Name: On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-21T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Leer een lab-on-a-chip-techniek om de inflammatoire toestand van endotheelcellen te karakteriseren met behulp van microfluidische stromingskamers. Deze methode onderzoekt hoe afschuifspanning monocytaire celadhesie beïnvloedt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd ondersteund door NIH / NHLBI subsidie ​​R01 HL082689 van Scott I. Simon en Anthony G. Passerini.

1. Cel Cultuur en Voorbereiding van de ondergrond <ol><li> Snijd 3-inch ronde substraten van een 100 x 20 mm weefselkweek schotel (BD Falcon) met behulp van een draaibank. Steriliseer substraten door onderdompeling in 70% ethanol. Plaats in een petrischaal en mantel met 4 ml type I collageen (100 ug / ml) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur spoel met 4 ml 1 x PBS. </li><li> Hang Human Aorta endotheelcellen (HAEC, passage 4-6) op 6.5x10 5 cellen / ml en het zaad door het toepassen van 1 ml direct op substraat. Plaats in een 37 ° C, 5% CO2 incubator en laat cellen hechten aan het substraat gedurende 1 uur. </li><li> Voeg 9 ml endotheliale groei Medium-2 (EGM-2) aangevuld met 1 x antibiotica antimycotische oplossing aan de cellen. Wijzig de media om de 2 dagen tot de cellen tot 90% confluentie. </li><li> Handhaaf THP-1-cellen in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% FBS en antibiotica 1x antimycotische oplossing. Passage cellen wanneer zij een dichtheid van 1 bereiken0 6 cellen / ml. </li></ol> 2. Cell Shearing Protocol De cellen worden geconditioneerd in een aangepaste kegel-plaat Cell Shearing Device (CSD). Apparaat details en specificaties van het ontwerp zijn aangegeven in tabel 1 en figuur 4. <ol><li> Bereid de CSD. Steriliseer de kamer behuizing met ethanol en spoel af met steriele PBS. Verwarm de behuizing 37 ° C en om te waarborgen dat de kegel loodrecht op de celmonolaag. Zet het substraat met de cellen van de bodem van het huis en zet de kegel op de gewenste hoogte. </li><li> Gebruik Leibovitz-15 (L-15) medium aangevuld met Endothelial BulletKit de afschuiving medium juiste pH in afwezigheid van CO 2 te handhaven. Om ontsteking stimuleren toe tumor necrosis factor-α (TNF-α, 0,5 ng / ml) om de afschuifkrachten medium en injecteer 6 ml in de inrichting via een spuit verbonden met een inlaatpoort en zorg geen lucht te voerenbubbels in de kamer. </li><li> Shear-cellen met een hoge mate stabiele shear stress (HSS, 15 dyne / cm 2) of een oscillerende shear stress (OSS, 0 ± 5 dyne / cm 2, 1 Hz) voor 4 uur. De gewenste SS wordt bereikt door aan de kegel boven de cellen die juist wordt met een micro-stappenmotor als eerder beschreven 6 wand SS aan het oppervlak (τ w) wordt benaderd door.: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq1.jpg" alt="Vergelijking 1" /> waarbij μ is de viscositeit van het medium, ω de hoeksnelheid van de kegel en α de kegelhoek (0,5 °). De kegel aanpassing aan het substraat is aangepast om binnen 0,05 ° door nauwkeurige nivellering en de kloof hoogte vastgesteld op 20 ± 10 urn met behulp van een dieptemeter om omtrek en radiale variatie in τ w minimum te beperken. Het apparaat is gevalideerd voor laminaire stroming kenmerken te garanderen. Verwijder cel van het apparaat en voor te bereiden op de analyse van monocyten hechting. </li></ol> 3. Fabricage van PDMS Microfluïdische Kamer <ol><li> Haal meester mal voor gewenste microfluïdische kanaalnummer en de kanaalnaam hoogte afhankelijk van de toepassing. De kenmerken van het specifieke ontwerp wordt gebruikt in dit protocol zijn weergegeven in tabel 1. De methode voor het creëren van deze is al goed gedocumenteerd in de literatuur. Een kort, het netwerk van kanalen wordt ontworpen met behulp van CAD-software (Autodesk Inventor) en gedrukt bij 5000 dpi op een transparant. Negatieve fotoresist (SU8) wordt gesponnen op een siliciumplak met een dikte van 100 pm. De transparantie is bedekt en blootgesteld aan UV-licht. Niet-gepolymeriseerde fotolak verwijderd met de positieve replica meester genereren. </li><li> Om PDMS oplossing te mengen basis van siliconen te maken met siliconen verharder 10:01, berekend op een gewicht van boot en roer met een 5 ml serologische pipet. Zorg ervoor dat u de muren te schrapenvan de wegen boot om te voorkomen dat het toevoegen van plastic vlokken aan de oplossing. </li><li> Plaats de master wafer in een 100x15mm petrischaal en giet het PDMS oplossing in de schotel. </li><li> Dek de schaal af en plaats deze in een vacuüm verpakking gedurende 15 minuten om bellen te verwijderen. Na 15 minuten de petrischaal uit en verwijdert het overtollige luchtbellen door voorzichtig te blazen lucht over het oppervlak. </li><li> Plaats Petri schaal in een oven gedurende 1 uur bij 70 ° C. Verwijder de schaal en knip de microfluïdische kamers met een scherp mes. </li></ol> 4. Vergadering van Device op Microscoop <ol><li> Zet lichtbron omgekeerde microscoop en zet verwarming op 37 ° C. Bevestig de slang aan een 10 ml spuit en vul met gedestilleerd water zodanig dat er geen luchtbellen. Plaats de spuit in de spuit pomp en de ingestelde stroom aan een wand SS van 1 dyne / cm 2 induceren. De afschuifspanning (τ w) gegenereerd gedurende de hartlijn van het kanaal wordt benaderd met de standaardvergelijking voor een parallelle plaat flow chamber: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq2.jpg" alt="Vergelijking 2" /> waarbij μ is de viscositeit van het medium, Q de volumetrische stroomsnelheid, h de goothoogte en w de kanaalbreedte. Opmerking: aangezien de kanalen van eindige breedte van de werkelijke τ w varieert met w afhankelijk van het kanaal beeldverhouding en metingen vermeden 25% dichtst bij de zijwanden. 1,7 </li><li> Plaats PDMS kamer in het water en gebruik een 100 ul micropipet om lucht te verwijderen uit de individuele kanalen. Bevestig vacuüm adapter aan op kamer ervoor te zorgen dat de klep is uitgeschakeld. </li><li> Plaats petrischaal met HAEC monolaag op het streven. Plaats de PDMS kamer over de petrischaal en zorgvuldig in te stellen op de HAEC monolaag tegelijkertijd te verzekeren dat er geen luchtbellen vormen tussen het apparaat en de monolaag. Draai de klep zodat het vacuüm is ingeschakeld en de kamer wordt stevig bevestigd. </li&gt; <li> Snij 19 gauge naald bot zodanig dat slechts 5 mm metaal links. Vul de plastic reservoir met buffer en in PDMS kamer ingang. Herhaal passend aantal kanalen worden gebruikt. Bevestig de slang van de spuit pompen PDMS kanaal uitgangen. </li></ol> 5. Monocyten Hechting Assay Onder Afschuifspanning <ol><li> Suspendeer THP-1 cellen 2x10 6 cellen / ml in HBSS + Ca2 + / Mg2 + + 0,1% HSA. Activeer THP-1 cellen door incubatie met stroma afgeleid factor-1 (SDF-1, 50 ug / ml) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Zet spuitpomp te stromen vast te stellen, voeg dan 50 pi van celsuspensie naar het reservoir zonder dat er luchtbellen. Zodra stroom volledig is ontwikkeld, begint data-acquisitie. </li><li> Gedurende 5 minuten bij toepassing debiet buffer toe te voegen aan het reservoir indien de oplossing laag wordt. Ga verder stroomt buffer in de kanalen te wassen uit een ongebonden cellen in de stroom stroom. </li></ol> 6. Data-acquisitie en-analyse <ol><li> Verwerven digitale beeld reeksen 3 frames / s gedurende 2 min na volle stroming langs de lengteas van het kanaal 3 locaties in het kanaal zorg niet onmiddellijk na binnenkomst of voor uitgangspoorten of 25% opnemen dichtst bij de zijkant wanden. </li><li> Tel het aantal gearresteerde cellen per veld door het identificeren van hun fase-heldere verschijning in dezelfde focal plane als de monolaag. </li><li> Firm cel arrestatie wordt gedefinieerd door beweging &lt;½ cel diameter in 10 s. Gemiddelde data over 3 willekeurige velden / kanaal en te kwantificeren met behulp van ImageJ software. </li></ol> 7. Representatieve resultaten Hoewel het vasculair endotheel is gelijkmatig blootgesteld aan agonisten die bijdragen aan systemische ontsteking, atherosclerose is een ziekte die centraal bij voorkeur ontwikkelt op plaatsen van stroom storing in de slagaders, wat impliceert ruimtelijke heterogeniteit in endotheelfunctie. 8 </sup&gt; Circulerende ontstekingsmediatoren zoals TNF-α worden verhoogd in menselijk serum onder metabole stress en correleren met een verminderde werking van het endotheel. 9, 10 TNF-α leidt tot een goed gekarakteriseerde reactie in EG, dat up-regulatie van cel adhesie moleculen (CAM&#39;s bevat , bijvoorbeeld VCAM-1, ICAM-1, E-selectine) en chemokines die personeel werven monocyten uit de circulatie, een kenmerk van de vroege atherosclerose 11 Hemodynamica is een belangrijke regulator van endotheliale inflammatoire fenotype 12 High magnitude shear stress (HSS..; bijv. 15 dynes / cm 2) of pulsatiele shear stress (PSS, bijv. 15 ± 5 dynes / cm 2) bij sites van de weerstand tegen atherosclerose in de slagaders TNF-α-geïnduceerde responsen down-reguleren. Omgekeerd, lage magnitude shear stress (LSS, bijv. 2 dynes / cm 2) of oscillerende shear (OSS; bijv. 0 ± 5 dynes / cm 2), kenmerk van gevoelige locaties in vivo, verergeren cytokine-geïnduceerde ontsteking. 13, 14 Onze microfluïdische PDMS-apparaten bieden een platform voor het uitvoeren van mechanistische studies om hypothesen met betrekking tot de superpositie van metabole stress met hydrodynamische factoren in de regulering van de endotheliale functie en pathologie te testen. Het nut en de veelzijdigheid van de aanpak wordt breed geïllustreerd door de volgende representatieve resultaten. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> Figuur 1. Afschuifspanning moduleert verschillend THP-1-cel adhesie aan TNF-α ontstoken endotheliale monolagen. Deze gegevens werden verkregen met behulp van de gedetailleerde protocol hierboven beschreven en gedocumenteerd in de video. HAEC monolagen werden gelijktijdig blootgesteld aan een lage dosis van het inflammatoire cytokine TNF-α (0,5 ng / ml, ~ EC50 voor VCAM-1 tot-regulering) en ofwel HSS (15 dynes / cm 2) of OSS (0 ± 5 dynes / cm 2, 1 Hz) in een aangepaste CSD voor 4 uur aan zoalsbed in de gedetailleerde protocol. THP-1-cel arrestatie werd gekwantificeerd onder afschuiving stroming in een PDMS flow chamber. Deze cellijn dat het fenotype van humane monocyten bootst werd gekozen vanwege zijn reproduceerbaarheid en gebruiksgemak. HSS verzwakt de ontstekingsreactie in vergelijking met OSS, wat resulteert in een vermindering van THP-1-cel arrestatie. De gegevens werden geanalyseerd door Student&#39;s t-test en worden weergegeven als gemiddelde ± SEM van 3 onafhankelijke experimenten. Aangepast met toestemming van DeVerse et al. 5. De volgende gegevens tonen de veelzijdigheid van onze aanpak met behulp van voorbeelden uit onze gepubliceerde werk. Afwijkingen van de bovenstaande protocol worden aangegeven waar van toepassing. <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Modulatie van cytokine-geïnduceerde VCAM-1 expressie en monocyt werving in een shear stress gradiënt. A) HAEC monolagen werden gestimuleerd met TNF-α (0,3 ng / ml) gedurende 4 uur onder flow in VMMC ontworpen gebaseerd op Hele-Shaw stromingsleer 15. een lineaire afname SS grootte langs de hartlijn van het kanaal is bereikt door de zijwanden van de kamer te laten samenvallen met de stroomlijnen van een tweedimensionale stagnatie stromen en vormen het einde van het kanaal naar de iso-potentieel lijnen overeenkomen. De afschuifspanning (τ w) gegenereerd gedurende de hartlijn van het kanaal op een axiale afstand van de ingang (x) wordt gegeven door: <img src="/files/ftp_upload/4169/4169eq3.jpg" alt="Vergelijking 3" /> waarbij μ is de viscositeit van het medium, Q de volumetrische stroomsnelheid, h de goothoogte, w 1 het kanaal doorgangsbreedte, en L de totale kanaallengte. Q is gekozen om een gradiënt in SS grootte genereren van 16 dynes / cm 2 bij de inlaat van 0 in de stagnatie &quot;a&quot; net proximaal de outlet. B)-C) VCAM-1 expressie werd gemeten in situ door immunofluorescentie microscopie met behulp van antilichamen geconjugeerd met quantum dots en weergegeven als een percentage mediane fluorescentie-intensiteit (MFI&#39;s) van de niet-gestimuleerde statische controle. SS niet moduleren het basale niveau van VCAM-1, die laag in ongestimuleerde HAEC (grijs driehoeken). Echter, VCAM-1 expressie gestegen ten opzichte van TNF-α bij LSS grootheden, met een piek van ~ 2 dynes / cm 2 en terug te keren naar de TNF-α basislijn of lager dan op afschuiving grootheden&gt; 5 dynes / cm 2 (zwarte vierkantjes). D) Monocyten (10 6 / ml) werden bij 2 geperfundeerd dynes / cm 2 5 min parallel stromingskanalen via monolagen geconditioneerd als in A). Monocyten instroom endotheel kwantitatief gecorreleerd met de VCAM-1 expressie op een bepaalde schuifspanning grootte. Met name de mogelijkheid VCAM-1 expressie en monocyt rekrutering sonde met fijne ruimtelijke resolutie in monolayer significante veranderingen bleek een smal bereik in SS grootte die niet gewaardeerd door slechts enkele discrete waarden van afschuiving in afzonderlijke experimenten. De gegevens werden geanalyseerd door herhaalde metingen ANOVA en verschillen beoordeeld door Newman-Keuls nameting, * P &lt;0,05 van TNF-α onder statische omstandigheden. De gegevens worden gemiddelde ± SEM drie tot zes onafhankelijke experimenten. Aangepast met toestemming van Tsou et al.. 2 <img src="/files/ftp_upload/4169/4169fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. Triglyceriden-rijke lipoproteïnen (TGRL) moduleren cytokine-geïnduceerde ontsteking in verhouding tot donor serum triglyceride niveaus en VCAM-1 expressie. HAEC monolagen werden gestimuleerd met TNF-α (0,3 ng / ml) gedurende 4 uur gelijktijdig met TGRL (10 mg / dl ApoB) geïsoleerd uit menselijke proefpersonen na een vetrijke maaltijd in statische cultuur. A) VCAM-1 expressie werd apart gemeten in zwevend EG door middel van flowcytometrieen monocyt hechting gekwantificeerd met een VMMC zoals beschreven in de gedetailleerde protocol. De gegevens worden voorgesteld als% verandering van TNF-α. Monocyten arrestatie gevarieerd in verhouding tot endothelial VCAM-1 expressie, die direct vermeerderd met de hoogte van donor serum triglyceriden. B) Monocyt arrest een subset van pro-inflammatoire donoren ingetrokken in aanwezigheid van een VCAM-1 blokkerend antilichaam. Significantie werd bepaald door gepaarde Student&#39;s t-test, betekent ± SEM 3-5 onafhankelijke experimenten. Aangepast met toestemming van Wang et al.. 4

<ol><li>Schaff, U. Y., Xing, M. M., Lin, K. K., Pan, N., Jeon, N. L., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+mimetics+based+on+microfluidics+for+imaging+the+leukocyte--endothelial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Vascular mimetics based on microfluidics for imaging the leukocyte--endothelial inflammatory response.</a> Lab Chip. 7, 448-456 (2007).</li>
<li>Tsou, J. K., Gower, R. M., Ting, H. J., Schaff, U. Y., Insana, M. F., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+inflammation+by+human+aortic+endothelial+cells+in+a+linear+gradient+of+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of inflammation by human aortic endothelial cells in a linear gradient of shear stress.</a> Microcirculation. 15, 311-323 (2008).</li>
<li>Ting, H. J., Stice, J. P., Schaff, U. Y., Hui, D. Y., Rutledge, J. C., Knowlton, A. A., Passerini, A. G., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triglyceride-rich+lipoproteins+prime+aortic+endothelium+for+an+enhanced+inflammatory+response+to+tumor+necrosis+factor-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Circ.+Res%22%5BJournal%5D)">Triglyceride-rich lipoproteins prime aortic endothelium for an enhanced inflammatory response to tumor necrosis factor-alpha.</a> Circ. Res. 100, 381-390 (2007).</li>
<li>Wang, Y. I., Schulze, J., Raymond, N., Tomita, T., Tam, K., Simon, S. I., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+inflammation+correlates+with+subject+triglycerides+and+waist+size+after+a+high-fat+meal%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endothelial inflammation correlates with subject triglycerides and waist size after a high-fat meal.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 300, H784-H791 (2011).</li>
<li>Deverse, J. S., Bailey, K. A., Jackson, K. N., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+modulates+rage-mediated+inflammation+in+a+model+of+diabetes-induced+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Shear stress modulates rage-mediated inflammation in a model of diabetes-induced metabolic stress.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. , (2012).</li>
<li>Dai, G., Kaazempur-Mofrad, M. R., Natarajan, S., Zhang, Y., Vaughn, S., Blackman, B. R., Kamm, R. D., Garcia-Cardena, G., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+endothelial+phenotypes+evoked+by+arterial+waveforms+derived+from+atherosclerosis-susceptible+and+-resistant+regions+of+human+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Distinct endothelial phenotypes evoked by arterial waveforms derived from atherosclerosis-susceptible and -resistant regions of human vasculature.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 14871-14876 (2004).</li>
<li>Young, E. W., Wheeler, A. R., Simmons, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix-dependent+adhesion+of+vascular+and+valvular+endothelial+cells+in+microfluidic+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Matrix-dependent adhesion of vascular and valvular endothelial cells in microfluidic channels.</a> Lab Chip. 7, 1759-1766 (2007).</li>
<li>Davies, P. F., Civelek, M., Fang, Y., Guerraty, M. A., Passerini, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+heterogeneity+associated+with+regional+athero-susceptibility+and+adaptation+to+disturbed+blood+flow+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Endothelial heterogeneity associated with regional athero-susceptibility and adaptation to disturbed blood flow in vivo.</a> Semin Thromb Hemost. 36, 265-275 (2008).</li>
<li>Burdge, G. C., Calder, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cytokine+response+during+the+postprandial+period%3A+A+potential+causal+process+in+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Nutr%22%5BJournal%5D)">Plasma cytokine response during the postprandial period: A potential causal process in vascular disease.</a> Br. J. Nutr. 93, 3-9 (2005).</li>
<li>Hotamisligil, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+metabolic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammation and metabolic disorders.</a> Nature. 444, 860-867 (2006).</li>
<li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inflammation in atherosclerosis.</a> Nature. 420, 868-874 (2002).</li>
<li>Nigro, P., Abe, J., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+shear+stress+and+atherosclerosis%3A+A+matter+of+site+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Flow shear stress and atherosclerosis: A matter of site specificity.</a> Antioxid Redox Signal. 15, 1405-1414 (2011).</li>
<li>Chiu, J. J., Lee, P. L., Chen, C. N., Lee, C. I., Chang, S. F., Chen, L. J., Lien, S. C., Ko, Y. C., Usami, S., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear+stress+increases+icam-1+and+decreases+vcam-1+and+e-selectin+expressions+induced+by+tumor+necrosis+factor-%5Balpha%5D+in+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Shear stress increases icam-1 and decreases vcam-1 and e-selectin expressions induced by tumor necrosis factor-[alpha] in endothelial cells.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 24, 73-79 (2004).</li>
<li>Li, Y. S., Haga, J. H., Chien, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+the+effects+of+shear+stress+on+vascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells.</a> J. Biomech. 38, 1949-1971 (2005).</li>
<li>Usami, S., Chen, H. H., Zhao, Y., Chien, S., Skalak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+construction+of+a+linear+shear+stress+flow+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Design and construction of a linear shear stress flow chamber.</a> Ann. Biomed. Eng. 21, 77-83 (1993).</li>
<li>Helmke, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+cytoskeletal+mechanics+by+hemodynamic+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology+%28Bethesda%29%22%5BJournal%5D)">Molecular control of cytoskeletal mechanics by hemodynamic forces.</a> Physiology (Bethesda). 20, 43-53 (2005).</li>
<li>Gower, R. M., Wu, H., Foster, G. A., Devaraj, S., Jialal, I., Ballantyne, C. M., Knowlton, A. A., Simon, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cd11c%2Fcd18+expression+is+upregulated+on+blood+monocytes+during+hypertriglyceridemia+and+enhances+adhesion+to+vascular+cell+adhesion+molecule-1%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler.+Thromb.+Vasc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cd11c/cd18 expression is upregulated on blood monocytes during hypertriglyceridemia and enhances adhesion to vascular cell adhesion molecule-1.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 31, 160-166 (2011).</li>
<li>Wu, H., Gower, R. M., Wang, H., Perrard, X. Y., Ma, R., Bullard, D. C., Burns, A. R., Paul, A., Smith, C. W., Simon, S. I., Ballantyne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+cd11c%2B+monocytes+in+atherogenesis+associated+with+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Functional role of cd11c+ monocytes in atherogenesis associated with hypercholesterolemia.</a> Circulation. 119, 2708-2717 (2009).</li>
<li>Bussolari, S. R., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apparatus+for+subjecting+living+cells+to+fluid+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22The+Review+of+scientific+instruments%22%5BJournal%5D)">Apparatus for subjecting living cells to fluid shear stress.</a> The Review of scientific instruments. 53, 1851-1854 (1982).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We beschrijven het gebruik van microfluïdische PDMS apparaten voor de on-chip beoordeling van de endotheliale inflammatoire fenotype door de real-time beeldvorming van CAM expressie en monocyten hechting. Een groot voordeel van onze aanpak ligt in het vermogen om de resultaten in verband met disfunctioneren van het endotheel in de cellen blootgesteld aan ontstekingsmediatoren zoals dieet lipiden en cytokines onder gedefinieerde hydrodynamische omstandigheden die shear stress een afspiegeling van de atherogene schepen te...

<table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus nummer </td></tr><tr><td> 100 x 20 mm Petrischalen </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td></tr><tr><td> Ethanol 95% </td><td> Merck Chemicals </td><td> EX0290-1 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21 tot 031-CV </td></tr><tr><td> Type I Rat Tail Afgeleide Collageen </td><td> Gibco </td><td> A10483-01 </td></tr><tr><td> Human Aorta endotheelcellen </td><td> Genlantis </td><td> PH30405A </td></tr><tr><td> Antibiotica-Antimycoticum Solution </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-062 </td></tr><tr><td> Endotheliale BulletKit </td><td> Lonza </td><td> CC-4176 </td></tr><tr><td> Endotheliale Basale Media-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> 10 ml spuiten </td><td> BD Falcon </td><td> 309604 </td></tr><tr><td> Polyurethaan slang </td><td> Tygon </td><td> ABW0001 </td></tr><tr><td> Leibovitz-15 Media </td><td> Gibco </td><td> 11415-069 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Silicone-elastomeer Base </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 siliconelastomeerfase Verharder </td><td> Dow Corning </td><td> 184 </td></tr><tr><td> SU8 fotolak Master Wafer </td><td> UC Davis Pan Lab </td><td> N / A </td></tr><tr><td> Eclipse TE200 omgekeerde microscoop </td><td> Nikon </td><td> Eclipse TE200 </td></tr><tr><td> Spuitpomp </td><td> Harvard Apparatuur </td><td> PHD2000 </td></tr><tr><td> 19 gauge injectienaald </td><td> Kendall </td><td> 8881 </td></tr><tr><td> THP-1 monocytische cellijn </td><td> ATCC </td><td> TIB-202 </td></tr><tr><td> HBSS (Hanks zoutoplossing) met Ca2 + / Mg2 + </td><td&gt; Gibco </td><td> 14025-092 </td></tr><tr><td> Tumor Necrosis Factor Alfa (TNF-α) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 210-TA-010 </td></tr><tr><td> Stromale afgeleide Factor - 1 (SDF-1) </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 350-NS-010 </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Cellgro </td><td> 10 tot 040-CV </td></tr><tr><td> Humaan serum albumine (HSA) </td><td> ZLB Behring </td><td> NDC 0053-7680-32 </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Specifieke reagentia en materialen.

on-chip endotheliale inflammatoire fenotypering

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenese wordt versterkt door metabole afwijkingen die bijdragen aan een verhoogde staat van systemische ontsteking leidt tot disfunctioneren van het endotheel. Echter, begin van de functionele veranderingen in endotheel, dat betekent een individu niveau van het risico niet direct klinisch onderzocht naar de gids van therapeutische strategie te helpen. Bovendien, de regulering van ontsteking door lokale hemodynamica draagt ​​de niet-random ruimtelijke verdeling van atherosclerose, maar de mechanismen moeilijk af te bakenen in vivo. We beschrijven een lab-on-a-chip gebaseerde benadering van kwantitatief onderzoek metabole verstoring van inflammatoire gebeurtenissen in de menselijke endotheelcellen (EC) en monocyten in een zeer nauwkeurige voorwaarden. Standaardmethoden van zachte lithografie worden vasculaire mimetische microfluïdische kamers (VMMC), die direct gebonden aan gekweekte EC monolagen microfabricate. Een deze inrichtingen hebben het voordeel van het gebruik van kleine hoeveelheden reagentia terwijleen platform voor direct beeld van de ontstekingen in het membraan van EC blootgesteld aan een welbepaalde shear veld. We hebben succes toegepast deze apparaten cytokine, 2 lipide-3, 4 en RAGE-geïnduceerde 5 ontsteking in menselijke aorta EC (HAEC) onderzoeken. Hier aantonen hoe de VMMC voor het testen van monocyten cel (THP-1) wals en stilstand van HAEC monolagen die geconditioneerd onder differentiële afschuiving eigenschappen en geactiveerd door inflammatoire cytokine TNF-α. Studies zoals deze zijn het verstrekken van mechanistisch inzicht in atherosusceptibility onder metabolische risicofactoren.

Microfluïdische stromingskamers geëtst door fotolithografie en vervaardigd uit PDMS worden toegepast op functionele resultaten in verband met EG-dysfunctie en ontsteking te onderzoeken. In een representatief experiment het vermogen van differentiële schuifspanning moduleren monocyte celhechting aan cytokine geactiveerd EC monolagen wordt aangetoond.

On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering

Atherogenese wordt versterkt door metabole afwijkingen die bijdragen aan een verhoogde staat van systemische inflammatie, wat resulteert in endotheliale ...

Het doel van deze video is om een lab-on-a-chip-techniek te demonstreren voor het karakteriseren van de inflammatoire status van endotheelcellen. Om te beginnen worden menselijke aortale endotheelcellen tot confluentie gekweekt op een weefselkweeksubstraat, waarna ze in een Conan-plaat afschuifapparaat worden geplaatst. De cellen worden behandeld met het pro-inflammatoire cytokine, TNF alpha, en gelijktijdig gedurende vier uur blootgesteld aan verschillende afschuifspanningscondities door de rotatie van de kegel boven het substraat nauwkeurig te regelen; afschuifspanning moduleert een goed gekarakteriseerde inflammatoire respons op cytokines.Dat omvat de opregulatie van adhesiemoleculen zoals VCAM-1 en ICAM-1. Het substraat wordt overgebracht naar een microscooptafel waar een APDMS-microfluïdisch apparaat vacuüm wordt afgesloten op de monolaag, waardoor stroomkanalen ontstaan. Geactiveerde monocytaire THP-1-cellen worden over de geconditioneerde hse gestroomd, waarbij ze binden in proportie tot het niveau van de expressie van celadhesiemoleculen.De ontstekingsstatus van het endotheel wordt bepaald door het totale aantal THP-1-cellen te kwantificeren dat stevig is gehecht. Hallo, mi

on-chip-endothelial-inflammatory-phenotyping

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Vasculaire endotheel bepaalt strak leukocyte werving. Onvoldoende leukocyte extravasation draagt bij tot de inflammatoire ziekten bij de mens. Daarom is zoeken naar nieuwe regelgevende elementen van endothelial activering om te ontwerpen van verbeterde therapieën voor inflammatoire aandoeningen. Hier beschrijven we een uitgebreide methodologie om te karakteriseren roman endothelial regelgevers die leukocyte handel tijdens ontsteking kunnen wijzigen.

Screening tests karakteriseren roman Endothelial toezichthouders die betrokken zijn bij de ontstekingsreactie

Dit stapsgewijze protocol biedt een gedetailleerde beschrijving van de experimentele opstelling en data-analyse voor de beoordeling van inflammatoire reacties in hiPSC-ECs en de analyse van leukocyten hechting onder fysiologische stroom.

Microfluidic Assay voor de beoordeling van leukocyten hechting op menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen-afgeleide endotheliale cellen (hiPSC-ECs)

Ontwikkeling van grote bijwerkingen cardiovasculaire voorvallen, die van invloed zijn cardiovasculaire prognose na coronaire angioplastie, worden beïnvloed door de omvang van coronaire schade en vasculaire reparatie. Het gebruik van nieuwe coronaire cellulaire en oplosbare biomarkers, reactief op vasculaire schade en reparatie, zijn nuttig om de ontwikkeling van MacEs en prognose te voorspellen.

Coronaire voorlopercellen en oplosbare biomarkers in cardiovasculaire prognose na coronaire angioplastie

Biopsie-afgeleide intestinale organoïden en organ-on-a-chips technologieën worden gecombineerd in een microfysiologisch platform om regiospecifieke darmfunctionaliteit te recapituleren.

Het combineren van menselijke organoïden en organ-on-a-chip-technologie om intestinale regiospecifieke functionaliteit te modelleren

Hier beschrijven we een protocol, de uitgebreide endotheelcelkweekmethode (EECM), die differentiatie van pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcellen in de hersenen (BMEC) -achtige cellen mogelijk maakt. Deze cellen vertonen endotheelceladhesiemolecuulexpressie en zijn dus een menselijk bloed-hersenbarrièremodel dat geschikt is om immuuncelinteracties in vitro te bestuderen.

Differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen naar microvasculaire endotheelcelachtige cellen in de hersenen met een volwassen immuunfenotype

Isotachophoresis (ITP) is een robuuste elektrokinetische scheiding en preconcentratiestap techniek met toepassingen variërend van toxine detectie tot monstervoorbereiding. Wij beoordelen de fysische principes van ITP en de methodologie van het toepassen van deze techniek om twee specifieke voorbeeld toepassingen: scheiding en detectie van kleine moleculen en zuivering van nucleïnezuren uit celkweek lysaat.

On-chip Isotachophoresis voor de scheiding van ionen en zuivering van nucleïnezuren

Lensfree optische tomografie een driedimensionale microscopie techniek die een ruimtelijke resolutie van &lt;1 um heeft x &lt;1 um x &lt;3 urn x, y en z afmetingen respectievelijk over een groot volume beeldvorming van 15-100...

Lensfree On-chip Tomografische Microscopie Gebruikmakend van Multi-angle Verlichting en Pixel Super-resolutie

De mechanische eigenschappen van endotheliale glycocalyx gemeten door inkeping met micron bollen op AFM uitkragingen. Endotheelcellen werden gekweekt in een aangepaste kamer onder fysiologische voorwaarden stroom glycocalyx expressie te induceren. De gegevens werden geanalyseerd met een dunne film model de glycocalyx dikte en modulus te bepalen.

Het kwantificeren van de mechanische eigenschappen van de Endotheliale Kalende haarvaten met Atomic Force Microscopy

Onze doelen waren voor het ontwerpen, produceren en testen ferromagnetische stents voor endotheelcellen capture. Ten stents werden getest op breuk en 10 meer stents werden getest behouden magnetisme. Tenslotte werden 10 stents getest in-vitro en 8 meer stents werden geïmplanteerd in 4 varkens cell capture en retentie vertonen.

Ferromagnetische Bare Metal Stent voor endotheelcellen Capture and Retention

Een microfluidic biosensor platform is ontworpen en vervaardigd met behulp van goedkope droge film fotoresist technologie voor snelle en gevoelige kwantificering van verschillende analyten. Deze eenmalig gebruik-systeem zorgt voor de elektrochemische uitlezing van enzyme-linked tests aan-chip-geïmmobiliseerd door middel van de techniek van de stop-flow.

Droge Film elektrochemische Microfluidic Biosensor fotoresist gebaseerde Platform: Apparaat Fabrication, On-chip Assay voorbereiding en werking van het systeem

Leer een lab-on-a-chip-techniek om de inflammatoire toestand van endotheelcellen te karakteriseren met behulp van microfluidische stromingskamers. Deze methode onderzoekt hoe afschuifspanning monocytaire celadhesie beïnvloedt.

On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering

Meer video's verkennen