Een geoptimaliseerde Procedure voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) Isolatie van autonome neurale voorlopercellen uit viscerale organen van de foetus Muizen

Het algemene doel van deze procedure is het verkrijgen van een populatie gezuiverde neuronale progenitorcellen uit ganglia van het perifere zenuwstelsel. Dit wordt bereikt door eerst het orgaan of de specifieke ganglia van belang te dissekeren uit foetale muizen. De weefsels worden vervolgens gedeeltelijk gedissocieerd om de individuele cellen vrij te maken in het omringende medium.

Vervolgens wordt de celst suspensie gefilterd om eventuele resterende weefselklonten of grote aggregaten te verwijderen. Ten slotte wordt de celsuspensie via flowsorting gesorteerd om de gewenste populatie te isoleren op basis van de expressie van een fluorescent reporter in die celpopulatie. Uiteindelijk kunnen genexpressiepatronen worden vergeleken tussen progenitoren, geïsoleerd in verschillende stadia van ontwikkeling, of tussen gezuiverde populaties van verschillende neuronale celtypen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van de isolatie van celpopulaties op basis van antilichaamlabeling is dat immuno-reagentia vaak niet beschikbaar zijn. Genetisch gemodificeerde muizenlijnen die fluorescerende eiwitten produceren in discrete neuronale subsets maken de isolatie van deze celpopulaties mogelijk door cellen die een specifiek gen tot expressie brengen te labelen. Hoewel we deze methode demonstreren voor de isolatie van neurale progenitorcellen uit de darm en het neurogene traject van de mond, kan deze ook worden toegepast op andere modelsystemen die fluorescerende reporters tot expressie brengen.

Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat zij de bronweefsels vaak te sterk verteren, wat leidt tot een verlies van cellevensvatbaarheid. Bekijk de embryo's vóór aanvang van de dissectie via brightfield-illuminatie om er zeker van te zijn dat de relevante structuren in focus zijn. Identificeer vervolgens de transgeen-positieve embryo's door te screenen op expressie van de fluorescerende reporter met behulp van een fluorescent stereomicroscoop.

Na de euthanasie wordt er een minimale hoeveelheid PBS aan de dissectieschaal toegevoegd, zodat het embryo niet gaat drijven terwijl de weefsels worden gedisseceerd. Open de huid van het embryo langs de zijkanten van het lichaam en over de buik op het niveau van de lever. Rol het embryo op zijn rug en gebruik fijne pincetten om het op zijn plaats te fixeren.

Voeg op het niveau van de voorpotten een ander paar pincetten in ter hoogte van het diafragma en trek vervolgens krachtig de inwendige organen richting de staart en weg van de dorsale lichaamswand om de viscera van de lever tot aan de genitaliële tuberkel te verwijderen. Indien er organen uit de borstholte, zoals het hart of de longen, samen met de viscera naar buiten komen, verwijder deze dan voordat u verder gaat.

Zodra de abdominale viscera van het karkas zijn gescheiden, plaatst u een pincet onder de lever, nabij de maag, en scheidt u de lever voorzichtig van de darm. Dissekeer vervolgens zorgvuldig de achterdarm weg van de dorsale urethra en verwijder de darm uit het urogenitale stelsel. Draai tot slot de darm om zodat de milt zichtbaar is onder de maag.

Verwijder de milt en de pancreas. Trek de darmen uit elkaar door het mesenterium vast te houden. Strip vervolgens het mesenterium en de bijbehorende vaten van de darm door voorzichtig aan het mesenterium te trekken.

Vermijd het direct vasthouden van de darm met de pincet. Als de darm scheurt, kunnen de afzonderlijke stukjes tijdens de dissociatiefase simpelweg worden samengevoegd. Voeg elk weefseltype samen in een conische buis van 15 milliliter met ijskoud HBSS, gesorteerd op weefseltype en embryo-fenotype.

Na het centrifugeren wordt zoveel mogelijk HBSS opgezogen uit de gesubdissecteerde weefsels. Resuspendeer vervolgens de weefselpellet in één tot enkele milliliters ACU max. Vervang de pipetpunten tussen elk monster.

Om kruisbesmetting van weefseltypen te voorkomen, worden de buisjes gedurende 20 tot 45 minuten in een waterbad van 37 °C geplaatst. Afhankelijk van het stadium van het te isoleren weefsel is de dissociatie en filtering van het weefsel het meest kritieke deel van de procedure om overmatige dissociatie van het weefsel en bijgevolg een lage celviabiliteit te voorkomen.

Beperk de dissociatietijd en probeer halverwege niet alle weefselstukjes volledig te dissociëren. Breek het weefsel aan het einde van de dissociatietijd handmatig op door de buis krachtig tegen de zijkant van het waterbad te slaan en de buis met een snappende polsbeweging naar beneden te slingeren. Plaats de gedissocieerde monsters vervolgens op ijs en voeg onmiddellijk één milliliter vers bereide quench toe aan elke buis met een nieuwe pipetpunt per monster; pipetteer het monster op en neer totdat het weefsel bijna volledig is gedissocieerd.

Plaats nu met een paar in ethanol gesteriliseerde pincetten een vierkant van 38 micron nylon mesh membraan van drie centimeter over de opening van een nieuwe conische buis van 15 milliliter. Gebruik vervolgens smalle pipetpunten om de individuele resuspendeerde celoplossing door het membraan te filteren door deze in het centrum van het membraan te pipetteren. Zodra de celsuspensie is gefiltererd, wordt de monsterbuis gespoeld met één milliliter quench een tot vijf en worden eventuele resterende cellen gefilterd.

Verwijder vervolgens het membraan, waarbij u er alert op bent dat er geen ongefilterde weefselmonsters in de buis terechtkomen. Aspireer na het centrifugeren van de cel-suspensies het supernatant en resuspendeer de pellet in één milliliter quench één tot vijf. Filter vervolgens elke cel-suspensie door een nylon gaas in vijf milliliter polystyreen buisjes, zoals zojuist getoond.

Begin met het reserveren van een kleine aliquot van het fluorescentie-monster voor de compensatiecontrole voor uitsluitend EGFP. Verdeel vervolgens het weefselmonster van het wilde type in twee porties, waarbij de ene als uitsluitend wild type wordt gelabeld en de andere als seven A a d.Only. Vul nu alle monsterbuisjes met quench één tot vijf, en aspireer na het centrifugeren van de monsters alle supernatant behalve de laatste 200 µL in elk buisje.

Voeg tenslotte seven a a d toe aan de te sorteren monsters en aan de enige controle met seven a a d. Voeg vervolgens 0,75 milliliter triazole LS toe aan 1,5 milliliter microcentrifuge-monsterafnamebuisjes. Begin met het gebruik van de controlemonsters om de compensatieparameters en gates in te stellen, zodat seven A a D-positieve dode cellen worden vermeden en cellen met een hoge GFP-fluorescentie-intensiteit worden verzameld.

Begin na het instellen van de compensatieparameters met het sorteren bij de laagst mogelijke druk, gebruikmakend van een nozzle met een grote boring en een lage stroomsnelheid. Verzamel maximaal 25.000 cellen in elke microcentrifugebuis om te voorkomen dat het triol LS te sterk wordt verdund. Vortex elke buis met gevangen cellen in het triol LS direct na het sorteren.

In deze eerste figuur wordt een volledig geprepareerd genitaliatract van een embryo op 15,5 dagen na copulatie getoond, bezien vanuit ventraal perspectief onder helderveldverlichting. Hetzelfde monster wordt bekeken onder fluorescentieverlichting om de distributie van EGFP-positieve cellen in de bijnierschors en de mediaal gelegen plexus coeliaca aan te tonen, geïdentificeerd door hun TH EGFP-transgeenexpressie. Dit laterale aanzicht van een op 15,5 dagen na copulatie gesubdissecteerde blaas van een TH EGFP-embryo toont fluorescentie door transgeenexpressie in de plexus pelvica, de blaaswand en de urethra.

In dit dorsale aanzicht zijn dezelfde EGFP-positieve cellen zichtbaar in het anteriore dorsale urethraweefsel. De dissociatie van weefsel om cel-suspensies te produceren voor flow-sorting is een delicate balans tussen een adequate enzymatische digestie en het vermijden van overdigestie, wat kan leiden tot een lage celvitaliteit. Deze fotomicrografieën tonen weefsels van het lagere urogenitale stelsel en de darmen halverwege de dissociatietijd. Zoals te zien is in deze foto's van adequaat gedigesteerd weefsel voor en na handmatige dissociatie, zijn stukjes van gesubdissecteerde organen nog steeds duidelijk zichtbaar in weefsels die enzymatisch te lang of met een te hoge enzymconcentratie zijn behandeld.

De resulterende suspensie bevat echter geen resterende grote stukken weefsel; na adequate dissociatie en handmatige filtering vertonen de flowcytometrie-profielen doorgaans meer dan 90% levensvatbare cellen. Voor de cellen die de reporter in deze levensvatbare populatie tot expressie brengen, behouden de cellen een hoge intensiteit van EGFP-expressie. De zwarte populatie bestaat uit enkelvoudige cellen die dood zijn en zijn gelabeld door opname van 7-AAD-fluorescentiekleurstof. De grijze populatie bestaat uit enkelvoudige cellen op basis van forward en side scatter die 7-AAD hebben uitgesloten en derhalve levensvatbaar zijn.

De groene populatie is afkomstig uit het geselecteerde GFP-positieve gebied en bestaat uit enkelvoudige levensvatbare cellen die zeven A a d hebben uitgesloten en EGFP-fluorescentie vertonen. Met deze procedure kan de isolatie van neuronale progenitorcellen uit andere perifere weefsels, zoals de sympathische keten, de dorsale wortelganglia of de longen, worden uitgevoerd om vragen te beantwoorden over verschillen in genexpressieprofielen tussen populaties of over de ontwikkeling van verschillende lijnen.