Name: Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 1 s
Description: Leer hoe je DNA-reparatieactiviteit in celkernlysaten kwantitatief meet met behulp van laesie-specifieke moleculaire beacons. Deze methode biedt real-time kinetische analyse van glycosylase- en AP-endonuclease-activiteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Pittsburgh Foundation en de National Institutes of Health (NIH) [GM087798, CA148629, ES019498] om RWS. Ondersteuning voor de UPCI Lentivirale faciliteit werd verstrekt aan RWS door de Cancer Support Grant van de National Institutes of Health [P30 CA047904]. Ook is steun verleend door de Universiteit van Pittsburgh Afdeling Farmacologie &amp; Chemical Biology naar de DS. Ook is steun verleend door de ESTRO aan CV.

<ol><li>Mutamba, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XRCC1+and+base+excision+repair+balance+in+response+to+nitric+oxide%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide.</a> DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).</li>
<li>Tang, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-methylpurine+DNA+glycosylase+and+DNA+polymerase+beta+modulate+BER+inhibitor+potentiation+of+glioma+cells+to+temozolomide%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-oncology%22%5BJournal%5D)">N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor potentiation of glioma cells to temozolomide.</a> Neuro-oncology. 13, 471-486 (2011).</li>
<li>Clegg, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+and+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids.</a> Methods Enzymol. 211, 353-388 (1992).</li>
<li>Yaron, A., Carmel, A., Katchalski-Katzir, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecularly+quenched+fluorogenic+substrates+for+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Intramolecularly quenched fluorogenic substrates for hydrolytic enzymes.</a> Anal. Biochem. 95, 228-235 (1979).</li>
<li>Kreklau, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+fluorometric+oligonucleotide+assay+to+measure+O%28+6%29-methylguanine+DNA+methyltransferase%2C+methylpurine+DNA+glycosylase%2C+8-oxoguanine+DNA+glycosylase+and+abasic+endonuclease+activities%3A+DNA+repair+status+in+human+breast+carcinoma+cells+overexpressing+methylpurine+DNA+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O( 6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2558-2566 (2001).</li>
<li>Belon, C. A., Frick, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+helicase+activity+with+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Monitoring helicase activity with molecular beacons.</a> BioTechniques. 45, 433-442 (2008).</li>
<li>Ma, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+DNA+polymerase+activity+using+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon.</a> Anal. Biochem. 353, 141-143 (2006).</li>
<li>Summerer, D., Marx, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+for+quantitative+monitoring+of+the+DNA+polymerase+reaction+in+real-time%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed.+Engl%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon for quantitative monitoring of the DNA polymerase reaction in real-time.</a> Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 41, 3620-3622 (2002).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacon+to+monitor+activity+of+E.+coli+DNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacon to monitor activity of E. coli DNA ligase.</a> The Analyst. 130, 350-357 (2005).</li>
<li>Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+beacons+for+the+detection+of+DNA+and+telomerase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Catalytic beacons for the detection of DNA and telomerase activity.</a> J. Am. Chem. Soc. 126, 7430-7431 (2004).</li>
<li>Kundu, L. M., Burgdorf, L. T., Kleiner, O., Batschauer, A., Carell, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavable+substrate+containing+molecular+beacons+for+the+quantification+of+DNA-photolyase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem+%3A+a+European+journal+of+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">Cleavable substrate containing molecular beacons for the quantification of DNA-photolyase activity.</a> Chembiochem : a European journal of chemical biology. 3, 1053-1060 (2002).</li>
<li>Sokol, D. L., Zhang, X., Lu, P., Gewirtz, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real+time+detection+of+DNA.RNA+hybridization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Real time detection of DNA.RNA hybridization in living cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 11538-11543 (1998).</li>
<li>Yang, X., Tong, C., Long, Y., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+fluorescence+assay+for+hSMUG1+activity+based+on+modified+molecular+beacon%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+cellular+probes%22%5BJournal%5D)">A rapid fluorescence assay for hSMUG1 activity based on modified molecular beacon.</a> Molecular and cellular probes. 25, 219-221 (2011).</li>
<li>Mirbahai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+molecular+beacon+to+track+the+activity+of+base+excision+repair+protein+OGG1+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Use of a molecular beacon to track the activity of base excision repair protein OGG1 in live cells.</a> DNA Repair (Amst). , (2009).</li>
<li>Maksimenko, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+beacon+assay+for+measuring+base+excision+repair+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">A molecular beacon assay for measuring base excision repair activities.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 319, 240-246 (2004).</li>
</ol>

RWS is een wetenschappelijk adviseur voor Trevigen, Inc De rest van de auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten.

Er zijn meer dan 600 citaten gebruik van de term &#39;moleculaire baken&#39; voor het detecteren en kwantificeren van tal van moleculen en enzymatische activiteiten, waaronder helicase activiteit 6, DNA-polymerase-activiteit 7,8, DNA-ligase activiteit 9, telomerase activiteit 10, DNA photolyase activiteit 11 en DNA / RNA hybriden 12, onder vele anderen. Naast het gebruik van moleculaire bakens voor het meten van het DNA bovengenoemde activiteiten, hebben ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> Kalium Chloride </td><td> Visser </td><td> P217-500 </td><td> Moleculair-biologische kwaliteit </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Visser </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Visser </td><td> BP229-1 </td><td> Moleculair-biologische kwaliteit </td></tr><tr><td> DTT </td><td> Visser </td><td> BP172-5 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-oplossing </td><td> Invitrogen </td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-zout </td><td> Sigma </td><td> H4034-500G </td><td></td></tr><tr><td> Kalium Hydroxide </td><td> Sigma </td><td> 17-8 </td><td></td></tr><tr><td> 0.22μM filter </td&gt; <td> Nalgene </td><td> 167-0020 </td><td></td></tr><tr><td> Slide-A-Lyzer Dialyse Producten </td><td> Doorboren </td><td> 66373 </td><td> MW 7000 </td></tr><tr><td> Injectiespuit </td><td> Visser </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Naald </td><td> Visser </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml PCR </td><td> Visser </td><td> 05-408-129 </td><td> Zwart </td></tr><tr><td> 15 ml Falcon buizen </td><td> Visser </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> NucBuster Protein Extraction Kit </td><td> Calbiochem </td><td> 71183 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Molecular Beacons </td><td> IDT </td><td></td><td></td></tr><tr><td> BioRad eiwit assay kleurstof remiddel concentraat </td><td> BioRad </td><td> Cat # 500-0006 </td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve, real-time analyse van base excisie reparatie activiteit in cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire beacons

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in celkernen lysaten met behulp van base excisie reparatie (BER) moleculaire bakens. Het substraat (baken) bestaat uit een deoxyoligonucleotide met een base laesie met een 6-carboxyfluoresceïne (6 FAM) groep geconjugeerd aan het 5&#39;-uiteinde en een Dabcyl groep geconjugeerd aan het 3&#39;-uiteinde van het oligonucleotide. De BER moleculaire baken is 43 basen lang en de sequentie is ontworpen om de vorming van een lusstructuur stam-met 13 nucleotiden in de lus en 15 basenparen in de steel 1,2 bevorderen. Wanneer gevouwen deze configuratie de 6-FAM groep gedoofd door Dabcyl een niet fluorescerende wijze via Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 3,4. Het letsel is zodanig dat na base laesie verwijderen en onderdeel splitsing de resterende 5 base oligonucleotide met de 6-FAM groep vrijkomt van de steel. Laat eennd onthechting van de quencher (Dabcyl) resulteert in een toename van de fluorescentie die evenredig is aan het niveau van DNA-herstel. Door het verzamelen van meerdere leest van de fluorescentie waarden, real-time beoordeling van de BER-activiteit is mogelijk. Het gebruik van standaard kwantitatieve real-time PCR-instrumenten maakt de gelijktijdige analyse van een groot aantal monsters. Het ontwerp van deze BER moleculaire bakens, met een enkele base laesie, vatbaar is voor kinetische analyses, BER kwantificering en validatie-remmer en is aangepast voor de kwantificering van DNA-reparatie-activiteit in het weefsel en tumor cellysaten of met gezuiverde eiwitten. De analyse van de groepsvrijstellingsverordening activiteit in de tumor lysaten of weefsel zuigt het gebruik van deze moleculaire beacons van toepassing kunnen zijn om functionele biomarker-metingen. Verder is de analyse van de BER activiteit met gezuiverde eiwitten met behulp van deze kwantitatieve test voor een snelle, high-throughput methode voor de identificatie en validatie van de BER-remmers.

We beschrijven een methode voor de kwantitatieve, real-time meting van DNA glycosylase en AP endonuclease activiteiten in cel nucleaire lysaten. De test levert de tarieven van de DNA-reparatie-activiteit vatbaar zijn voor kinetische analyse en is aanpasbaar voor de kwantificering van DNA Repair activiteit in weefsel en tumor lysaten of met gezuiverde eiwitten.

Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons

We beschrijven een methode voor de kwantitatieve real-time meting van DNA-glycosylase- en AP-endonuclease-activiteiten in celkernlysaten met behulp van base ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de snelheden van DNA-herstel en celkernextracten in real-time te meten met behulp van moleculaire bakens die fluoresceren zodra ze zijn hersteld. Moleculaire bakens voor basische excisieherstel bestaan uit deoxy-oligonucleotiden in een stam-lusstructuur die een enkele basislaesie bevat, met zes curve oxy fluoresceïne-eenheden geconjugeerd aan de 5'-uiteinden en dil-eenheden geconjugeerd aan de 3'-uiteinden wanneer deze zijn gevouwen. De six fam-eenheid wordt op een niet-fluorescerende wijze gedoofd door dab sil via Förster-resonantie-energietransfer.Om de DNA-reparatieactiviteit te beoordelen, worden beacons geïncubeerd met nucleaire celextracten die reparatie-enzymen bevatten. DNA-glycosylase herkent en verwijdert de DNA-laesie in de beacon. De resulterende ABA-sites zijn substraten voor AP-endonucleasené een of ape één. Na herkenning splitst APE één de DNA-backbone bij de ABA-site, waardoor het DNA dat de six fam bevat vrij kan dissociëren van de hairpin.Loskoppeling van de quencher resulteert in een toename van de fluorescentie die proportioneel is aan het niveau van DNA-herstel en in real-time kan worden beoordeeld met behulp

quantitative-real-time-analysis-base-excision-repair-activity-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier wordt de studie van verschillende DNA-letselsherkenningsbenaderingen via enkele molecuul AFM-beeldvorming gedemonstreerd met het nucleotide-excisiereparatiesysteem als voorbeeld. De procedures van DNA- en eiwitmonstervoorbereidingen en experimentele evenals analytische details voor de AFM-experimenten worden beschreven.

Atomic Force Microscopy Onderzoek naar DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

Een systeem voor het opwekken van laesies op de gedefinieerde regio sub nucleaire's vereist studeren DNA schade reparatie kinetiek. Beschrijven we een methode om gelokaliseerde double-stranded einden met behulp van een laser-scanner confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser maken en leveren van geautomatiseerde procedures om te kwantificeren van de dynamiek van reparatie factoren bij deze letsels.

Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling

Het doel van dit protocol is te kwantificeren van het herstel van gedefinieerde DNA-proteïne crosslinks op plasmide DNA. Lesioned plasmiden zijn transfected in ontvangende zoogdieren cellijnen en laag-moleculair gewicht geoogst op meerdere tijd punten na transfectie. DNA repair kinetiek worden gekwantificeerd aan de hand van strand-specifieke primer uitbreiding gevolgd door qPCR.

Een eenvoudige, snelle en kwantitatieve bepaling aan maatregel reparatie van DNA-proteïne Crosslinks op plasmiden Transfected in zoogdiercellen

Een niet-label niet-radio-isotopische methode voor DNA-polymerase proeflezen en een DNA repair assay werd ontwikkeld met behulp van hoge-resolutie MALDI-TOF massa spectrometrie en een strategie voor de uitbreiding van één nucleotide. De test bleek te zijn van de zeer specifieke, eenvoudig, snel en gemakkelijk uit te voeren voor het proeflezen en reparatie patches korter dan 9-nucleotiden.

Proeflezen en DNA Repair Assay met behulp van één Nucleotide uitbreiding en MALDI-TOF massa spectrometrie analyse

Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.

Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

Hier gepresenteerd is sgRNA / CAS9 endonuclease en next-generation sequencing protocol dat kan worden gebruikt om de mutaties te identificeren die geassocieerd zijn met dubbelstrengs breukherstel in de buurt van de CD4-promotor.

Next Generation Sequencing gebruiken om mutaties te identificeren die verband houden met reparatie van een cas9-geïnduceerde dubbelstrengsbreuk in de buurt van de CD4-promotor

De D-loop capture (DLC) en D-loop extension (DLE) assays maken gebruik van het principe van proximity ligatie samen met kwantitatieve PCR om D-loopvorming, D-loop extensie en productvorming te kwantificeren op de plaats van een induceerbare dubbelstrengs breuk in Saccharomyces cerevisiae.

Detectie van homologe recombinatietussenproducten via nabijheidsligatie en kwantitatieve PCR in saccharomyces cerevisiae

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het bepalen van nucleïnezuurmetaboliserende enzymen, met behulp van voorbeelden van ligase-, nuclease- en polymerase-enzymen. De test maakt gebruik van fluorescerend gelabelde en niet-gelabelde oligonucleotiden die kunnen worden gecombineerd om duplexen te vormen die RNA- en/of DNA-schade of tussenproducten van de route nabootsen, waardoor het enzymgedrag kan worden gekarakteriseerd.

Gebruik van gemodificeerde synthetische oligonucleotiden om nucleïnezuurmetaboliserende enzymen te testen

We presenteren protocollen voor de beoordeling van de vaardigheid van de dubbelstrengsbreukherstelroute in cellen met behulp van een reeks op luminescentie gebaseerde extrachromosomale reportersubstraten.

Beoordeling van de reparatieactiviteit van DNA-dubbelstrengsbreuken met behulp van high-throughput en kwantitatieve luminescentie-gebaseerde reporter-assays

Leer hoe je DNA-reparatieactiviteit in celkernlysaten kwantitatief meet met behulp van laesie-specifieke moleculaire beacons. Deze methode biedt real-time kinetische analyse van glycosylase- en AP-endonuclease-activiteit.

Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons (Video) | JoVE Journal

Kwantitatieve, real-time analyse van Base excisie reparatie Activiteit in Cellysaten gebruik te maken van laesie-specifieke moleculaire Beacons

Meer video's verkennen