Name: Een Galvanotaxis Assay voor Analyse van neurale precursoren celmigratie Kinetics in een extern aangelegd Direct Current Electric Field (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Leer hoe je een galvanotaxis-assay opzet om neurale voorloper-celmigratie te analyseren in een direct current elektrisch veld. Deze methode gebruikt time-lapse beeldvorming om celgedrag in vivo te bestuderen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk wordt gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (subsidie ​​# 249669 en # 482986) en Hart en Stroke Foundation van Canada (subsidie ​​# 485508). De auteurs danken Youssef El-Hayek en Dr Qi Wan voor hun hulp bij de ontwikkeling van de experimentele protocollen.

Alle procedures waarbij dieren behandeling werden goedgekeurd door de Universiteit van Toronto Animal Care Comite in overeenstemming met de institutionele richtlijnen (protocol nr. 20009387). De volgende methoden worden uitgevoerd met steriele instrumenten en technieken, in een laminaire stroming kap indien van toepassing. In het protocol onderstaande tekst de uitdrukking &quot;EFH-SFM&quot; verwijst naar serumvrij medium, aangevuld met epidermale groeifactor, basische fibroblast groeifactor en heparine. EFH-SFM wordt gebruikt bij het ​​onderzoek naar de galvanotaxis van ongedifferentieerde NPCs omdat deze mitogenen behouden NPC&#39;s in hun ongedifferentieerde toestand 4. Bij het onderzoek van de galvanotaxis NPCs geïnduceerd om te differentiëren tot rijpe celtypen, &quot;FBS-SFM&quot; verwijst naar serumvrij medium aangevuld met 1% foetaal runderserum. FBS bevordert de differentiatie van NPC&#39;s in rijpe neurale fenotypes 5. 1. Isolatie en Cultuur van Neurale Voorlopers (Nietgetoond in video) <ol><li> Verdoven van een CD1 muizen (6-8 weken oud) met isofluorane en opoffering via cervicale dislocatie. </li><li> Doven het hoofd in 70% ethanol en onthoofden van het dier met scherpe dissectie schaar. </li><li> Terwijl de kop met chirurgische forceps, verwijder de huid op het dorsale oppervlak van de schedel bloot te leggen. </li><li> Met een scalpel en geen. 11 messen, scoren de schedel bij de voorhoofdsholte langs de mediolaterale as en ook langs de pijlnaad in de rostrocaudal richting. </li><li> Schil de pariëtale botten uit de buurt van het hoofd met geen. 7 gebogen tang, zorg ervoor dat u doorboren het hersenweefsel. </li><li> Steek een dunne spatel onder de hersenen vanaf onder de kleine hersenen en het bevorderen van de richting van de olfactorische bollen. Terwijl de schedel op zijn plaats met een pincet, trek de hersenen uit de schedel en onmiddellijk te plaatsen in ijskoud kunstmatige cerebrospinale vloeistof (zie recepten). </li><li> Onder een dissectie microscoop met sterieledissectie schaar en pincet snijd de hersenen in de helft over de middellijn. Draai elk halfrond, zodat de mediale (cut) oppervlak naar boven wijst. </li><li> Selecteer een halve bol, en met de mediale oppervlak naar boven, zoek de splenium van het corpus callosum (achterste gedeelte van het corpus callosum). </li><li> Een insnijding van het oppervlak van de cortex de splenium van het corpus callosum langs de dorsoventrale as. </li><li> Schillen ingesneden cortex naar de bulbus olfactorius tot de mediale en laterale wanden van de laterale ventrikel bloot. </li><li> Draai het halfrond, zodat het dorsale oppervlak naar boven is gericht, en gebruiken gebogen microscissors uit te snijden en het verzamelen van de blootgestelde mediale en laterale muren, die de periventriculaire regio waar NPC&#39;s wonen 6 bevatten. </li><li> Herhaal stappen 1.8-1.11 voor de andere halfrond. </li><li> Pipetteer de geïsoleerde weefsel in 7 ml trypsine-oplossing (zie recept hieronder) in een 15 cc tube, en plaats de buis op een rocker in een 37 ° Cincubator gedurende 25 min. </li><li> Centrifugeer het buisje bij 1500 rpm gedurende 5 min, zuig de supernatant en resuspendeer het weefsel in 2 ml trypsine inhibitor oplossing (zie recept). </li><li> Voorzichtig het weefsel voorzichtig fijnstampen met een klein boorgat Pasteur pipet 30 tot 50 keer om luchtbellen te voorkomen. </li><li> Centrifugeer het buisje bij 1500 rpm gedurende 5 min, zuig de supernatant en resuspendeer in 1-2 ml SFM (zie recept) door tritureren de pellet 3-5 keer. </li><li> Centrifugeer het buisje bij 1500 rpm gedurende 3 min, aspireer het supernatant en resuspendeer in 1 ml SFM + EFH. </li><li> Tellen leven celdichtheid met een hemocytometer en plaat cellen in een T25 kweekkolf bij een dichtheid van 10 cellen per ul in SFM + EFH. </li><li> Laat de cultuur te groeien gedurende 7 dagen ongestoord aan vrij zwevende primaire neurosferen bestaat uit NPCs opleveren. </li></ol> 2. Galvanotaxis Kamer Voorbereiding <ol><li> Plaats 3 vierkante glas niet. 1 dekglaasjes (22 x 22 x 0,17 mm) ina fles 6 N zoutzuur &#39;s nachts. </li><li> De volgende dag met een diamant-tip glas-cutter tot 6 rechthoekige stroken (22 x 5 x 0,17 mm) van glas gesneden van niet vierkant. 1 dekglaasjes. </li><li> Breng de zuurgewassen vierkante en rechthoekige slips glijdt in een laminaire stroming kap. Was de rechthoekige en vierkante strips eerst met 70% ethanol dan, met weefselkweek-grade geautoclaveerd water en laten drogen op een Kim Wipe (voor extra steriliteit, kan het glas worden toegestaan ​​aan de lucht drogen). </li><li> Toepassing vacuum vet aan de omtrek van een oppervlak van het vierkant objectglaasjes en verzegelen met de basis van 60 mm plastic petrischalen. </li><li> Toepassing vacuum vet langs de lengteas van een oppervlak van de rechthoekige glazen strips en verzegelen om de randen van de vierkante objectglaasjes (zodanig dat zij evenwijdig aan elkaar) om een ​​centrale trog maken. </li><li> UV-steriliseer de kamers ten minste 15 min in de laminaire flow kast. </li><li> Pipetteer 250-300 pl poly-L-lysine op de centrale holte van de kamers en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 uur. </li><li> Ongeveer 15 min vóór het einde van de incubatieperiode bereiden Matrigel oplossing (zie recept). </li><li> Zuig het poly-L-lysine, was de centrale troggen met 1 ml van geautoclaveerd water en pipet 250-300 pi Matrigel oplossing op de centrale troggen. </li><li> Incubeer de kamers bij 37 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Zuig het Matrigel oplossing en voorzichtig de centrale troggen wassen met 1-2 ml SFM. </li><li> Pipetteer 100 ul van EFH-SFM of FBS-SFM op de centrale troggen en breng de galvanotaxis kamers op het toneel van een tellende microscoop. </li><li> Pipetteer 3-4 ml van de neurosfeer cultuur bevattende in een 60 mm petrischaal en breng de petrischaal in het stadium van het tellen microscoop. </li><li> Op een bezichtiging doel van 5x, gebruik maken van een P10 pipet tot 5-8 gehele neurosferen (maximaal vier per keer) over te dragen op de centrale dal van elk galvanotaxiskamer zonder dissociëren ze, en voorzichtig uit de neurosferen rond de centrale trog zonder verstoring van de Matrigel substraat. </li><li> Voeg een extra 150 tot 200 ul van EFH-SFM of FBS-SFM op de centrale dalen. </li><li> Breng de galvanotaxis kamers in een 37 ° C, 5% CO2, 100% bevochtigde incubator voor 17-20 uur (indien analyseren ongedifferentieerde NPC) om de neurosferen te houden aan de Matrigel substraat en in enkele cellen los zoals getoond in figuur 1 . Als analyse gedifferentieerde NPCs dient de incubatietijd te worden verlengd tot 69-72 uur om de differentiatie van de cellen mogelijk. </li></ol> 3. Leef Cell Time-Lapse Imaging <ol><li> De live cell imaging systeem equilibreren bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende ten minste 30 minuten voor aanvang van de time-lapse opname. </li><li> Knip twee 12 cm stukken van 1 mm diameter Zilver draad, spoel ze van het ene uiterste, en plaats ze in Clorox bLeach gedurende 20 min tot Ag / AgCl elektroden vormen. </li><li> Breng de galvanotaxis kamers op het stadium van een microscoop geteld en selecteren welke kamer wordt gebruikt voor live-cell imaging migratie analyse gebaseerd op de volgende criteria: i) de neurosferen moet bijna volledig gedissocieerd tot afzonderlijke cellen en ii) de cellen moeten beschikken ronde morfologie met weinig tot geen processen die zich vanaf de cellichamen. </li><li> Overdracht van de geselecteerde galvanotaxis kamer in een laminaire stroming kap, maar ook een afzonderlijk vierkante no. 1 glas dekglas en vacuüm vet. </li><li> Was de afdekkap slip met 70% ethanol dan met geautoclaveerd water en breng een strook vacuum vet op twee parallelle randen van het dekglaasje. </li><li> Zuig het kweekmedium van de centrale dal van de kamer, dan snel plaats het deksel slip (vet-kant naar beneden) op de kamer, zodat het vet strips rusten op de twee parallelle rechthoekige glazen stroken effectief, een dak makennaar de kamer. </li><li> Pipetteer 100 ul van verse EFH-SFM of FBS-SFM in de centrale trog via capillaire werking. </li><li> Gebruik vacuum vet grenzen voor pools van kweekmedia maken op elk uiteinde van de centrale goot, zoals weergegeven in figuur 2. </li><li> Knip twee 15 cm stukken van PVC-buizen, en gebruik een 10 cc spuit met een 18 gauge naald aan agarose oplossing zorgvuldig te injecteren in de slang, zodat er geen luchtbellen ontstaan ​​in de buizen, en laat de gel te stollen gedurende 5 minuten. </li><li> Breng de galvanotaxis kamer naar de live cell imaging systeem, samen met de agarose gel buizen, Ag / AgCl elektroden en een paar lege 60 mm petrischalen die wordt gebruikt als kweekmedium reservoirs en bevat de Ag / AgCl elektroden. Laat de galvanotaxis kamer te rusten binnen de 37 ° C, 5% CO2 omgeving voor 20-30 min. </li><li> Gedurende deze tijd, de voorbereiding van de deksels van de 2 lege petrischalen en het deksel van de petrischaal galvanotaxis kamer is door het boren van gatenin hen met een Dremel of iets dergelijks zoals getoond in figuur 3. </li><li> Pipetteer 1 tot 1,5 ml EFH-SFM of FBS-SFM op beide zijden van de centrale trog en 7-8 ml SFM in elke lege petrischaal. Plaats een petrischaal aan elke kant van de centrale galvanotaxis kamer van de trog en plaats een Ag / AgCl elektrode in elk gerecht. De kloof tussen de galvanotaxis kamer en de petrischalen op elektrische continuïteit te leggen met de agarose gel bruggen, zoals weergegeven in figuur 4. </li><li> Sluit de Ag / AgCl elektroden op een externe voeding, met een ampèremeter in serie met elektrische stroom te meten, en schakel de voeding. Gebruik een voltmeter om de sterkte van het elektrische veld meten direct aan de centrale trog en het uitgangsniveau van de voeding totdat de gewenste elektrische veldsterkte bereikt (de assays uitgevoerd in dit laboratorium gebruik van een dcEF sterkte van 250 mV / mm met elektrische stroom tussen de 1 en 1,5 mA). </li><li> Initiate de time-lapse-module op de live-cell imaging systeem, en dat het experiment uit te voeren voor de gewenste hoeveelheid tijd. Na voltooiing van de test vast de cellen in 4% paraformaldehyde voor standaard immunokleuring analyse. </li></ol>

<ol><li>Borgens, R. B., Shi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncoupling+histogenesis+from+morphogenesis+in+the+vertebrate+embryo+by+collapse+of+the+transneural+tube+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Uncoupling histogenesis from morphogenesis in the vertebrate embryo by collapse of the transneural tube potential.</a> Dev. Dyn. 203, 456-467 (1995).</li>
<li>Song, B., Zhao, M., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+cues+regulate+the+orientation+and+frequency+of+cell+division+and+the+rate+of+wound+healing+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrical cues regulate the orientation and frequency of cell division and the rate of wound healing in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 13577-13582 (2002).</li>
<li>Song, B., Zhao, M., Forrester, J., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+regeneration+and+wound+healing+are+stimulated+and+directed+by+an+endogenous+electrical+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Nerve regeneration and wound healing are stimulated and directed by an endogenous electrical field in vivo.</a> Journal of Cell Science. 117, 4681-4690 (2004).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+and+population+analyses+demonstrate+that+an+EGF-responsive+mammalian+embryonic+CNS+precursor+is+a+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clonal and population analyses demonstrate that an EGF-responsive mammalian embryonic CNS precursor is a stem cell.</a> Dev. Biol. 175, 1-13 (1996).</li>
<li>Chiasson, B. J., Tropepe, V., Morshead, C. M., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mammalian+forebrain+ependymal+and+subependymal+cells+demonstrate+proliferative+potential%2C+but+only+subependymal+cells+have+neural+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adult mammalian forebrain ependymal and subependymal cells demonstrate proliferative potential, but only subependymal cells have neural stem cell characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 4462-4471 (1999).</li>
<li>Erickson, C. A., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+fibroblast+motility+and+orientation+can+be+influenced+by+physiological+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic fibroblast motility and orientation can be influenced by physiological electric fields.</a> J. Cell Biol. 98, 296-307 (1984).</li>
<li>Zhao, M., Agius-Fernandez, A., Forrester, J. V., McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+and+directed+migration+of+cultured+corneal+epithelial+cells+in+small+electric+fields+are+serum+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Orientation and directed migration of cultured corneal epithelial cells in small electric fields are serum dependent.</a> J. Cell Sci. 109, 1405-1414 (1996).</li>
<li>Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-Current+Electrical+Field+Guides+Neuronal+Stem%2FProgenitor+Cell+Migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct-Current Electrical Field Guides Neuronal Stem/Progenitor Cell Migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2200 (2008).</li>
<li>Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nat. Protoc. 2, 1479-1489 (2007).</li>
<li>Huang, C. -W., Cheng, J. -Y., Yen, M. -H., Young, T. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotaxis+of+lung+cancer+cells+in+a+multiple-electric-field+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Biosen+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip.</a> Biosen Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).</li>
<li>SATO, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Input-output+relationship+in+galvanotactic+response+of+Dictyostelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">Input-output relationship in galvanotactic response of Dictyostelium cells.</a> Biosystems. 88, 261-272 (2007).</li>
<li>Meng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-217 (2011).</li>
<li>Zhao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipids%2C+EGF+receptors%2C+and+intracellular+signals+colocalize+and+are+polarized+in+epithelial+cells+moving+directionally+in+a+physiological+electric+field%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field.</a> The FASEB Journal. , (2002).</li>
<li>Fang, K., Ionides, E., Oster, G., Nuccitelli, R., Isseroff, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+receptor+relocalization+and+kinase+activity+are+necessary+for+directional+migration+of+keratinocytes+in+DC+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor receptor relocalization and kinase activity are necessary for directional migration of keratinocytes in DC electric fields.</a> J. Cell Sci. 112, 1967-1976 (1999).</li>
<li>McCaig, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+Cell+Behavior+Electrically%3A+Current+Views+and+Future+Potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling Cell Behavior Electrically: Current Views and Future Potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-978 (2005).</li>
<li>Morshead, C. M., Benveniste, P., Iscove, N. N., vander Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+competence+is+a+rare+property+of+neural+stem+cells+that+may+depend+on+genetic+and+epigenetic+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic competence is a rare property of neural stem cells that may depend on genetic and epigenetic alterations.</a> Nat. Med. 8, 268-273 (2002).</li>
<li>Babona-Pilipos, R., Droujinine, I. A., Popovic, M. R., Morshead, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+Subependymal+Neural+Precursors%2C+but+Not+Differentiated+Cells%2C+Undergo+Rapid+Cathodal+Migration+in+the+Presence+of+Direct+Current+Electric+Fields%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Adult Subependymal Neural Precursors, but Not Differentiated Cells, Undergo Rapid Cathodal Migration in the Presence of Direct Current Electric Fields.</a> PLoS ONE. 6, e23808(2011).</li>
<li>Deuschl, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Randomized+Trial+of+Deep-Brain+Stimulation+for+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">A Randomized Trial of Deep-Brain Stimulation for Parkinson's Disease.</a> N. Engl. J. Med. 355, 896-908 (2006).</li>
<li>Stone, S. S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+Entorhinal+Cortex+Promotes+Adult+Neurogenesis+and+Facilitates+Spatial+Memory%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stimulation of Entorhinal Cortex Promotes Adult Neurogenesis and Facilitates Spatial Memory.</a> J. Neurosci. 31, 13469-13484 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Dit protocol is aangepast van de reeds lang gevestigde methoden van eerdere studies 7-9. Galvanotactic kamers kunnen worden geconstrueerd met een verscheidenheid van verschillende technieken, waaronder de bouw van een aparte glazen goed voor opsluiting van cel zaaien of met CO 2 laser ablatie voor microfabricage van de centrale trog 10,11. Sommige technieken kunnen omslachtiger of duurder dan andere. Wij hebben er een eenvoudige en kosteneffectieve test voor de bouw van een NPC galvanota...

<table border="1"><tbody><tr><td height="44"> Naam van item </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Neurale Precursor Cell Isolation </td></tr><tr><td> 2M NaCl </td><td> Sigma </td><td> S5886 </td><td> 11,688 g opgelost in 100 ml dH 2 O </td></tr><tr><td> 1M KCl </td><td> Sigma </td><td> P5405 </td><td> 7,456 g opgelost in 100 ml dH 2 O </td></tr><tr><td> 1M MgCl2 </td><td> Sigma </td><td> M2393 </td><td> 20,33 g opgelost in 100 ml dH 2 O </td></tr><tr><td> 155 mM NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td><td> 1,302 g opgelost in 100 ml dH 2 O </td></tr><tr><td> 0,5 M glucose </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td> 9,01 g opgelost in 100ml dH 2 O </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl2 </td><td> Sigma </td><td> C7902 </td><td> 1,59 g opgelost in 100 ml dH 2 O </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 15070 </td><td></td></tr><tr><td> Runderpancreas trypsine </td><td> Sigma </td><td> T1005 </td><td></td></tr><tr><td> Schapen hyaluronidase </td><td> Sigma </td><td> H6254 </td><td></td></tr><tr><td> Kynurenic zuur </td><td> Sigma </td><td> K3375 </td><td></td></tr><tr><td> Ovomucoïde trypsineremmer </td><td> Worthington </td><td> LS003086 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100046 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 21700075 </td><td></td></tr><tr><td> 30% Glucose </td><td> Sigma </td><td> G6152 </td><td></td></tr><tr><td> 7,5% NaHCO3 </td><td> Sigma </td><td> S5761 </td><td></td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Sigma </td><td> H3375 </td><td> 23,83 g opgelost in 100 ml dH 2 O </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td><td></td></tr><tr><td> EGF </td><td> Invitrogen </td><td> PMG8041 </td><td> Reconstitueer in 1 ml van hormoon mix en in 20 pi aliquot eenheden. </td></tr><tr><td> FGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0226 </td><td> Einde in 0,5 ml hormoon mix en in 20 pi aliquot eenheden. </td></tr><tr><td> Heparine </td><td> Sigma </td><td> H3149 </td><td></td></tr><tr><td> Apo-transferrine </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 3188-AT </td><td> 0,1 g opgelost in 4 ml 2 0 dH </td></tr><tr><td> Putrescine </td><td> Sigma </td><td> P7505 </td><td> Los 9,61 mg in Apo-transferrine zolutie </td></tr><tr><td> Insuline </td><td> Sigma </td><td> I5500 </td><td> Los 25 mg in 0,5 ml 0,1 N HCl en voeg 3,5 ml van 2 0 dH </td></tr><tr><td> Selenium </td><td> Sigma </td><td> S9133 </td><td></td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> Sigma </td><td> P6149 </td><td></td></tr><tr><td> Standaard Dissectiemateriaal </td><td> Fine Science Tools </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Dissectie microscoop </td><td> Zeiss </td><td> Stemi 2000 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Galvanotaxis Kamer Voorbereiding </td></tr><tr><td> Vierkante glazen dekglaasjes </td><td> VWR </td><td> 16004 </td><td></td></tr><tr><td> 6N zoutzuur </td><td> VWR </td><td> BDH3204-1 </td><td></td></tr><tr><td> Hoog vacuüm vet </td><td> Dow Corning </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 60 mm Petrischalen </td><td> Fisher Scientific </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Poly-L-lysine </td><td> Sigma </td><td> P4707 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td> Ontdooien en aliquot in 150 pi-eenheden </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10082139 </td><td> Gebruik alleen als het induceren van NPC differentiatie nodig, anders gebruikt SFM + EFH cultuur media zoals hierboven aangegeven </td></tr><tr><td> Tellen microscoop </td><td> Olympus </td><td> CKX41 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Leef Cell Time-Lapse Imaging </td></tr><tr><td> Zilverdraad </td><td> Alfa Aesar </td><td> 11434 </td><td></td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> Invitrogen </td><td> 15510-027 </td><td></td></tr><tr><td> Warmte inactiefated FBS </td><td> Sigma </td><td> 16140071 </td><td></td></tr><tr><td> PVC buis </td><td> Fisher Scientific </td><td> 80000006 </td><td> 3/32 &quot;ID x 5/32&quot; OD </td></tr><tr><td> Bleekmiddel </td><td> Clorox </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 10 cc spuit </td><td> BD </td><td> 309604 </td><td></td></tr><tr><td> 18 gauge naald </td><td> BD </td><td> 305195 </td><td></td></tr><tr><td> Dremel boormachine </td><td> Dremel </td><td> Model 750 </td><td></td></tr><tr><td> Omgekeerde microscoop uitgerust met bevochtigde, bebroede kamer </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert-200M </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Recepten <table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Volume </td></tr><tr><td> 2M NaCl </td><td> 6,2 ml </td></tr><tr><td>1M KCl </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> 1M MgCl2 </td><td> 0,32 ml </td></tr><tr><td> 155mm NaHCO3 </td><td> 16,9 ml </td></tr><tr><td> 1M Glucose </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 108 mM CaCl2 </td><td> 0,09256 ml </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Geautoclaveerd water </td><td> 74 ml </td></tr></tbody></table> Kunstmatige cerebrospinale vloeistof <table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Volume of de massa </td></tr><tr><td> Kunstmatige cerebrospinale vloeistof </td><td> 30 ml </td></tr><tr><td> Runderpancreas trypsine </td><td> 40 mg </td></tr><tr><td> Schapen hyaluronidase </td><td> 22,8 mg </td></tr><tr><td> Kynurenic zuur </td><td> 5 mg </td></tr></tbody></table> &lt;strong&gt; trypsine-oplossing <table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Volume of de massa </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Ovomucoïde trypsineremmer </td><td> 10 mg </td></tr></tbody></table> Trypsineremmer Solution <table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Geautoclaveerd water </td><td> 37 ml </td></tr><tr><td> 10X DMEM/F12 </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> 30% Glucose </td><td> 2 ml </td></tr><tr><td> 7,5% NaHCO3 </td><td> 1,5 ml </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> Transferrine, Putrescine oplossing </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> 25 mg insulineoplossing </td><td> 4 ml </td></tr><tr><td> Selenium </td><td> 100 &amp; mu; L </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> 100 pi </td></tr></tbody></table> Hormoon Mix (100 ml totaal, bewaar bij -20 ° C) <table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Geautoclaveerd water </td><td> 37,5 ml </td></tr><tr><td> 10X DMEM/F12 (3:1) </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> 30% Glucose </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> 7,5% NaHCO3 </td><td> 0,75 ml </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> 0,25 ml </td></tr><tr><td> Hormoon mix </td><td> 5 ml </td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> 0,5 ml </td></tr><tr><td> Penicilline-streptomycine </td><td> 0,5 ml </td></tr></tbody></table> Serum Free Media EFH-SFM: voeg 10 ul van EGF, 10 pl van FGF, en 3,66 pi van Heparine FBS-SFM: voeg 0,5 ml FBS <tabaar border = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td> Item </td><td> Volume </td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> 150 pi </td></tr><tr><td> SFM </td><td> 3,6 ml </td></tr></tbody></table> Matrigel Solution Matrigel aliquot wordt geplaatst in een doos ijs en mocht langzaam ontdooien gedurende 4-5 uur om een viskeuze vloeistof te vormen alvorens te mengen met SFM. Dit zal de vorming van een gladde laag Matrigel substraat. Zo niet langzaam ontdooid, zal het resulterende substraat bevatten bosjes Matrigel eventueel belemmeren celmigratie. <table border="1"><tbody><tr><td> Item </td><td> Volume of de massa </td></tr><tr><td> UltraPure Agarose </td><td> 300 mg in 10 ml 2 0 ddH </td></tr><tr><td> SFM Hitte geïnactiveerd FBS </td><td> 8 ml 2 ml </td></tr></tbody></table> MatrigelOplossing Mix 8 ml SFM met 2 ml warmte geïnactiveerd FBS in een 15 cc falcon buis. Mix agarose met 10 ml ddH 2 0 in een Erlenmeyer en warmte in een magnetron gedurende 30 seconden in 10 sec-intervallen, waarbij de oplossing uit de magnetron na elke 10 sec interval en meng. Naar aanleiding van de laatste 10-sec magnetron periode, meng de agarose oplossing met de SFM / FBS oplossing en op te slaan in een 57 ° C waterbad. </td></tr></tbody></table>

een galvanotaxis assay voor analyse van neurale precursoren celmigratie kinetics in een extern aangelegd direct current electric field

A Galvanotaxis Assay for Analysis of Neural Precursor Cell Migration Kinetics in an Externally Applied Direct Current Electric Field

De ontdekking van neurale stamcellen en progenitorcellen (gezamenlijk aangeduid neurale voorlopercellen) (NPC) in de volwassen hersenen van zoogdieren heeft geleid tot een hoeveelheid onderzoek gericht op het gebruik multipotente en proliferatieve eigenschappen van deze cellen voor de ontwikkeling van strategieën neuroregeneratieve. Een kritische stap voor het succes van deze strategieën is de mobilisatie van NPCs naar een laesie na transplantatie exogene of de reactie van de endogene precursors die worden gevonden in de periventriculaire gebied van de CNS verbeteren. Derhalve is het essentieel om de mechanismen bevordering, leiden en verbeteren NPC migratie. Ons werk richt zich op het gebruik van gelijkstroom elektrische velden (dcEFs) het bevorderen en directe NPC migratie - een fenomeen dat bekend staat als galvanotaxis. Endogene fysiologische elektrische velden functioneren als kritische aanwijzingen voor celmigratie tijdens de normale ontwikkeling en wondheling. Farmacologische verstoring van detrans-neurale buis potentieel in axolotl embryo&#39;s veroorzaakt ernstige ontwikkelingsstoornissen afwijkingen 1. In de context van wondheling, is de snelheid van herstel van verwonde hoornvlies direct gecorreleerd met de grootte van de wond epitheliale potentieel dat ontstaat na verwonding, zoals blijkt uit farmacologische versterking of verstoring van dit dcEF 2-3. We toonden aan dat volwassen subependymale NPCs snel en gericht kathodische migratie ondergaan in vitro bij blootstelling aan een extern aangebracht dcEF. In dit protocol beschrijven we ons lab de technieken voor het creëren van een eenvoudige en effectieve galvanotaxis test voor hoge resolutie lange termijn observatie van gericht cellichaam translocatie (migratie) op een single-cell niveau. Deze test zou geschikt zijn voor het onderzoeken van de mechanismen die in cellulaire transductie dcEF motiliteit reguleren door het gebruik van transgene of knock-out muizen, korte interfererende RNA, of specifieke receptor agonisten / antagonisten.

Kinematische analyse blijkt dat in de aanwezigheid van een 250 mV / mm dcEF, ongedifferentieerde NPCs zeer gericht en snelle galvanotaxis naar de kathode (Figuur 5A, Movie 1) vertonen. In afwezigheid van een dcEF wordt willekeurige beweging van de cellen waargenomen (Figuur 5B, Movie 2). Dit veldsterkte&gt; 98% van ongedifferentieerde NPCs migreren voor de gehele 6-8 hr waarvoor zij worden afgebeeld, en aangezien er dode cellen migreren niet suggereert dat zij levensvatbaar blijven gedu...

In dit protocol we zien hoe aangepaste kamers die de toepassing van een gelijkstroom elektrisch veld op time-lapse beeldvorming van volwassen hersenen afgeleide neurale voorlopercel translocatie in galvanotaxis schakelen mogelijk te construeren.

Een Galvanotaxis Assay voor Analyse van neurale precursoren celmigratie Kinetics in een extern aangelegd Direct Current Electric Field

The discovery of neural stem and progenitor  cells (collectively termed neural precursor cells) (NPCs) in the adult  mammalian brain has led to a body of ...

Het algemene doel van deze procedure is om de migratie van uit volwassenen afgeleide neurale precursorcellen te visualiseren in de aanwezigheid van een gelijkstroomveld. Dit wordt bereikt door eerst subependymale neurale precursorcellen uit de volwassen muis te isoleren en te kweken. De volgende stap is het voorbereiden van Galvan Axxis-kamers en het overbrengen van de neurale precursorcellen naar de kamers.De laatste stap is het aanbrengen van een gelijkstroom elektrisch veld over de Galvan Axxis-kamer en het uitvoeren van time-lapse imaging om de migratie van neuroprecursoren te observeren. Uiteindelijk legt de time-lapse imaging microscopie de galvantactische eigenschappen vast van neuroprecursoren in hun gedifferentieerde en ongedifferentieerde toestanden. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de galvano-taxis van neuroprecursorcellen, kan deze ook worden toegepast op andere systemen, zoals een muismodel voor beroerte, voor de rekrutering van neuroprecursoren naar laesieplaatsen om neuronaal herstel te bevorderen.Rob Pilley Post, een promovendus uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren. Wanneer u aan deze procedure begint, moeten de NPC's zeven dagen in kweek zij

a-galvanotaxis-assay-for-analysis-neural-precursor-cell-migration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

We tonen aan dat de overexpressie van de epidermale groeifactor (EGFR) de beweeglijkheid van neurale stamcellen (NSCs) met behulp van een roman agarose gel op basis microfluïdische toestel verbetert. Deze technologie kan gemakkelijk aan te passen aan andere zoogdiercelsystemen waar mobiele bronnen zijn schaars, zoals menselijke neurale stamcellen, en de doorlooptijd is van cruciaal belang.

Het beoordelen van neurale stamcellen Motiliteit Met behulp van een agarosegel-based Microfluïdische Device

Time lapse beeldvorming van 3D-weefselkweek maakt het bestuderen van trekgedrag van de individuele cellen die afkomstig zijn van ganglion eminentie in reactie op gefractioneerde eiwitten halen uit cerebrale cortex.

Trekkende gedrag van cellen gegenereerd in ganglion Eminence culturen

Dit protocol laat zien methoden die worden gebruikt om 2D-en 3D-omgevingen tot stand in de speciaal ontworpen electrotactic kabinet, kan volgen...

Electric Field-gecontroleerde Directed migratie van neurale stamcellen in 2D-en 3D-omgevingen

Onderzoekers kunnen on-demand beweging in C. elegans activeren door een elektrisch veld toe te passen dat wormen voelen en erop reageren.  Deze video introduceert elektrotactisch gedrag en toont een voorbeeldprotocol dat wordt uitgevoerd in een microfluïdisch apparaat.

Electrotaxis Assay: een methode om voortbeweging te observeren in C. elegans

Neuroblast migratie is een fundamentele gebeurtenis in postnatale neurogenese. We beschrijven een protocol voor efficiëntie-etikettering van neuroblasts door in vivo postnatale elektroporatie en de daaropvolgende visualisatie van hun migratie met behulp van time-lapse imaging van acute hersenen plakjes. Wij beschikken over een beschrijving van de kwantitatieve analyse van neuroblast dynamiek door video-tracking.

In vivo Postnatale Elektroporatie en time-lapse imaging van neuroblast Migratie in Muis Acute Brain Slices

We presenteren een methode om een fysiologisch elektrisch veld toe te passen op migrerende, geïmmortaliseerde prostaatcellen in een op maat gemaakte galvanotaxiekamer. Met behulp van deze methode, tonen we aan dat 2 lijnen van niet-tumorigene prostaatcellen verschillende graden van migratiedirectionaliteit in het veld vertonen.

Gebruik te maken van op maat ontworpen galvanotaxis Chambers naar Study Directional Migratie van Prostaat Cellen

Veel microfluïdische apparaten zijn ontwikkeld voor gebruik in de studie van elektrotaxis. Toch laat geen van deze chips toe om de gelijktijdige chemische en elektrische veldeffecten (EF) op cellen efficiënt te bestuderen. We hebben een apparaat op basis van polymethylmethacrylaat ontwikkeld dat een beter gecontroleerde co-existentie van EF en chemische stimulatie biedt voor gebruik in elektrotaxis onderzoek.

Electrotaxis Studies van longkanker-cellen met behulp van een Multichannel Dual-elektrisch veld Microfluïdische Chip

Mechanische krachten zijn belangrijk voor het beheersen van de Celmigratie. Dit protocol demonstreert het gebruik van elastische hydrogels die kunnen worden vervormd met behulp van een glazen micro pipet en een micro manipulator om cellen te stimuleren met een lokale stijfheids gradiënt om veranderingen in celstructuur en migratie teweeg te brengen.

Enkelvoudige cel Duro Taxis assay voor de beoordeling van de mechanische controle van cellulaire beweging en gerelateerde signalering van gebeurtenissen

We presenteren drie eenvoudige in vitro testen-de lange afstand migratie test, de co-cultuur migratie test, en chemo-attractie test-dat gezamenlijk evalueren van de functies van de menselijke stamcel afgeleid periventricular endotheliale cellen en hun interactie met GABAergic interneuronen.

Migratie, Chemo-Attraction, en Co-Culture Assays voor menselijke stamcel-afgeleide endotheelcellen en GABAergic Neuronen

In deze studie presenteren we een protocol voor de differentiatie van neurale stam- en voorlopercellen (NPC's) die uitsluitend worden geïnduceerd door gelijkstroom (DC) pulsstimulatie in een microfluïdisch systeem.

Elektrisch-veld-geïnduceerde neurale precursor celdifferentiatie in microfluïdische apparaten

Leer hoe je een galvanotaxis-assay opzet om neurale voorloper-celmigratie te analyseren in een direct current elektrisch veld. Deze methode gebruikt time-lapse beeldvorming om celgedrag in vivo te bestuderen.

Een Galvanotaxis Assay voor Analyse van neurale precursoren celmigratie Kinetics in een extern aangelegd Direct Current Electric Field (Video) | JoVE Journal

Een Galvanotaxis Assay voor Analyse van neurale precursoren celmigratie Kinetics in een extern aangelegd Direct Current Electric Field

Meer video's verkennen