Een Galvanotaxis Assay voor Analyse van neurale precursoren celmigratie Kinetics in een extern aangelegd Direct Current Electric Field

Het algemene doel van deze procedure is om de migratie van afgeleide neurale voorlopercellen van volwassenen in aanwezigheid van een gelijkstroom elektrisch veld te visualiseren. Dit wordt bereikt door eerst subependymale neurale voorlopercellen van de volwassen muis te isoleren en te kweken. De volgende stap is het voorbereiden van Galvan Axxis-kamers en het overbrengen van de neurale voorlopercellen naar de kamers.

De laatste stap is het toepassen van een gelijkstroom elektrisch veld over de Galvan Axxis-kamer en het uitvoeren van time-lapse beeldvorming om de migratie van neuro-voorlopers te observeren. Uiteindelijk legt de time-lapse beeldvorming microscopie de galvanische eigenschappen van neuro-voorlopers vast in hun gedifferentieerde en ongedifferentieerde toestand. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de galvanische eigenschappen van neuro-voorlopercellen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals een muismodel voor beroerte voor de aanwerving van neuro-voorlopers naar laesieplaatsen om neuro-reparatie te verbeteren.

De procedure wordt gedemonstreerd door Rob Pilley, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium. Bij het starten van deze procedure moeten NPC's zeven dagen in cultuur zijn geweest, zodat vrij zwevende primaire neurosferen klaar zijn om te worden geoogst. Wanneer nodig, begin met het voorbereiden van drie Galvan Axxis-kamers door er drie vierkante glazen plaatjes in te plaatsen.

Dekking nummer één, bedekkingen in een fles met zes normale zoutzuur gedurende de nacht. Vroeg de volgende dag, zet het matra-gel langzaam op ijs om te ontdooien. Na vier uur is het klaar om te worden gebruikt om de kamer te bouwen.

Gebruik eerst een diamantpunt glazen snijder om zes rechthoekige glazen strips van nieuw vierkant te snijden. Nummer één, bedekkingen. Breng de met zuur gewassen vierkante en rechthoekige glijmiddels over in een laminaire stroomkap.

Was de glazen strips met 70% ethanol gevolgd door autoclaaf water van weefselkweekkwaliteit. Laat ze luchtdrogen of droog ze op vetvrij papier. Breng vervolgens vacuümvet aan op de omtrek van één oppervlak van elke vierkante glazen glijmiddel en verzegel ze op de basis van 60 millimeter plastic.

Petrischalen. Breng vacuümvet aan op één kant van de rechthoekige glazen strips en verzegel ze op tegenoverliggende randen van de vierkante glijmiddel om vierkanten met een centrale trog in het midden van elke schaal te maken.

UV steriliseer deze aangepaste glazen vierkanten of kamers gedurende ten minste 15 minuten in een kap. Pipetteer vervolgens 250 tot 300 microliter polyol-lysine op de centrale trog van de kamers. Incubeer vervolgens de kamers bij kamertemperatuur gedurende twee uur, ongeveer 15 minuten voordat de incubatie eindigt.

Bereid de matri-geloplossing na twee uur voor, aspireer de polyol-lysine en was de centrale troggen met één milliliter autoclaaf water. Pipetteer vervolgens 250 tot 300 microliter Matri-geloplossing op de centrale troggen en incubeer de kamers bij 37 graden Celsius gedurende een uur. Na de incubatie aspireert u de matrigel-oplossing.

Was vervolgens de centrale troggen voorzichtig met één tot twee milliliter SFM. Pipetteer nu 100 microliters van E-F-H-S-F-M of F-B-S-S-F-M op de centrale troggen ter voorbereiding op de gekweekte cellen. Pipetteer vervolgens vier tot vijf milliliter van de neurosfeer bevattende cultuur in een nieuwe 60 millimeter petrischaal.

Plaats vervolgens de petrischaal op het podium van de telmicroscoop onder de vijfvoudige kijker. Gebruik een P 10 pipetteer om voorzichtig vijf tot acht hele neurosferen over te brengen naar de centrale trog van elke kamer. Tot vier.

Neurosferen kunnen in één keer worden overgebracht, maar dissocieer ze niet met de neurosferen in de centrale troggen. Verspreid ze voorzichtig zonder de matrigel-substraat te verstoren. Voeg vervolgens nog eens 150 microliter E-F-H-S-F-M of F-B-S-S-F-M toe aan de centrale troggen.

Kweek nu de cellen in een bevochtigde incubator. Na 17 tot 20 uur in cultuur zullen ongedifferentieerde NPC's beschikbaar zijn na 69 tot 72 uur. In cultuur zullen gedifferentieerde NPC's beschikbaar zijn.

Selecteer onder de telmicroscoop de kamer met de beste cellen voor levende celbeeldvorming migratieanalyse. De cellen moeten rond zijn, bijna volledig gedissocieerd van hun neurosferen en nog niet, of pas net begonnen zijn om processen te vormen in een kap. Bereid een kamerdeksel voor.

Was een vierkante glazen dekking met 70% ethanol, vervolgens met geautoclaveerde water en breng een strook vacuümvet aan op twee parallelle randen. Bedek nu de kamer. Aspireer eerst het cultuurmedium uit de centrale trog en sluit vervolgens snel het deksel, glijmiddel op de rechthoekige wanden als een dak.

Laad vervolgens met capillaire werking 100 microliter vers medium in de centrale trog. Gebruik nu vacuümvet om randen te creëren voor pooljes cultuurmedium. Aan elk uiteinde van de centrale trog bij het levende celbeeldvormingssysteem, heb agaros-gelbuisjes, zilver, zilverchloride elektroden en twee 60 millimeter petrischalen voorbereid om te gebruiken.

Laat de kamers als cultuurmedium reservoirs rusten in de omgeving van 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide gedurende 20 tot 30 minuten. Bereid tijdens deze tijd de deksels van de twee lege petrischalen en het deksel van de Galvan Axxis-kamer petrischaal voor door er gaten in te boren met een Dremel of gereedschapspipet, 1,5 tot twee milliliter medium op beide kanten van de centrale trog en voeg zeven tot acht milliliter SFM toe aan elke lege petrischaal. Plaats een petrischaal aan elke kant van de centrale trog van de kamer en plaats één elektrode in elk schaaltje.

Overbrug de kloof tussen de kamer en de petrischalen om elektrische continuïteit tot stand te brengen. Verbind met de Agros-gelbruggen de elektroden met een externe voeding met een M-meter in serie om elektrische stroom te meten en schakel