On-Chip Endotheliale Inflammatoire Fenotypering
21 juli 2012
Microfluïdische stromingskamers geëtst door fotolithografie en vervaardigd uit PDMS worden toegepast op functionele resultaten in verband met EG-dysfunctie en ontsteking te onderzoeken. In een representatief experiment het vermogen van differentiële schuifspanning moduleren monocyte celhechting aan cytokine geactiveerd EC monolagen wordt aangetoond.
Het doel van deze video is om een labonchip-techniek te demonstreren voor het karakteriseren van de inflammatoire toestand van endotheelcellen. Om te beginnen worden humane aorta-endotheelcellen gekweekt tot confluentie op een weefselkweeksubstraat en vervolgens ingebracht in een Conan-plaat met schuifapparaat. De cellen worden behandeld met de pro-inflammatoire cytokine, TNF alfa, en tegelijkertijd vier uur lang blootgesteld aan differentiële schuifspanning door de rotatie van de kegel boven het substraat nauwkeurig te regelen. De schuifspanning moduleert een goed gekarakteriseerd inflammatoir antwoord op cytokine.
Dat omvat de upregulatie van adhesiemoleculen zoals VCA een en ICAM een. Het substraat wordt overgebracht naar een microscoopstandaard waar een A-P-D-M-S microfluïdisch apparaat direct op de monolaag wordt afgedicht waardoor stromingskanalen worden gecreëerd. Geactiveerde monocyten, THP een cellen worden over de voorgeconditioneerde hs gevoerd, waar ze binden in verhouding tot het niveau van cel-adhesiemolencuulexpressie.
De inflammatoire toestand van het endotheel wordt bepaald door het aantal THP een cellen te kwantificeren die stevig vastzitten. Hallo, mijn naam is She D Diverse, en ik ben Greg Foster. En ik ben Keith Bailey.
We bevinden ons in de laboratoria van professoren, pastor en Simon in de afdeling Biomedische Technologie aan de Universiteit van Californië in Davis. Vandaag gaan we het gebruik beschrijven van een labonchip-benadering om endotheeldisfunctie en ontsteking kwantitatief te onderzoeken. Deze gereedschappen bieden een platform voor ons om onderzoek uit te voeren naar de superpositie van metabole stress met hydrodynamische factoren en de regulatie van het inflammatoire fenotype van endotheel en gevoeligheid voor atherosclerose.
Dus noemen we onze apparaten vaat-nabootsende, microfluïdische kamers, of VMMC. Deze apparaten stellen ons in staat om inflammatoire resultaten in endotheelcellen en monocyten te kwantificeren onder omstandigheden die die in atherogeen vaatweefsel nabootsen. De VMMC vergemakkelijkt het gebruik van kleine hoeveelheden reagentia of materialen die mogelijk in beperkte hoeveelheden beschikbaar zijn.
Ze kunnen ook worden gebouwd in een aantal aanpasbare lay-outs en geometrieën, waardoor ze zeer geschikt zijn voor een breed scala aan toepassingen. Vandaag zullen we een representatief experiment demonstreren met behulp van onze labonchip-benadering. Humane endotheelmonolagen worden blootgesteld aan cytokine-activering onder goed gedefinieerde schuifspanningen.
We zullen het gebruik van VMC demonstreren om humane monocytencelrekrutering naar de monolaag in realtime te kwantificeren als een functionele uitlezing van endotheelactivatie. Drie-inch ronde substraten worden gemalen uit 100 millimeter weefselkweekschijven. De drie-inch substraten worden gewassen met gedistilleerd water en vervolgens gesteriliseerd door te weken in 70% ethanol. Steriele substraten worden in 100 millimeter petrischalen geplaatst en laten drogen.
Ze worden vervolgens geïncubeerd met type één collageen bij een concentratie van 100 microgram per milliliter gedurende één uur bij kamertemperatuur en gewassen met PBS. Humane aorta-endotheelcellen of HA worden gesuspendeerd bij een concentratie van 650.000 cellen per milliliter. Eén milliliter celsuspensie wordt in druppels op een gedroogd collageen-gecoat substraat geplaatst en verspreid tot een gelijkmatige suspensie.
Geplaatste substraten worden vervolgens in een 37 graden 5% CO2 incubator geplaatst en toegestaan om zich aan het substraatoppervlak te hechten. Na één uur worden negen milliliter E GM twee groeimedium toegevoegd en de cellen worden toegestaan om te groeien tot monolagen met ongeveer 90% confluentie. Monolagen zijn klaar om te worden gebruikt voor verdere schuifexperimenten. Vaat-nabootsende microfluïdische kamers worden geconstrueerd door A-P-D-M-S-vorm over een mastervorm te gieten die de gewenste kanaalgeometrie bevat.
Silicone basis wordt gegoten in een plastic wegboot, gevolgd door het siliconenhardingsmiddel in een verhouding van 10 tot 1 naar gewicht. Het PDMS-gel wordt vervolgens goed gemengd, waarbij men voorzichtig moet zijn om de zijden van de wegboot niet te schrapen en daardoor plastic chips in het mengsel te introduceren. Fotoweerstandsmeesters worden schoongemaakt met hexaan en voorbereid om de VMMC te vormen.
De PDMS-mix wordt vervolgens over de mastervorm gegoten en in een vacuümkamer geplaatst. In de kamer wordt lucht uit het PDMS-mengsel verwijderd en stijgt na 15 minuten naar het oppervlak.
De mal wordt uit de kamer verwijderd en lucht wordt voorzichtig over het PDMS-oppervlak geblazen om resterende luchtbellen uit de mal te verdrijven. De mal wordt vervolgens bedekt en in een 37 graden oven geplaatst gedurende één uur, waarbij de PMS wordt toegestaan om uit te harden. Verwijder het verstevigde PDMS-gel uit de oven en maak ronde incisies rond de kamer met een kleine scalpel.
Het is cruciaal om dit geleidelijk te doen om contact met het fotoweerstandsmateriaal te vermijden, aangezien dit de mastermal zal beschadigen. Snijd de microfluïdische kamer uit de mal. Maak inlaat- en uitlaatpoorten voor elke kanaal met een 19 gauge lure lock naald. Bovendien maak gaten voor de vacuümbuizen weg van de kanalen.
De voorbereiding voor de VMMC is nu voltooid. Pipetteer de pro-inflammatoire cytokine TNF alfa in zes milliliter L 15-medium om een eindconcentratie van 0,5 nanogram per milliliter te bereiken. L 15-medium wordt hier gebruikt als het schuifvloeistof vanwege zijn pH-buffercapaciteit bij afwezigheid van 5% CO2.
Het medium wordt vervolgens in een steriele 10 milliliter spuit getrokken, die wordt gebruikt om het schuifapparaat te laden. De confluente monolaag wordt vervolgens overgebracht naar het cellschuifapparaat, dat is gesteriliseerd met ethanol, is genivelleerd en de hoogte van de kegelopening is ingesteld. Het substraat wordt uit de petrischaal verwijderd en op de glazen maatblok geplaatst, gecentreerd en voorzichtig in de bodem van de behuizingskamer geplaatst, zodat de kegel zich direct boven de cellen bevindt.
Het substraat wordt bevestigd door roestvrijstalen schroeven
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel demonstreert een lab-on-a-chip techniek om de inflammatoire toestand van endotheelcellen (EC's) te karakteriseren met behulp van microfluïdische stromingskamers. De studie onderzoekt hoe differentiële schuifspanning de adhesie van monocytische cellen aan cytokine-geactiveerde EC-monolagen beïnvloedt.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Microfluidica
Achtergrond
- Endotheelcellen spelen een cruciale rol bij ontstekingen en vasculaire gezondheid.
- Schuifspanning is bekend om zijn invloed op cellulaire reacties in het vasculaire systeem.
- Begrip van EC-disfunctie kan inzichten verschaffen in verschillende cardiovasculaire ziekten.
- Microfluïdische apparaten maken een nauwkeurige controle van experimentele omstandigheden mogelijk.
Doel van de studie
- Om de inflammatoire respons van humane aorta-endotheelcellen te karakteriseren.
- Om de effecten van schuifspanning op de adhesie van monocytische cellen te onderzoeken.
- Om een microfluïdische benadering te gebruiken voor verbeterde experimentele controle.
Gebruikte methoden
- Humane aorta-endotheelcellen werden gekweekt tot confluentie.
- Cellen werden behandeld met TNF alpha om ontsteking te induceren.
- Differentiële schuifspanning werd toegepast met behulp van een kegel-plaat schuifapparaat.
- Monocytische THP-1 cellen werden geïntroduceerd om de adhesieniveaus te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Schuifspanning moduleerde de expressie van adhesiemoleculen zoals VCAM-1 en ICAM-1.
- Monocytische cel adhesie was evenredig aan het niveau van expressie van adhesiemoleculen.
- De microfluïdische setup maakte real-time observatie van cellulaire interacties mogelijk.
- Resultaten benadrukken de wisselwerking tussen mechanische krachten en inflammatoire reacties.
Conclusies
- De studie biedt inzichten in de rol van schuifspanning in EC-ontsteking.
- Microfluïdische apparaten zijn effectieve tools voor het bestuderen van cel adhesiedynamica.
- Bevindingen kunnen implicaties hebben voor het begrijpen van mechanismen van hart- en vaatziekten.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This lab-on-a-chip approach enables quantitative assessment of endothelial inflammatory phenotypes under controlled hemodynamic conditions, addressing a critical gap in early cardiovascular risk stratification. By linking metabolic perturbations to leukocyte adhesion dynamics in a reproducible in vitro system, the method supports mechanistic de-risking of atherogenic pathways and informs target validation strategies in cardiovascular drug discovery. The platform’s ability to model physiologically relevant shear stress and cytokine interactions provides predictive value for evaluating therapeutic candidates targeting endothelial dysfunction.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of hemodynamic regulation of inflammatory pathways in human endothelial cells under defined shear stress conditions.
- Operational Value: Provides a quantitative readout of monocyte adhesion as a functional biomarker of endothelial activation state.
- Predictive Value: Supports target validation by linking shear-modulated adhesion molecule expression (e.g., VCAM-1, ICAM-1) to leukocyte recruitment under inflammatory stimuli.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Establishes a standardized microfluidic assay for measuring real-time leukocyte-endothelial interactions under physiological flow.
- Operational Value: Permits high-resolution imaging and automated quantification of adherent cells using image analysis tools.
- Assay Readiness: Delivers reproducible, shear-dependent inflammatory phenotypes suitable for compound screening and pathway modulation studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models early atherogenic events by coupling metabolic risk factors (e.g., TNF-α activation) with hemodynamic shear profiles relevant to arterial geometries.
- Translational Continuity: Bridges in vitro findings to in vivo atherosclerotic susceptibility by quantifying functional endothelial responses under clinically relevant flow conditions.
- Risk-Adjusted Decision-Making: Enables prioritization of targets based on their modulation of shear-sensitive inflammatory phenotypes in human cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the cardiovascular discovery continuum, supporting hypothesis testing in early target validation, enabling assay development for leukocyte recruitment, and providing quantitative analytics for mechanistic de-risking before preclinical commitment.
- Discovery Biology: Facilitates mechanistic interrogation of how hemodynamic forces modulate cytokine-induced endothelial activation and leukocyte adhesion.
- Screening: Delivers a shear-dependent, quantitative assay for evaluating compound effects on endothelial inflammatory phenotypes under controlled flow.
- Analytics: Generates real-time, image-based quantification of firmly arrested monocytes as a functional readout of endothelial activation state.
- Translational Research: Connects endothelial dysfunction metrics to atherosclerotic risk by modeling physiologic shear stress and inflammatory priming in human aortic endothelial cells.
- Enterprise Reuse: Offers a reconfigurable microfluidic platform adaptable to various leukocyte types, stimuli, and shear profiles across discovery projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in endothelial inflammation by decoupling hemodynamic and biochemical variables in a controlled system.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized microfluidic fabrication and precise shear stress application.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early, human-relevant data on target modulation of endothelial-leukocyte interactions under flow.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by identifying candidates that attenuate shear-amplified inflammatory phenotypes in pathophysiologically relevant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic design, cell culture under shear, and leukocyte isolation or handling.
- Depends on access to soft lithography equipment, vacuum sealing systems, and inverted microscopes with environmental control.
- Necessitates cross-team standardization of shear protocols, cytokine dosing, and cell preparation for reproducible results across laboratories.
- Involves adaptation considerations when extending to different endothelial sources (e.g., coronary, microvascular) or leukocyte subtypes beyond THP-1.
- Practical limitations include device assembly complexity and the need for bubble-free microfluidic channel formation to ensure consistent shear profiles.
