (DLC) en D-loop extension (DLE) assays maken gebruik van het principe van proximity ligatie samen met kwantitatieve PCR om D-loopvorming, D-loop extensie en productvorming te kwantificeren op de plaats van een induceerbare dubbelstrengs breuk in Saccharomyces cerevisiae.

Detectie van homologe recombinatietussenproducten via nabijheidsligatie en kwantitatieve PCR in saccharomyces cerevisiae

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het bepalen van nucleïnezuurmetaboliserende enzymen, met behulp van voorbeelden van ligase-, nuclease- en polymerase-enzymen. De test maakt gebruik van fluorescerend gelabelde en niet-gelabelde oligonucleotiden die kunnen worden gecombineerd om duplexen te vormen die RNA- en/of DNA-schade of tussenproducten van de route nabootsen, waardoor het enzymgedrag kan worden gekarakteriseerd.

Gebruik van gemodificeerde synthetische oligonucleotiden om nucleïnezuurmetaboliserende enzymen te testen

We presenteren protocollen voor de beoordeling van de vaardigheid van de dubbelstrengsbreukherstelroute in cellen met behulp van een reeks op luminescentie gebaseerde extrachromosomale reportersubstraten.

Beoordeling van de reparatieactiviteit van DNA-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays

Leer hoe je DNA-reparatieactiviteit in celkernlysaten kwantitatief meet met behulp van laesie-specifieke moleculaire beacons. Deze methode biedt real-time kinetische analyse van glycosylase- en AP-endonuclease-activiteit.

Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons (Video) | JoVE Journal

Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons

Meer video's verkennen