Een geoptimaliseerde Procedure voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) Isolatie van autonome neurale voorlopercellen uit viscerale organen van de foetus Muizen

Het algemene doel van deze procedure is om een populatie gezuiverde neuronale progenitoren af te leiden uit ganglia van het perifere zenuwstelsel. Dit wordt bereikt door eerst het orgaan of specifieke ganglia van interesse uit foetale muizen te disseceren. De weefsels worden vervolgens gedeeltelijk gedissocieerd om de individuele cellen vrij te maken in de omringende media.

Vervolgens wordt de celsuspensie gefilterd om eventuele resterende weefselkegels of grote aggregaten te verwijderen. Ten slotte wordt de celsuspensie flow-gesorteerd om de populatie van belang te isoleren op basis van de expressie van een fluorescerende reporter in die celpopulatie. Uiteindelijk kunnen genexpressiepatronen worden vergeleken tussen progenitoren, geïsoleerd in verschillende ontwikkelingsstadia, of tussen gezuiverde populaties van verschillende neuronale celtypen.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven het isoleren van celpopulaties op basis van antilichaamlabeling is dat vaak immunoreagentia niet beschikbaar zijn. Door genetisch gemodificeerde lijnen van muizen die fluorescerend eiwit produceren in discrete neuronale subsets, kunnen deze celpopulaties worden geïsoleerd die een bepaald gen tot expressie brengen. Hoewel we deze methode demonstreren voor isolatie van neurale progenitoren uit de darm en neurogen-spoor van de mond, kan deze ook worden toegepast op andere modelsystemen die fluorescerende reporters tot expressie brengen.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode worstelen omdat ze de neiging hebben om de bronweefsels te overmatig te verteren, wat resulteert in een verlies van cellevensvatbaarheid. Voordat u met de dissectie begint, bekijkt u de embryo's door middel van helderveldverlichting om ervoor te zorgen dat de relevante structuren scherp staan. Identificeer vervolgens de transgen-positieve embryo's door te screenen op expressie van de fluorescerende reporter met behulp van een fluorescente stereomicroscoop.

Na het euthanaseren, begint u de embryo's door een minimale hoeveelheid PBS toe te voegen aan de dissectieschaal, zodat het embryo niet ronddrijft terwijl de weefsels worden gedissecerd. Open de huid van het embryo langs de zijkanten van het lichaam en over de buik op het niveau van de lever. Rol het embryo op zijn rug en gebruik een fijne pincet om het op zijn plaats vast te zetten.

Op het niveau van de voorpoot, brengt u een ander paar pincet aan op het niveau van het diafragma en trekt u vervolgens krachtig. Trek de inwendige organen naar de staart toe en weg van de dorsale lichaamswand om de viscera te verwijderen vanaf de lever tot aan de genitale tuberkel. Als er organen uit de borstholte, zoals het hart of de longen, loskomen en aan de viscera blijven plakken, verwijder deze voordat u verder gaat.

Zodra de buikviscera zijn gescheiden van het karkas, brengt u een paar pincet onder de lever aan, nabij de maag, en verweerd de lever voorzichtig los van de darm. Vervolgens dissecteert u de achterdarm voorzichtig los van de dorsale urethra en verwijdert u de darm uit het urogenitale kanaal. Draai tenslotte de darm om zodat de milt zichtbaar is onder de maag.

Verwijder de milt en de pancreas. Trek de darmlussen uit elkaar door de mesenterium vast te houden. Strip vervolgens het mesenterium en de bijbehorende vaten van de darm door voorzichtig aan het mesenterium te trekken.

Vermijd het direct vasthouden van de darm met de pincet. Als de darm breekt, verzamelt u de afzonderlijke stukken in het dissociatie-stadium. Verzamel elk weefseltype samen in een 15 milliliter conische buis met ijskoud HBSS volgens weefseltype en embryofenotype.

Na het pellen, aspireer zoveel mogelijk HBSS van de subdissecteerde weefsels. Resuspendeer vervolgens de weefselpellet in een tot meerdere milliliters ACU max. Verwissel de pipettentips tussen elk monster.

Om kruisbesmetting van weefseltypen te voorkomen, plaatst u de buizen in een waterbad van 37 graden Celsius gedurende 20 tot 45 minuten. Afhankelijk van het stadium van het te isoleren weefsel, is dissociatie en filteren van het weefsel het lastigste deel van de procedure om overmatige dissociatie van het weefsel te voorkomen. En als gevolg daarvan, lage cellevensvatbaarheid.

Beperk de dissociatietijd en probeer niet alle weefselstukken halverwege volledig te dissociëren. En aan het einde van de dissociatietijd, breekt u het weefsel handmatig door krachtig tegen de zijkant van het waterbad te kloppen en de buis naar beneden te slingeren met een snelle polsbeweging. Verplaats nu de gedissocieerde monsters naar ijs en voeg onmiddellijk een milliliter vers bereide quench toe aan elke buis met een nieuwe pipettentip voor elk monster, tri de monster omhoog en omlaag totdat het weefsel bijna volledig is gedissocieerd.

Gebruik nu een paar ethanol-gesteriliseerde pincetten om een drie centimeter vierkant nylon gaasmembraan van 38 micron over de mond van een nieuwe 15 milliliter conische buis te plaatsen. Gebruik vervolgens smalborstige tips om de individuele gesuspendeerde celoplossing door het gaas te filteren door in het midden van het membraan te pipetteren. Zodra de celsuspensie is gefilterd, spoelt u de monstersbuis af met een milliliter quench een tot vijf en filtert u eventuele resterende cellen.

Verwijder vervolgens het membraan, wees voorzichtig om te voorkomen dat ongefilterde weefselmonsters de buis binnenkomen. Na het pellen, aspireer de supernatant van de celsuspensies en resuspendeer het pellet in een milliliter quench een tot vijf. Filter vervolgens elke celsuspensie door een nylon gaas in vijf milliliter polystyreen buisjes zoals zojuist getoond.

Begin met het reserveren van een kleine aliquot van het fluorescentiemonster voor de EGFP-alleen compensatiecontrole. Verdeel vervolgens het wildtype weefselmonster in twee delen, waarbij u een wildtype alleen labelt en de andere zeven A a d.Only. Vul nu alle monstersbuisjes met quench een tot vijf en aspibeer na het pellen van de monsters alle behalve de laatste 200 microliters supernatant in elke buis.

Voeg tenslotte zeven a a d toe aan de monsters die worden gesorteerd en de zeven a a d alleen controle. Voeg vervolgens 0,75 milliliter triazool LS toe aan 1,5 milliliter microcentrifugeerbuisjes. Begin met het gebruik van de controlemonsters om de compensatieparameters en