Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons
6 augustus 2012
We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in cel nucleaire lysaten. De test levert de tarieven van de DNA-reparatie-activiteit vatbaar zijn voor kinetische analyse en is aanpasbaar voor de kwantificering van DNA Repair activiteit in weefsel en tumor lysaten of met gezuiverde eiwitten.
Het algemene doel van het volgende experiment is om de snelheid van DNA-reparatie en celkernextracten in real time te meten met behulp van moleculaire lichtbakens die gaan fluoresceren zodra ze zijn gerepareerd. Moleculaire lichtbakens voor basisexcisiereparatie bestaan uit deoxyoligonukleotiden in een stamlusstructuur die een enkele baselesie bevat met zes gekromde oxyfluoresceïne-groepen geconjugeerd aan de vijf prime-uiteinden en dil moti geconjugeerd aan de drie prime-uiteinden wanneer ze zijn gevouwen. De zes fam-moty worden geblust door dab sil op een niet-fluorescerende manier via forester resonantie-energieoverdracht.
Om de DNA-reparatieactiviteit te beoordelen, worden lichtbakens geïncubeerd met celkernextracten, die reparatie-enzymen bevatten. DNA Glycosylaat wordt herkend en verwijdert de DNA-lesie in het lichtbaken. De resulterende ABA-plaatsen zijn substraten voor AP-endonuclease één of ape één Bij herkenning klieft APE één de DNA-ruggengraat op de ABA-plaats, waardoor het DNA dat de zes fam bevat vrij kan dissociëren van de haarspeld.
Loslating van de blusser resulteert in een toename van de fluorescentie die evenredig is aan de mate van DNA-reparatie en kan in real time worden beoordeeld met behulp van een kwantitatieve real-time PCR-machine. Het vermogen om DNA-schade te herstellen is cruciaal voor elke cel en elk organisme. Van de veelvoud aan cellulaire DNA-reparatieroutes richt base excisiereparatie zich op beschadigde basen die het gevolg kunnen zijn van oxidatieve of chemische verwondingen Het verhelderen van de rol van individuele cellulaire elementen die base excisiereparatie kunnen beïnvloeden, is een van de belangrijkste doelstellingen van onze laboratoriumstudies.
Als zodanig is het nauwkeurig en gevoelig meten van DNA-reparatieactiviteit een interesse in ons laboratorium geworden. Deze test kan dergelijke gegevens leveren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals 32 PN-labeling en analyse door gelelektroforese is dat onze techniek geen radioactief gelabelde substraten gebruikt, snelheid van reparatie kan meten in real time en een zeer groot dynamisch bereik heeft.
Bovendien kan deze aanpak verschillende fluorofours en/of base-letsels gebruiken om de substraatspecificiteit te bepalen. We hebben aangetoond dat deze test zeer kwantitatief en zeer gevoelig is in verschillende omgevingen. Deze moleculaire lichtbaken-test voor base excisiereparatie is geschikt voor kinetische analyse.
De hoge gevoeligheid en specificiteit van de test maakt nauwkeurige kwantificering van base excisiereparatie mogelijk en is daarom nuttig voor reparatorenschermen of validatie. Bovendien is het aanpasbaar voor het meten van reparatieactiviteit en weefsels en tumorcel-lysaten voor functionele biomarkermetingen. Bij het ontwerpen van moleculaire lichtbakens die voor deze test zullen worden gebruikt, moet u rekening houden met de volgende DNA-oligonukleotiden die 43 basen lang zijn, zoals hier getoond.
Werkt goed. De DNA-sequentie is niet uniek, maar moet de vorming van een haarspeldstructuur toestaan. Wanneer een kniel als hier getoond, wordt de specificiteit bereikt door het invoegen van specifieke base-letsels zoals uracil of tetra hydro furine.
Op positie X, zes basen vanaf het vijf prime-uiteinde, moet het GC-gehalte minimaal 32% zijn en mag er geen GB-base op het vijf prime-uiteinde worden geplaatst. Zes carboxyfluoresceïne of zes fam moeten worden geconjugeerd aan het vijf prime-uiteinde en het drie prime-uiteinde moet worden gemodificeerd met dab sil. Dit zal het substraat zijn voor de DNA-reparatie-eiwitten om binding en activiteit van de glycosyl-releases te verzekeren.
De positie van de lesie is gekozen om voldoende ruimte te bieden van de haarspeldstructuur en het uiteinde van het DNA. De lengte van de stam of haarspeldduplex moet minimaal 15 basenparen zijn. De aanbevolen luslengte is 13 basen.
De controlemoleculaire lichtbaken moet identiek zijn aan de experimentele moleculaire lichtbaken, behalve dat deze geen DNA-lesie bevat. Het zou daarom niet moeten worden herkend door DNA-reparatie-enzymen. Zodra de moleculaire lichtbakens in handen zijn, moet een kwaliteitsbeoordeling worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de lichtbakens niet gaan fluoresceren totdat ze worden verwarmd.
En om de optimale smelttemperatuur te bepalen, moeten alle stappen tijdens de extractieprocedure worden uitgevoerd op ijs of bij vier graden Celsius. Om de eiwitstabiliteit te garanderen, bereidt u het experiment voor door te voorkoelen. Twee ene liter bekers per monster dialysebuffer dialysekamers, microcentrifuge, buisjes, spuiten en naalden.
Label 15 milliliter kegelbuisjes en plaats ze op ijs. Aspireer het groeimedium van de cellen en was ze vervolgens twee keer met 7,5 milliliter koude PBS Na de tweede wasbeurt. Voeg vijf milliliter koude PBS toe aan elk schaaltje en gebruik een cellifter om de cellen van de plaat te schrapen.
Breng de cellen over in een gekoeld 15 milliliter kegelbuisje en centrifugeer vervolgens bij 500 keer G bij vier graden Celsius gedurende vijf minuten. Na het draaien, verwijdert u het supernatant en schat het gepakte celvolume in door het te vergelijken met bekende volumes van vloeistof in vergelijkbare buisjes. Centrifugeer de buisjes nog een minuut en verwijder vervolgens het resterende PBS met een pipet resus.
Suspendeer de celpellet in 150 microliter nuke buster extractiereagens één voor elke 50 microliter gepakt celvolume. Breng vervolgens de gesuspendeerde cellen over in een voorgekoelde 1,5 milliliter buis en vortex gedurende 15 seconden op hoge snelheid. Na het vortexen, incubeer de buis gedurende vijf minuten op ijs, vortex vervolgens nogmaals gedurende 15 seconden en centrifugeer bij 13.000 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius.
Na het draaien, verwijder en gooi het supernatant weg, dat de cytoplasmatische fractie bevat. Resuspendeer de pellet in een mengsel van één microliter gesuspendeerd 100 x protease-remmercocktail, één microliter van 100 millimolar DTT en 75 microliter nuke buster extractie. Reagens twee per 50 microliter
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie presenteert een methode voor real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in celnucleaire lysaten. De test is ontworpen voor kinetische analyse en kan worden aangepast voor het kwantificeren van DNA reparatieactiviteit in verschillende biologische monsters.
Belangrijke Studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- DNA Reparatiemechanismen
- Cellulaire Biochemie
- Moleculair-Biologische Technieken
Achtergrond
- DNA reparatie is cruciaal voor het behoud van genomische integriteit.
- Glycosylasen en AP endonucleasen spelen een sleutelrol in base excisie reparatie.
- Het gebruik van moleculaire lichtbakens maakt real-time monitoring van reparatieprocessen mogelijk.
- Het begrijpen van deze mechanismen kan helpen bij kankeronderzoek en therapeutische ontwikkeling.
Doel van Studie
- Om een kwantitatief test voor het meten van DNA reparatieactiviteiten te ontwikkelen.
- Om moleculaire lichtbakens te gebruiken voor real-time detectie van reparatie-enzymactiviteit.
- Om een methode te bieden die aanpasbaar is voor verschillende biologische monsters.
Gebruikte Methoden
- Ontwerp van moleculaire lichtbakens met specifieke fluorescerende eigenschappen.
- Incubatie van lichtbakens met cellulaire nucleaire extracten die reparatie-enzymen bevatten.
- Real-time fluorescentiemeting om DNA reparatieactiviteit te beoordelen.
- Kinetic analyse van het reparatieproces op basis van fluorescentie veranderingen.
Belangrijkste Resultaten
- De test meet met succes DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten.
- Real-time gegevens bieden inzichten in de kinetiek van DNA reparatie.
- De methode is aanpasbaar voor gebruik met weefsel- en tumorlysaten.
- Kwantificering van reparatieactiviteit kan het begrip van DNA schaderesponsen verbeteren.
Conclusies
- Deze methode biedt een betrouwbare aanpak voor het bestuderen van DNA reparatiemechanismen.
- Real-time analyse kan onderzoek in kankerbiologie en therapieën vergemakkelijken.
- Toekomstige toepassingen kunnen hoogdoorvoer screening van reparatie-remmers omvatten.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This method enables real-time, quantitative assessment of base excision repair (BER) activity in cell lysates, providing a functional readout of DNA repair capacity. By measuring glycosylase and AP endonuclease kinetics without radioactive labels, it supports target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. The assay’s adaptability to tumor lysates and purified proteins facilitates biomarker development and inhibitor screening, aligning with preclinical de-risking strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures lesion-specific DNA glycosylase and AP endonuclease activities to validate functional target engagement in BER pathways.
- Operational Value: Enables real-time kinetic analysis of repair enzyme activity in nuclear lysates, supporting hypothesis-driven target interrogation.
- Predictive Value: Quantifies repair capacity to de-risk mechanistic assumptions about DNA damage response in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses lesion-specific molecular beacons to determine substrate specificity and enzyme selectivity for BER targets.
- Operational Value: Compatible with quantitative real-time PCR instruments for high-throughput, multiplexed analysis of repair activity across samples.
- Assay Readiness: Generates proportional fluorescence signals upon lesion excision and strand scission, enabling quantitative, real-time monitoring of BER kinetics.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Adaptable for measuring BER activity in tumor lysates and tissue aspirates to support functional biomarker measurements.
- Preclinical Continuity: Supports inhibitor validation screens using purified proteins or cell extracts to assess compound effects on DNA repair.
- Risk Mitigation: Provides sensitivity to detect small changes in repair activity undetectable by conventional methods, enhancing predictive confidence in lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical efficacy, particularly for compounds modulating DNA damage response or genomic stability.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by quantifying BER pathway activity and isolating contributions of specific repair enzymes like glycosylases and AP endonucleases.
- Screening: Enables high-throughput screening of BER inhibitors using purified proteins or cell lysates with real-time fluorescence readouts.
- Analytics: Generates kinetic data and normalized fluorescence outputs (percent free FAM over time) to compare repair rates across conditions and genetic backgrounds.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling functional assessment of BER capacity in tumor lysates as a potential pharmacodynamic biomarker.
- Enterprise Reuse: Standardized beacon design and qPCR-compatible format allow reuse across projects targeting DNA repair mechanisms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation through quantitative, real-time measurement of lesion-specific DNA repair.
- Operational Value: Eliminates need for radioactive labeling, reduces assay time, and offers a large dynamic range for detecting repair activity across diverse samples.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of compound effects on DNA repair capacity and genomic stability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of BER-modulating compounds through mechanistic biomarker data from disease-relevant systems.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular beacon design, including stem-loop structure optimization and lesion placement for specific glycosylase or AP endonuclease targeting.
- Dependent on access to quantitative real-time PCR instruments capable of fluorescence detection at 37°C over 180+ cycles.
- Necessitates standardized nuclear lysate preparation protocols to preserve repair enzyme activity and minimize proteolytic degradation.
- Requires inclusion of control beacons (lesion-free) to distinguish specific repair from background signal and normalize for well-to-well variability.
- Adaptation across model systems depends on maintaining beacon stability and quenching efficiency in varying lysate compositions.
