Techniek Adherent Bacteriën door het creëren van een synthetische Curli Operon

Het algemene doel van het volgende experiment is om bacteriën aanhechtende eigenschappen te geven om hun scheiding van vloeibare media te vergemakkelijken. Dit wordt bereikt door eerst een synthetisch curli te ontwerpen om complexe genetische regulatie te omzeilen en gemakkelijke en massale productie van kleverige polymeren mogelijk te maken. Als tweede stap worden aanhechtende bacteriën op polystyreen gevisualiseerd en gekwantificeerd, wat een snelle schatting van de efficiëntie van het synthetische apparaat mogelijk maakt.

Vervolgens worden aanhechtende bacteriën op glas door confocale microscopie gevisualiseerd. Om de biofilm direct te observeren en informatie over de structuur te verkrijgen, worden resultaten verkregen die een significante toename van het aanhechten in de stam die het synthetische apparaat bevat, laten zien op basis van zowel aanhechten, percentagemeting als microscopische observaties. Het belangrijkste voordeel van de synthetische biologie-aanpak ten opzichte van bestaande methoden zoals conventionele klonen, is dat constructen die alleen de absoluut vereiste genen met geschikte signalen bevatten, zeer snel kunnen worden verkregen.

Deze methode kan helpen om een belangrijke vraag in het bioremediatiegebied te beantwoorden, zoals het aanpakken van de uitdaging om metaalgeladen bacteriën uit radioactief afval te verwijderen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen omdat basiskennis over genetische regelgevingssignalen en databasebehandeling vereist is. Visuele demonstratie zal zich richten op de kwantificering en visualisatie van biofilm omdat deze twee stappen erg moeilijk te leren zijn vanwege de kwetsbaarheid van bioframes.

De eerste stap bij het ontwerpen van de synthetische carron is om de genetische organisatie van de curly-genen te bepalen en hun endogene, transcriptionele en translationele signalen te lokaliseren. Dit wordt bereikt met behulp van gespecialiseerde databases zoals REON DB of eco gene. De volgende stap is om de vijf absoluut vereiste genen voor curly-synthese, CSGB en CSGA te selecteren en de vezelmonomeren en C-S-G-E-C-S-G-F en CSGG te coderen die het curling-secretiecomplex coderen, de gekozen sequenties uit de database in snellere formaatgegevensbeheer en in silico pre-analyse worden uitgevoerd met Clone Manager-software aangezien de C-S-G-G-F-E-cluster antisense is in het e coli-genoom.

Deze sequentie moet worden omgezet in zijn omgekeerde complementaire tegenhanger. Gebruik de Clone Manager-tools operatiesprocesmolecuul om het molecuul om te keren, plak de C-S-G-E-F-G-sequentie achter C-S-G-B-A door de functie ligate te gebruiken. Voeg vervolgens de juiste promotor PRCN toe voor de C-S-G-B-A-E-F-G iCal-sequentie.

Het RCN-locus codeert een FLX-pomp RCNA, verantwoordelijk voor nikkel- en kobaltdetoxificatie, en zijn cognate metallo-regulator RCNR. Bij afwezigheid van kobalt of nikkel bindt de repressor RCNR zich aan de RCNR-box op het DNA en voorkomt de volledige transcriptieactivering van de downstream-genen. Als de intracellulaire concentratie van cobalts of nikkel stijgt, voorkomt de binding van cobalt of nikkel aan het RCNR-eiwit de fixatie van de repressor aan de promotor en neemt de transcriptionele activiteit van P-R-C-N-A toe door de vijf geselecteerde curly-genen onder de controle van de promotor te plaatsen.

PRCN-curl zijn naar verwachting overgeproduceerd in aanwezigheid van kobalt en nikkel. Optimaliseer vervolgens de transcriptionele signalen door een perfecte ribosoombindingsplaats of RBS toe te voegen voor de eerste A TG van de CS gba, DNA-sequentie en een tweede perfecte RBS voor de C-S-G-E-F-G-sequentie. Om te voldoen aan de I GMs-standaarden, moet het apparaat worden geflankeerd door een standaard bio brick-prefix met restrictieplaatsen voor ECO R een en X-bar een, en een suffix met restrictieplaatsen voor SPE een en PST een om verdere assemblage te vergemakkelijken.

Het bio brick-onderdeel mag zelf geen ECO R een, PST een SPE een en X-bar R een herkenningsplaatsen bevatten. Daarom werden deze plaatsen geëlimineerd door stille mutatie-veranderingen in silico restrictie-analyse van het apparaat onthulde één PST, één plaats in de CSGA-sequentie, één PST één plaats in de RCNR-sequentie en één ECO R een in het CSGE-gen. Deze plaatsen werden gemodificeerd door stille mutaties.

Zodra het ontwerp van de synthetische opor klaar is, voer een vertaalsimulatie uit met behulp van de Clone Manager-software. Gebruik het sequentie-uitlijningsprogramma blast om de perfecte homologie tussen de wildtype curly-eiwitten en de eiwitten gecodeerd door de synthetische on te verifiëren om deze procedure te starten voor elke put van een 24-welplate van polystyreen met twee milliliter M 63, minimaal medium met 0,2% glucose, incubeer elke put met 10 tot zes cellen van een overnacht bacteriecultuur. Laat de bacteriën groeien bij 30 graden Celsius gedurende 18 tot 48 uur zonder te schudden, elke kolom van de 24-welplate vertegenwoordigt een modaliteit.

De juiste hoeveelheid kobalt en antibioticum wordt toegevoegd wanneer dat nodig is. De eerste drie rijen worden gebruikt om de A aanhechtende bacteriën te kwantificeren door de drie herhalingen te gemiddelen. De laatste rij links wordt gebruikt om de biofilm te visualiseren door middel van kristalvioletkleuring na 18 tot 48 uur, herstel het supinate dat de planktonische cellen bevat van elke put van de eerste drie rijen van de 24-welplate en breng het supinate over naar een hemolysebuis.

Spoel elke put voorzichtig af met één milliliter M 63-medium en trek het wasmiddel in de hemolysebuis met het initiële supinate. Dit zwembad wordt aangeduid als zwemmende cellen genaamd S.De bodem van de putten in de microplaat is bedekt met aanhechtende cellen. Om de biofilm te herstellen, voegt u één milliliter M 63 toe aan elk.

Schraap voorzichtig met de pipettepunt en pipet vervolgens op en neer en breng de biofilmfractie over naar een nieuwe hemolysebuis. Vortex de buis gedurende 15 seconden. Verzamel de biofilmfractie in hemolysebuizen.

Dit zwembad vertegenwoordigt de oppervlakte-gehechte