Postproduction Verwerking van electrospun Vezels voor Tissue Engineering

Het doel van deze procedure is het produceren van elektrogesponnen biologisch afbreekbare scaffolds die gesteriliseerd kunnen worden en voldoende dikte en mechanische sterkte bezitten voor klinische tissue engineering. Dit wordt bereikt door eerst biologisch afbreekbare polymeren te elektrospinnen tot primaire architecturen, die willekeurig, uitgelijnd en georiënteerd of sequentieel gelaagd zijn. De tweede stap bestaat uit het toepassen van post-spinning modificaties op de scaffolds door meerdere lagen samen te voegen en deze vervolgens te steriliseren.

Vervolgens worden cellen geïntroduceerd in de scaffolds en wordt hun prestatie tijdens en na de kweek beoordeeld. De laatste stap is om de cellen bloot te stellen aan een trainingsregime om de fysiologische stress na te bootsen die de cellen in het lichaam zullen ervaren, om hen zo voor te bereiden op transplantatie. Uiteindelijk kunnen we de respons van cellen op training beoordelen door de extracellulaire matrix te meten die zij produceren als reactie op dynamische spanning.

Deze techniek is veelzijdig en flexibel, waardoor een grote variëteit aan scaffolds kan worden gemaakt met eigenschappen die specifiek zijn aangepast voor de vereiste toepassing. Zo kunnen scaffolds worden ontworpen voor de behandeling van complexe aandoeningen waarbij weefselherstel nodig is, zoals de vervanging van uitgebreid huidverlies bij ernstig verbrande patiënten of het herstel van beschadigd oraal slijmvlies na kanker of trauma. Hoewel deze video een aanhoudende productrie van cellen als marker voor dynamische stress laat zien, kunt u ook een reeks extracellulaire matrixeiwitten overwegen en vele andere aspecten van de celbiologie beoordelen met behulp van geoefende of niet-geoefende cellen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben om reproduceerbare scaffolds te verkrijgen, omdat het electrospinningproces door veel variabelen wordt beïnvloed. Een visuele demonstratie van de verwerking van electrospun scaffolds na het spinnen is belangrijk, maar wordt zelden besproken.

Kennis van het proces is noodzakelijk om de techniek succesvol in de kliniek toe te passen. Begin met het bekleden van een roterende mandrel-collector met aluminiumfolie, waarbij de glanzende zijde naar buiten is gericht. Plaats vervolgens vier spuiten van vijf milliliter, gevuld met vijf milliliter van het betreffende polymeer.

Hier wordt polymelkzuur in een spuitpomp gebruikt. Stel de stroomsnelheid in op 40 µL per minuut per spuit, en de werkafstand op 17 cm van de naaldpunt tot de mandrel. Laad vervolgens de spuitnaalden op tot plus 17.000 V en electrospin vanuit de juiste afstand op de met aluminiumfolie beklede mandrel voor uitgelijnde vezels.

Draai de manl met 1000 RPM voor willekeurige vezels. Draai de manl met 200 RPM. Elektrogesponnen scaffolds kunnen op aluminiumfolie in een afgesloten container bij vier graden Celsius worden bewaard in aanwezigheid van een droogmiddel gedurende ten minste vier maanden na het elektrospinnen van PHBV Lotus tweede polymeer.

Hier is het opnieuw te zien. PLA heeft de gelaagdheid bovenop het PHBV getoond, waarbij de parameters en normale omstandigheden voor die polymeerspin zijn gebruikt. Opnieuw bouwt dit additieve proces een dubbele laag steiger op, waardoor een dubbellaag ontstaat om via de verwarmer een meerlaagse steiger te produceren.

Leg vier vellen PLGA op elkaar en verhit de vellen vervolgens gedurende drie uur bij 60 graden Celsius om via damp-annealing een meerlaags steigerwerk te produceren. Giet 10 milliliters dichloormethaan of DCM in een houder van passende grootte. Plaats vervolgens vier vellen PLGA op elkaar en hang deze twee centimeter boven de DCM.

Sluit tot slot de container gedurende één uur af bij kamertemperatuur om aseptische scaffoldproductie via electrospinning te realiseren; los medisch gekwalificeerde polymeren, gesteriliseerd door incubatie, op in DCM en voer vervolgens de electrospinning uit. Spin de polymeeroplossing op steriel folie dat rond een gesteriliseerd mandrel is gewikkeld. Incubeer de scaffold vervolgens in een steriele laminaire flowkast in antibioticavrij groeimedium gedurende de juiste periode om de steriliteit van de monsters te verifiëren conform de experimentele ethanol-desinfectie.

Plaats de scaffolds gedurende 15 minuten in een oplossing van ethanol en gedestilleerd water. Voor sterilisatie met perazijnzuur: dompel de scaffolds gedurende drie uur onder in een oplossing van perazijnzuur en PBS.

Bestraal de scaffolds bij kamertemperatuur voor gammasterilisatie met een dosis van drie kilo gray met behulp van een cesiumbron en snijd de scaffolds vervolgens in rechthoeken van vijf millimeter bij 20 millimeter. Gebruik daarna een micrometer om de dikte van de scaffold te meten. Plaats de rechthoeken vervolgens in een Bose electro force 3, 100 instrument.

Bereken de Young-modulus en de elasticiteit op basis van de belasting versus verplaatsing als een spanning-rekcurve die door het instrument is uitgezet. Begin met het labelen van de cellen met een fluorescente kleurstof voordat de cellen worden gezaaid. Incubeer vervolgens confluente humane dermale fibroblasten in trypsine en EDTA gedurende vijf minuten bij 37 °C.

Centrifuge vervolgens de losgekoppelde cellen gedurende 10 minuten bij 150 ×g bij kamertemperatuur en resuspendeer het pellet in vijf milliliter DMEM. Pas na het tellen de celconcentratie aan voor het uitplaten en zaai de cellen uit op de scaffolds. Beeld nu het oppervlak van de gelabelde scaffolds af met een fluorescentiemicroscoop om de penetratie van cellen te onderzoeken; voor een diepere penetratie in de scaffolds kan een multiphoton confocale microscoop worden gebruikt.

Dit kan een penetratie van ongeveer 200 micron bereiken in de meeste scaffolds, met of zonder cellen. Fixeer vervolgens, na het cultiveren van de gezaaide scaffolds, de monsters gedurende 20 minuten bij 37 °C in één milliliter formaldehyde in PBS. Was de monsters na het fixeren drie keer met één milliliter PBS en incubeer elk van de monsters vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 °C in 200 µL elastin primaire antilichamen.

Was de monsters nog drie keer in één milliliter PBS en incubeer de monsters vervolgens gedurende 30 minuten in een oplossing van secundaire antilichamen in PBS die DPI bevat. Nadat de monsters voor de laatste keer in PBS zijn gewassen, worden ze gefotografeerd met een fluorescentiemicroscoop met een excitatie van 365 nanometer en emissie van 460 nanometer voor de DPI, en een excitatie van 480 nanometer en emissie van 533 nanometer voor het secundaire antilichaam. Autoclaveer eerst het flowreguleringsapparaat en de ballon; pak het apparaat vervolgens in een cleanroom uit in een laminaire flowkast in de positie voor electrospinning.

Sluit vervolgens een spuit van 50 milliliter gevuld met PBS aan op de zijtak van een driewegkraan en pomp de ballon op met de PBS tot deze gespannen is. Electrospin nu het gewenste polymeer op de ballon. Bij gebruik van de normale spincondities en een werkafstand van 10 centimeter zijn de natte vezels plakkerig genoeg om aan het oppervlak van de ballon te hechten zonder vervolgens los te laten.

Zodra het steunraamwerk is gedroogd, plaatst u de ballon in een steriel vat en transporteert u het vat vervolgens naar een laminaire flowkast die geschikt is voor celkweek. Het kweken van cellen op een steunraamwerk op een opgeblazen ballon om de cellen bloot te stellen aan biomechanische conditionering is het meest uitdagende deel van deze procedure. Het is essentieel om de ballon herhaaldelijk te baden in de celoplossing om zoveel mogelijk cellen aan het steunraamwerk te hechten.

We stellen vast dat dit ongeveer 20 minuten duurt. Verwijder in de zuurkast de ballon uit het vat en plaats deze op een steriel oppervlak, zoals de hier gebruikte Petrischaal, en pipetteer elke 20 seconden gedurende 20 minuten celsuspensie op de gecoate ballon om de cellen gelijkmatig over het ballonoppervlak te verspreiden. Plaats de ballon vervolgens terug in het kweekvat en voeg voorverwarmd medium toe dat geschikt is voor het celtype.

Verbind tenslotte het opblaasapparaat met een spuitpomp en blaas de ballon naar behoefte op en laat deze weer leeglopen om biaxiale rek te bewerkstelligen. Een computergestuurde spuitpomp kan worden gebruikt om een complexer rekregime te bereiken. Electrospinning kan worden ingezet om scaffolds met willekeurige en geordende architecturen te creëren.

Dit is reproduceerbaar en de vezels zijn uniform. Zo kunnen loodrechte vezels worden gecreëerd door een set uitgelijnde vezels via electrospinning op aluminiumfolie aan te brengen door de folie 90 graden te draaien, om vervolgens direct een tweede set uitgelijnde vezels daarop te electrospinnen. Veel soorten polymeren kunnen via electrospinning worden verwerkt, waarbij de kenmerken aanzienlijk kunnen variëren, zoals hier getoond voor P-L-A-P-H-B-V-P-C-L en PLGA; let op dat P-L-A-P-C-L en PLGA allemaal uniforme microvezelige scaffolds zijn.

PHBV wordt gesponnen als een parelsnoer, waarbij nanovezels kralen van vijf tot 20 micron groot met elkaar verbinden. In deze procedure werden de scaffolds aanvankelijk gesponnen met PHBV, waarna de spuiten werden gevuld met PLA en dit over de PHBV-scaffolds werd gesponnen. Deze afbeeldingen tonen representatieve enkelvoudige lagen van PHBV en PLA.

Deze afbeelding illustreert hoe een dwarsdoorsnede van een A-P-H-B-V-P-L-A-dubbellaag met een dichte nanofibreuze "par necklace", een PHBV-laag en een openere microfibreuze PLA-laag eruit kan zien; alle drie de scaffold-typen faciliteren celadhesie en proliferatie. Indien dikkere scaffolds vereist zijn, kan damp- en warmte-annealing worden toegepast om scaffoldlagen met elkaar te versmelten, zoals gedemonstreerd in de volgende afbeeldingen. Geannealde scaffoldlagen delamineren niet en het kan zeer moeilijk zijn om de overgang tussen de lagen te vinden.

Deze afbeelding toont een doorsnede van een door damp bewerkte en thermisch vervormde PLA-scaffold waarbij initiële vezelscaffolds van ongeveer 150 micron samen zijn gevoegd. Vervolgens is DCM-damp gebruikt om veel dikkere scaffolds tot 500 micron te creëren. Deze afbeelding toont hetzelfde gedeelte van de damp-behandelde dubbellaag bij een vergroting die ongeveer twee keer zo groot is als hiervoor. In deze afbeelding is te zien hoe de scaffold bestaat uit lagen van veel dikkere vezels, afgewisseld met lagen dunnere vezels die door verhitting zijn ontstaan, waarbij lagen dunne en dikke vezels samen zijn gevoegd om scaffolds met complexe mechanische eigenschappen te produceren.

Nogmaals, deze afbeelding toont hetzelfde verwarmde knielend steiger-systeem bij vier verschillende vergrotingen. De voorgaande vergroting door membraanlagen kan worden uitgevoerd met verschillende celtypen, waarbij elk type op een apart membraan wordt gekweekt zonder vermenging, zoals gedemonstreerd in deze afbeeldingen van menselijke dermale fibroblasten gekleurd met twee verschillende fluorescerende celtracker-kleurstoffen. De eerste afbeelding toont fibroblasten op electros bun PLA.

De cellen werden gefixeerd en gekleurd; hier werden de gekleurde fibroblasten gezaaid op elektrogesponnen PHBV. In dit experiment werden de fibroblasten vooraf gekleurd met de vitale kleurstof Cell Tracker Green. Let op dat de cellen zich bevinden aan de PLA-zijde van de dubbellaag.

Deze afbeelding toont een representatieve doorsnede door een dubbellaag met rood gekleurde fibroblasten op het onderste PHBV-oppervlak en groen gekleurde fibroblasten op het bovenste PLA-oppervlak. In deze afbeelding zijn de fibroblasten vooraf gekleurd met cell tracker red terwijl ze groeiden op het A-P-H-B-V-oppervlak. Het gebruik van vitale fluorescerende kleurstoffen biedt hiermee een handige methode om de distributie van cellen op een scaffold te bestuderen terwijl de cellen nog groeien.

De sterilisatiemethode heeft invloed op het steigerwerk en de daaropvolgende celkweek. Deze lijngrafiek illustreert de effecten van perazijnzuur, gamma-bestraling en ethanol op de maximale treksterkte en de elasticiteitsmodulus van een PLG-steiger.

Elk van de sterilisatiemethoden beïnvloedt de maximale treksterkte en de elasticiteit van de scaffolds. De kweek van cellen op deze scaffolds vermindert de maximale trekspanning verder, maar verhoogt de elasticiteit. Deze staafgrafiek illustreert het effect dat de sterilisatiemethode heeft op de vezeldiameter van een individuele scaffold.

Gamma-bestraling heeft geen significant effect op de vezeldiameter, terwijl perazijnzuur en ethanol de vezeldiameter met ongeveer 50% verminderen. De beste manier om steriele scaffolds te verkrijgen, is dus om deze onder aseptische omstandigheden te produceren. Deze laatste reeks beelden demonstreert dat cellen levensvatbaar blijven tijdens dynamische distensie en daarnaast verhoogde hoeveelheden elastine produceren. Let op de ontwikkeling van de donkerblauwe kleur die wordt geproduceerd door de groeiende cellen, zoals gedetecteerd met de metabole indicator MTT.

Hier hebben de cellen in het blauw, die op een ballon zijn gekweekt en zijn onderworpen aan biaxiale distensie, elastinevezels ontwikkeld, zoals aangegeven door de groene kleuring. Dit staat in schril contrast met het gebrek aan elastine wanneer dezelfde cellen onder statische omstandigheden op een identieke ballonsteiger worden gehouden. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals statische kweek en vloeistofstroom van de cellen in de steigers, worden uitgevoerd om te onderzoeken hoe de cellen reageren op verschillende kweekcondities.

De ontwikkeling van het kweken van cellen op een steunstructuur op een ballon, die kan worden uitgerekt, is zeer nuttig gebleken omdat het de weg heeft vrijgemaakt voor onderzoekers op het gebied van tissue engineering om nu het effect van dynamische conditionering van cellen in tissue-engineered constructen te onderzoeken. Vergeet niet dat het werken met hoogspanningsvoedingen, oplosmiddelen, lasers en menselijke cellen gevaarlijk kan zijn en dat er altijd een passende training en voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure.