Name: Elektriciteit-Free, Sequential nucleïnezuur en eiwit isolatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Leer een elektriciteitsvrije methode voor sequentiële isolatie van nucleïnezuren en eiwitten uit diverse monsters. Deze techniek gebruikt vaste-fase extractie met een pipet en is ideaal voor veldonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

De financiering voor de ontwikkeling van de winning pipet werd verstrekt in het kader van een intern onderzoek en ontwikkeling subsidie ​​voor DRP.

1. Voorbeeld Lysis <ol><li> Monsters moet in vloeibare vorm. Als voorbeeld is vast, bijvoorbeeld voedsel of kruk, dient het monster gesuspendeerd in een vloeibaar medium zoals water of fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). </li><li> Meng 500 pi van het monster met 500 pi van 6M guanidinethiocyanaat (pH 6,5) in 1,5 mL buis. </li><li> Druk op de bol van een extractie pipet, het verdrijven van de omgevingslucht. </li><li> Trek de gehele 1 ml monster in de winning pipet, over de sorptiemiddel, doordat de lamp langzaam uit te breiden. </li><li> Keer de extractie tool dat het sorptiemiddel kralen en monster afvoer in de bol. </li><li> Maal het sorbent kralen met het monster in de lamp zorg dat u het monster te verdrijven uit de extractie pipet. </li></ol> 2. Nucleic Acid Extractie (figuur 1, paneel A) <ol><li> Keer de winning pipet (opening naar beneden) en de uitzetting van het monster in de oorspronkelijke 1,5 mL buis. </li> &lt;li&gt; Trek de gehele 1 ml monster in de winning pipet, die over de sorptiemiddel, met een gemiddelde snelheid, let daarbij goed op het sorptiemiddel te houden in de hals van de winning pipet. </li><li> Verdrijf de gehele monster in de 1,5 ml buis door het indrukken van de lamp. </li><li> Herhaal stap 2.2 en 2.3 het monster op het sorptiemiddel vier keer voor een totaal van 5 doorgangen. </li><li> Na de vijfde pas over de sorptiemiddel, de gehele 1 ml monster te verdrijven in 4 ml van het eiwit extractiebuffer (in een 15 ml conische buis), sluit de buis, en zet ze opzij voor later gebruik. </li><li> Was de geïsoleerde nucleïnezuren door het passeren van 1 ml ethanol 95% meer dan het sorptiemiddel drie keer, retourneren van de ethanol in de oorspronkelijke buis bij de laatste passage. </li><li> Herhaal stap 2.6 met behulp van een tweede 1 ml, 95% ethanol wassen. </li><li> Druk op de lamp voor 5 minuten, het passeren van de omgevingslucht in de winning pipet om de nucleïnezuren / sorptiebed drogen. Veeg resterende ethanol uit de punt van de winning pipet uzingen een Kimwipe. </li><li> Terugwinnen nucleïnezuren passeren 250 ul 10 mM Tris (pH 6,8) op het absorptiemiddel vijf keer. De Tris buffer kan worden vervangen door andere geschikte waterige oplossing zoals PBS. De resulterende oplossing bevat de geëxtraheerde nucleïnezuren. </li></ol> 3. Protein Extractie (figuur 1, paneel B) <ol><li> Meng het monster en eiwit extractiebuffer buis vanaf stap 2.5 door omkeren en gaan ongeveer twee tot drie milliliter van deze 5 ml steekproef over het sorptiemiddel van een nieuwe extractie pipet. </li><li> Verdrijf het gehele monster in dezelfde 15 ml conische buis let daarbij goed op het sorptiemiddel te houden in de hals van de winning pipet. </li><li> Herhaal stap 3.1 en 3.2, het monster op het sorptiemiddel 15 keer. </li><li> Was de sorptiemiddel en de gebonden eiwit door het passeren van 1 ml ethanol 95% meer dan het sorptiebed drie keer, het uitwerpen van de ethanol in de originele buis. </li><li> Herhaal stap 3.4 met behulp van een tweede 1 ml, 95% ethanol wassen. </li><html><li> Druk op de lamp voor 5 minuten, het passeren van de omgevingslucht in de winning pipet aan het eiwit / sorptiebed drogen. Veeg resterende ethanol uit de punt van de extractie met behulp van een pipet kimwipe. </li><li> Recover het eiwit door het passeren van 250 ul van PBS over de absorptiemiddel vijf keer. De PBS buffer kan worden vervangen door elke andere geschikte waterige oplossing zoals 10 mM Tris (pH 6,8). De resulterende oplossing bevat het eiwitgehalte van het monster. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1.jpg" alt="Figuur 1A" /> Figuur 1. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" alt="Figuur 3" /> Figuur 3. <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" alt="Figuur 4" /> Figuur 4. inhoud &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" alt="Figuur 5" /> Figuur 5.

<ol><li>Gupta, S. K., Keck, J., Ram, P. K., Crump, J. A., Miller, M. A., Mintz, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+data+gaps+pertaining+to+enterotoxigenic+Escherichia+coli+infections+in+low+and+medium+human+development+index+countries%2C+1984-2005%5BTitle%5D)+AND+%22Epidemiology+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Analysis of data gaps pertaining to enterotoxigenic Escherichia coli infections in low and medium human development index countries, 1984-2005.</a> Epidemiology and Infection. 136, 721-738 (2007).</li>
<li>Pawlowski, D. R. Extraction Pipette. United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).</li>
<li>Boom, R., Sol, C. J., Salimans, M. M., Jansen, C. L., Wertheim-van Dillen, P. M., van der Noordaa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simple+method+for+purification+of+nucleic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Rapid and simple method for purification of nucleic acids.</a> J. Clin. Microbiol. 28, 495-503 (1990).</li>
<li>Karalus, R. J., Pawlowski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+and+Device+for+Isolating+a+Protein+Sample%5BTitle%5D)+AND+%22United+States+Patent+and+Trademark+Office%22%5BJournal%5D)">Method and Device for Isolating a Protein Sample.</a> United States Patent and Trademark Office. , Patent Pending (2010).</li>
<li>Huang, A., Friesen, J., Brunton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+bacteriophage+that+carries+the+genes+for+production+of+Shiga-like+toxin+1+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a bacteriophage that carries the genes for production of Shiga-like toxin 1 in Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 169, 4308-4312 (1987).</li>
<li>O'Brien, A. D., Newland, J. W., Miller, S. F., Holmes, R. K., Smith, H. W., Formal, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shiga-like+toxin-converting+phages+from+Escherichia+coli+strains+that+cause+hemorrhagic+colitis+or+infantile+diarrhea%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Shiga-like toxin-converting phages from Escherichia coli strains that cause hemorrhagic colitis or infantile diarrhea.</a> Science. 226, 694-696 (1984).</li>
<li>Wagner, P. L., Neely, M. N., Zhang, X., Acheson, D. W. K., Waldor, M. K., Friedman, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+for+a+Phage+Promoter+in+Shiga+Toxin+2+Expression+from+a+Pathogenic+Escherichia+coli+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Role for a Phage Promoter in Shiga Toxin 2 Expression from a Pathogenic Escherichia coli Strain.</a> Journal of Bacteriology. 183, 2081-2085 (2001).</li>
<li>Mizutani, S., Nakazono, N., Sugino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+So-called+Chromosomal+Verotoxin+Genes+are+Actually+Carried+by+Defective+Prophages%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Research%22%5BJournal%5D)">The So-called Chromosomal Verotoxin Genes are Actually Carried by Defective Prophages.</a> DNA Research. 6, 141-143 (1999).</li>
<li>Ptashne, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPtashne%2C+M+%22A+Genetic+Switch%3A+Phage+Lambda+Revisited%22">A Genetic Switch: Phage Lambda Revisited</a>. , Third Edition ed, Cold Spring Harbor Press. (2004).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning+%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning : a laboratory manual</a>. , 3rd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2001).</li>
<li>Feng, P., Monday, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+for+detection+of+trait+and+virulence+factors+in+enterohemorrhagic+Escherichia+coli+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR for detection of trait and virulence factors in enterohemorrhagic Escherichia coli serotypes.</a> Mol. Cell. Probes. 14, 333-337 (2000).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De tool, chemie en protocol in dit rapport beschreven staan ​​voor de eerste bekende voorbeeld van een elektriciteit-free, multi-macromolecuul extractie systeem dat gebruikt kan worden in het veld op basis van, point-of-care toepassingen. Beide macromolecuul types kan worden toegepast op een aantal verdere diagnostische of analyseapparatuur. Bijvoorbeeld, de geïsoleerde nucleïnezuren van PCR kwaliteit (figuur 2 en 3), terwijl de eiwitbestanddeel van het monster immunoreactieve (figuur 4). Het gebruik van deze extractie systeem in sobere of bron beperkte gebieden van de wereld zou kunnen drastische vermindering van de ziektelast in de bevolking die er wonen. Deze extractie systeem zou ook kunnen helpen bij de ziekte van bewakingsprogramma&#39;s over de hele wereld door middel van een robuuste maar snelle en kosteneffectieve methode voor het monster verwerking in sobere of externe locaties. Een belangrijk aspect van de extractie methode bovengenoemde datkan worden gewijzigd door de gebruiker. Bijvoorbeeld, wanneer steekproef groter of kleiner dan de initiële 500 μLs (stap 1.2), kan de gebruiker instellen van de hoeveelheden van de reagentia daarvan. Dat wil zeggen, de volumetrische verhouding van de reagentia aan de steekproefomvang moet constant blijven, terwijl het volume in absolute zin kan worden gewijzigd. Ook kan aanpassing van het aantal passages over het sorptiemiddel worden gemaakt naar keuze van de gebruiker. Als bijvoorbeeld een groter monstervolume wordt gebruikt, het monster op het sorptiemiddel vaker dan genoemde (stap 2.4 en 3.3) zal de waarschijnlijkheid van het macromolecuul type (nucleïnezuur of een eiwit) het in aanraking sorptiemiddel. De stijging van de passages moeten verhogen efficiëntie vast te leggen totdat sorbent verzadiging is bereikt. We hebben ontdekt dat de extractie tool en de bijbehorende chemie een aantal beperkingen, de belangrijkste daarvan is dat het eiwit-extractie chemie is inefficiënt voor het herstel van zeer geglycosyleerd hebbeneiwitten. In het geval dat de verdere diagnostische een geglycosyleerd eiwit gericht kan dit stelsel niet geschikt voor identificatie. Bovendien worden de bovenste en onderste grens van extractie efficiënties voor een nucleïnezuren of eiwitten nog bepaald en optimalisatie gang om herstel te maximaliseren. Verdere ontwikkeling van het instrument zal het overwinnen van deze huidige kennis hiaten.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Guanidinethiocyanaat </td><td> Teknova </td><td> G4000 </td></tr><tr><td> ethanol </td><td> Pharmco-Aaper </td><td> 11ACS200 </td></tr><tr><td> 2-propanol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 109827-1L </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A-4503 </td></tr></tbody></table>

elektriciteit-free, sequential nucleïnezuur en eiwit isolatie

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditionele en nieuwe ziekteverwekkers zoals enterohemorragische Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, of prion-ziekten te zijn van grote zorg voor overheden, industrie en medische professionals over de hele wereld. Bijvoorbeeld, EHECS, in combinatie met Shigella, zijn verantwoordelijk voor de dood van ongeveer 325.000 kinderen per jaar en zijn vooral in de ontwikkelingslanden, waar het laboratorium op basis van identificatie, gebruikelijk in de Verenigde Staten, is niet beschikbaar 1. De ontwikkeling en distributie van lage kosten, zou veld-based, point-of-care tools om te helpen bij de snelle identificatie en / of diagnose van pathogenen of ziekte markers drastisch veranderen progressie van de ziekte en de patiënt prognose. Wij hebben een tool ontwikkeld om nucleïnezuren en eiwitten uit een monster isoleren door vaste-fase-extractie (SPE) zonder elektriciteit of aanverwante laboratoriumapparatuur 2. De geïsoleerde macromoleculen kan worden gebruikt voor diagnosis hetzij in een voorwaartse lab of het gebruik van field-based point-of-care platformen. Belangrijk is dat deze methode voorziet in de directe vergelijking van nucleïnezuur en eiwit gegevens uit een niet-splitsing monster, met een vertrouwen door de bevestiging van genomics en proteomics analyse. De isolatie gereedschap gebruikt de standaard voor vaste-fase geïsoleerd nucleïnezuur, de BOOM technologie, die nucleïnezuren een chaotropische zoutoplossing, gewoonlijk guanidine isothiocyanaat door binding aan silica gebaseerde deeltjes of filters 3 isoleert. Eigen vaste fase CUBRC de extractie chemie wordt gebruikt om eiwitten te zuiveren van chaotrope zoutoplossingen, in dit geval uit het afval of stroom-through na nucleïnezuursequentie isolatie 4. Door verpakking chemie gekarakteriseerde in een kleine, goedkope en eenvoudige platform, hebben we een draagbaar gegenereerd voor nucleïnezuur en eiwit-extractie kan worden uitgevoerd onder variety voorwaarden. De geïsoleerde nucleïnezuren zijn stabiel en kunnen worden afgevoerd naar een positie waar vermogen voor PCR amplificatie terwijl het eiwitgehalte kan direct geanalyseerd door gehouden hand of andere immunologische gebaseerde assays. De snelle identificatie van ziekte markers in het veld kan de patiënt uitkomst significant te veranderen door de leiding van de juiste loop van de behandeling in een eerder stadium van de progressie van de ziekte. Het gereedschap en de beschreven methode zijn geschikt voor gebruik met vrijwel alle infectieuze agens en bieden de gebruiker de redundantie van multi-macromolecuul soort analyses en tegelijkertijd de vermindering van de logistieke last.

Nucleic Acid Isolatie: Geïsoleerde nucleïnezuren zijn PCR amplificeerbaar en vrij van eiwit besmetting. Voorbeeld 1: Het teruggewonnen nucleïnezuren geschikt voor PCR-toepassingen. In figuur 2 toont de amplificatie van Shigatoxine genen geassocieerd met enterohemorragische E. coli O157: H7-stam EDL-933 (ATCC # 35150) van een nucleïnezuur / eiwitextractie procedure met behulp van de extractie pipet. De Shiga toxine genen stx 1 en stx 2 worden gevonden op gematigde lambda-achtige bacteriofaag en defecte bacteriofaag in deze en andere enterohemorragische E. coli stammen onder besturing van de P R promoter 5 6 7 8. De activering van SOS de reactie in E. coli leidt tot profaag inductie en / of toxine productie 9. We hebben gebruik gemaakt van een gewijzigde versie van de gemultiplexte PCR door Feng et al. 1.1 op de STX 1 en stx 2 genen bij zowel cultuur als spiked riolering monsters te identificeren. Lanen A en B in figuur 2 tonen de resultaten van een PCR-amplificatie van een onbewerkte cultuur monster (laan A) en verwerkt cultuur monster (laan B). Deze resultaten zijn vrijwel identiek betekent dat er geen verlies van trouw in de verwerkte of geïsoleerde nucleïnezuren. We volgende versterkt spiked ongezuiverd rioolwater (laan D) of geïsoleerde nucleïnezuren uit spiked rioolwater (lanen E &amp; F). Deze gegevens geven aan dat de geïsoleerde nucleïnezuren leidt tot een grotere versterking versus niet-geïsoleerde nucleïnezuren van verrijkte monsters afvalwater. We concluderen daarom dat beide PCR-inhibitoren die van nature in riolering werden verwijderd wanneer de cellen, of dat de nucleïnezuren werden geconcentreerd op isolatie. Een combinatie van deze twee hypothesen is ook mogelijk. Ultraviolet spectroscopie werd vervolgens aangetoond dat het gebruik van de geïsoleerde nucleïnezuren relatief vrij of contaminerende eiwitten. Figuur 3 toont de UV-spectra van twee E. coli O157: H7 nucleïnezuur extracties gelabeld isolatie a en b isolatie, in vergelijking met de genormaliseerde spectrum van de bacteriecultuur gelabeld pre-isolatie. De UV-spectra van de geïsoleerde nucleïnezuren lijkt de spectra van zuivere nucleïnezuren, met een berekend verhouding van absorptie tussen 260 nm en 280 nm 1,8 naderen 10. Deze gegevens tonen dat er weinig verontreinigende eiwit in het nucleïnezuur fractie teruggewonnen met de beschreven techniek. Eiwit Isolatie: Hersteld eiwit uit de nucleïnezuur / eiwitisolatie experiment is immunoreactieve en elektroforetisch identiek aan pure eiwit. Voorbeeld 2: Het geïsoleerde eiwitfractie werd toegepast om de RapidChek E. coli O157 laterale flow test strips (SDIX, Inc.) Controls tonen een positieve identificatie in alle monsters herbergen E. coli<html> O157, met of zonder STX inductie (Figuur 4, banen B en C respectievelijk). De gegevens in fig. 4 tonen ook positieve resultaten die monsters herbergen E. coli O157 die werden verwerkt voor nucleïnezuren en eiwitten met behulp van de winning pipet. Deze gegevens tonen aan dat de geïsoleerde eiwit uit elk monster immunoreactieve is dus waarvan een positieve reactie. PCR amplificatie (zoals beschreven in voorbeeld 1) werd uitgevoerd op het eiwit monsters te zien dat de geïsoleerde eiwitfractie mist contaminerende nucleïnezuren. De resultaten van deze experimenten waren negatief door gelelektroforese. Zo kunnen we concluderen dat het eiwitgehalte van het monster werd gescheiden van contaminerende nucleïnezuren. Deze resultaten, die in zijn geheel met die beschreven voor de nucleïnezuur isolatie stap blijkt dat de nucleïnezuren en eiwitten geïsoleerd in afzonderlijke fractionering stappen. t &quot;&gt; Voorbeeld 3. De geïsoleerde proteïne is geschikt voor elektroforese 10 Figuur 5 toont een Coomassie gekleurd 8% acrylamide gel geladen met BSA (figuur 5 lanen A &amp; C) en BSA geïsoleerd uit 6M guanidine isothiocyanaat met de pipet en bijbehorende protocol. De elektroforetische mobiliteit van de geïsoleerde eiwitten is identiek aan die van de controle monsters. We concluderen dat het extractieproces niet de covalente structuur van de geïsoleerde eiwitten te veranderen. <img alt="Figuur 1a" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1A.jpg" /> Figuur 1, Panel A: Afbeelding van een typische nucleïnezuur extractieprocedure Het monster wordt gemengd met 6M guanidine thiocyanaat in de steekproef buis en hij toog over het sorptiemiddel vijf keer.. Na de laatste passage wordt het monster toegevoegd om het proteïne extractiebuffer. De sorbent gebonden en nucleïnezuren worden tweemaal gewassen met ethanol. Het monster wordt vervolgens lucht dRied en geëlueerd van het sorbens. <img alt="Figuur 1b" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig1B.jpg" /> Figuur 1, Paneel B: Afbeelding van een typische eiwitextractie procedure Het monster, gemengd met eiwit isolatie buffer vanaf stap 1, figuur 1, paneel A wordt over de Sorbens van een tweede extractie pipet 15 keer.. De rest van de procedure is identiek aan die van het nucleïnezuur extractieprotocol. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig2.jpg" /> Figuur 2. Negatief beeld van een ethidium bromide gekleurd agarosegel een gemultiplexte Shigatoxine 1 en 2 genamplificatie experiment werd uitgevoerd met kweken (lanen A en B) of rioolwater monsters verrijkt met E. coli O157: H7 (lanen D, E en F). De monsters werden direct toegevoegd aan een PCR-reactie buis (lanen A en D) of monsters werden behandeld met de isolatie process en geëxtraheerd nucleïnezuren toegevoegd aan de PCR-reactie buis (monsters B, E en F). De PCR-protocol is een modificatie van de beschreven door Feng et al. 11. Onze modificatie alleen gericht die versterkt door de STX 1 (onderste band) en STX 2 (bovenste band) primerparen, vallen alle andere primer paren. Lane C is de 1kb ladder van BioRad. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig3.jpg" /> Figuur 3: UV-spectroscopie resultaten E. coli O157: H7 nucleïnezuren geïsoleerd door middel van de gerapporteerde extractie pipet De geïsoleerde nucleïnezuren zijn gelabeld isolatie een en isolatie. b. De UV-spectrum van het monster werd getest voordat nucleïnezuur extractie en vermeld pre-isolatie. De spectra werden verkregen met een Hitachi U3010 spectrofotometer en bijbehorende pakket. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig4.jpg" /><br/&gt; Figuur 4. Kleurenfoto van RapidChek teststroken het eiwitgehalte van de monsters in figuur 2 werd geïsoleerd met behulp van de pipet en getest voor immuno-reactiviteit laterale stroom assay. Lanes AC niet verwerkt zijn controles, dat wil zeggen, celcultuur werd op de teststrip toegevoegd zonder nucleïnezuur of eiwit-extractie. Lane A E. coli BL21 DE3 pLysS als een negatieve controle, Lanes B en C tonen E. coli O157: H7 die niet behandeld (B), of behandeld met mitomycine C gedurende 4 uur (C). Lanen D door H tonen de resultaten van het toevoegen van de geëxtraheerde eiwit aan het laterale flow teststrips. Lanes D en E werden getest met behulp van eiwit extract van E. coli BL21 DE3 pLysS of zonder (D) of met mitomycine C behandeling (E) als negatieve controles. Lanes FH tonen de resultaten bij het ​​gewonnen eiwit van E. coli O157: H7 werd gebruikt. Eiwit werd geëxtraheerd uit onbehandeld (F), of van 2 uur (G) of 4 uur (H) Mitomycine C behandeld culturen.Positieve resultaten van een dubbele rode lijn. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/4202/4202fig5.jpg" /> Figuur 5. Foto van een Coomassie gekleurde SDS-PAGE BSA werd geïsoleerd uit de oplossing met de pipet en beschreven protocollen. Lanen A en C rijstroken van 250 pg / ml en 500 pg / ml. Lanen B en D tonen teruggewonnen BSA uit oplossingen die dezelfde concentraties als hun controles.

Een instrument en chemicaliën beschreven sequentieel isoleren nucleïnezuren gevolgd door eiwitten van een monster zonder electriciteit. De tool bestaat uit een sorptiemiddel gehouden binnen een transferpipet, terwijl de isolatie chemie zijn gebaseerd op de vaste-fase-extractie principes. De geïsoleerde macromoleculen kan geanalyseerd worden door immuno-gebaseerde en PCR-gebaseerde assays.

Elektriciteit-Free, Sequential nucleïnezuur en eiwit isolatie

Traditionele en opkomende pathogenen, zoals enterohemorragische Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis of prionziekten, vormen een aanzienlijk punt van zorg ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van PCR-klare nucleïnezuren en immunoreactieve eiwitten uit een monster, zonder dat daar elektriciteit of laboratoriuminfrastructuur voor nodig is. De isolatie van nucleïnezuren en eiwitten begint met het mengen van het monster met guanidine en thiocyanaat om het monster te lyseren, waarna het mengsel door het sorbent in de extractiepipet wordt geleid. Na de vijfde en laatste passage over het sorbent wordt het mengsel overgebracht naar de eiwitextractiebuffer en opzij gezet voor het isoleren van het immunoreactieve eiwit.Vervolgens worden het sorbent en de gebonden nucleïnezuren gewassen door 95% ethanol over het sorbent te leiden. De sorbent en gebonden nucleïnezuren worden vervolgens meerdere malen gedroogd door gedurende vijf minuten omgevingslucht over het sorbent te leiden. De laatste stap voor de isolatie van PCR-klare nucleïnezuren is het elueren van de nucleïnezuren van het sorbent met behulp van 250 µL tris of een andere soortgelijke waterige oplossing voor isolatie van het immunoreactieve eiwit.Nadat het monster en de eiwitextractiebuffer zijn gemengd, wordt een tweede extractiepipet gebruikt om het mengsel 15 keer over het sorbent te leiden. De volgende stap is het wassen van het sorbent met het gebonden eiwit door herhaaldelijk 95% ethanol over het sorbent te leiden. Vervolgens worden het sorbent en het gebonden eiwit gedroogd door gedurende vijf minuten omgevingslucht over het sorbent te leiden.De laatste stap van het protocol is het elueren van het eiwit uit het sorbent. Uiteindelijk maakt de extractiepipet die in deze procedure wordt gebruikt, de isolatie van PCR-klare nucleïnezuren en immunoreactieve eiwitten mogelijk zonder gebruik van elektriciteit. Hallo, mijn naam is Dave Pawlowski.Ik ben senior onderzoeker bij Kubrick Incorporated in Buffalo, New York, en vandaag gaan we een techniek leren waarmee zowel eiwitten als nucleïnezuren in één proces worden geïsoleerd, zonder dat daarvoor een centrifuge, een vortexmixer of andere extra laboratoriumapparatuur nodig is. Zorg ervoor dat de monsters in vloeibare vorm zijn voordat u overgaat tot lysering van het monster. Indien het monster solide is, bijvoorbeeld voedsel of feces, moet het monster worden gesuspendeerd in een vloeibaar medium zoals water of fosfaatgebufferde zoutoplossing.Meng 500 µL van het monster met 500 µL guanidine thiocyanaat 6 M in een buisje van 1,5 mL. Druk vervolgens op het reservoir van een extractiepipet om de aanwezige lucht te verdrijven. Trek het volledige monster van 1 mL door het absorberende materiaal in de extractiepipet door het reservoir langzaam te laten uitzetten.Keer het extractie-instrument om zodat de sorbentiaalkrallen en het monster in de bulb lopen. Maal de sorbentiaalkrallen samen met het monster in de bulb. Zorg er hierbij voor dat het monster niet uit de extractiepipet wordt gestuwd.Keer de extractiepijpet om en breng het monster terug in de oorspronkelijke buis van 1,5 milliliter. Trek het volledige monster van één milliliter in de extractiepijpet, waarbij u met een matig tempo over het sorbiens gaat. Zorg ervoor dat het sorbiens in de hals van de extractiepijpet blijft en breng het volledige monster door op de peer te drukken terug in de buis van 1,5 milliliter.Herhaal dit proces door het monster nog vier keer over het sorbent te leiden, voor een totaal van vijf passes. Na de vijfde pass over het sorbent wordt het volledige monster van 1 milliliter uitgestoten in 4 milliliter proteïne-extractiebuffer in een conische buis van 15 milliliter. Meng de buis door deze om te keren, sluit de buis vervolgens en zet deze opzij voor later gebruik.Was de geïsoleerde nucleïnezuren door drie keer één milliliter 95%ethanol over het sorbent te laten lopen, waarbij de ethanol telkens wordt teruggebracht in de oorspronkelijke buis. Herhaal deze wasstap na de laatste passage nog drie keer met een tweede milliliter 95%ethanol. De volgende stap van de procedure is het drogen van het sorbent; het herstel van de nucleïnezuren verloopt het beste wanneer het sorbent droog is.Ik weet dat deze stap tijdrovend is. Echter, als u deze stap binnen het aanbevolen tijdsbestek voltooit, zullen uw resultaten beter zijn. Knijp vijf minuten lang herhaaldelijk in de peer.Sla omgevingslucht door de extractiepipet om de nucleïnezuren en het sorbentbed te drogen, en veeg resterende ethanol van de punt van de extractiepipet af. Herwin de nucleïnezuren door met een Kim wipe vijf keer 250 µL 10 mM Tris over het sorbent te leiden.De resulterende oplossing bevat de geëxtraheerde nucleïnezuren. Om eerst eiwitextractie uit te voeren, mengt u het monster door de buis om te keren in de proteïne-extractiebuffer die eerder apart was gezet. Breng ongeveer twee tot drie milliliter van dit monster van vijf milliliter over de sorbent van een nieuwe extractiepipet. Pipetteer het gehele monster in dezelfde conische buis van 15 milliliter. Let er hierbij op dat de sorbent in de hals van de extractiepipet blijft.Herhaal dit proces door het monster 15 keer over het sorbent te leiden. Was het sorbent en het gebonden eiwit door drie keer één milliliter 95%Ethanol over het sorbentbed te leiden, waarbij de ethanol in de oorspronkelijke buis wordt opgevangen; was vervolgens drie keer opnieuw met een tweede milliliter 95%ethanol.De volgende stap van de procedure is om het sorbent opnieuw te drogen. Net als bij nucleïnezuren wordt de eiwitrecovery het best uitgevoerd wanneer het sorbent gedurende een langere periode is gedroogd.Druk vijf minuten lang op de peer en laat deze weer los, zodat er omgevingslucht door de extractiepipet stroomt. Veeg het resterende ethanol van de punt van de extractiepipet af om het eiwitsorbensbed te drogen. Herwin het eiwit door met een Kim wipe vijfmaal 250 µL PBS over het sorbens te leiden.De PBS-buffer kan worden vervangen door elke andere geschikte waterige oplossing, zoals 10 millimolair tris, pH 6,8. De resulterende oplossing bevat het eiwitgehalte van het monster. De shiga-toxinegenen geassocieerd met enterohemorragische E. coli O157:H7 stam EDL933 werden geamplificeerd vanuit een nucleïnezuur-eiwitextractieprocedure met gebruik van de extractiepipet.De shiga-toxinegenen, shiga-toxine één en shiga-toxine twee, bevinden zich op temperaat lambda-achtige bacteriofagen en defecte bacteriofagen onder controle van de PR-promotor. De activatie van de SOS-respons in E. coli leidt tot profagen-inductie en/of toxineproductie. In dit geval is er een aanzienlijke toename in de amplificatie van het shiga-toxine twee-gen wanneer de SOS-respons wordt geïnduceerd door mitomycine C in vergelijking met de onbehandelde controle.Dit wijst op pro-faaginductie en replicatie van het faaggenoom. Het eiwit dat is teruggewonnen uit de experimenten voor de isolatie van nucleïnezuren en eiwitten, zoals beschreven in de video, is immunoreactief. De geïsoleerde eiwitfractie is aangebracht op de Rapid Check E. coli O157 lateral flow-teststrips.Controles vertonen een positieve identificatie in alle monsters die e coli oh 1 5 7 bevatten, met of zonder Shigatoxine-inductie, zoals gevisualiseerd door de aanwezigheid van twee rode banden. De gegevens tonen daarnaast positieve resultaten voor die monsters met e coli oh 1 5 7 waarbij nucleïnezuren en eiwitten zijn verwerkt met behulp van de extractiepipet. Deze gegevens tonen aan dat het geïsoleerde eiwit uit elk monster immuunoactief is en hiermee een positieve respons uitlokt.Het geïsoleerde eiwit is geschikt voor elektroforese, zoals hier afgebeeld in een met kumasi gekleurde 8% acrylamidegel geladen met BSA, geïsoleerd uit zes molaire gudina-isothiocyanaat. Met gebruik van de extractie, de pipet en het bijbehorende protocol is de elektroforetische mobiliteit van het geïsoleerde eiwit identiek aan die van de controlemonsters. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in minder dan 20 minuten worden uitgevoerd.Na het bekijken van deze video heeft u een duidelijk inzicht gekregen in hoe u eiwitten en nucleïnezuren uit het eenvoudige apparaat kunt isoleren. Bedankt voor uw tijd en het bekijken van onze video.

electricity-free-sequential-nucleic-acid-and-protein-isolation

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Isotachophoresis (ITP) is een robuuste elektrokinetische scheiding en preconcentratiestap techniek met toepassingen variërend van toxine detectie tot monstervoorbereiding. Wij beoordelen de fysische principes van ITP en de methodologie van het toepassen van deze techniek om twee specifieke voorbeeld toepassingen: scheiding en detectie van kleine moleculen en zuivering van nucleïnezuren uit celkweek lysaat.

On-chip Isotachophoresis voor de scheiding van ionen en zuivering van nucleïnezuren

Bron: Dembowski, J. A., et al. Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins. J. Vis. Exp. (2017).Deze video demonstreert de isolatie van eiwit-viraal DNA-complexen uit celkernen met behulp van click-chemie en purificatie met magnetische beads. Het protocol omvat het labelen van virale genomen met alkyn-gemodificeerde nucleotiden, biotinylering via een click-reactie en binding aan streptavidine-gecoate magnetische beads. Na het wassen en hitte-elutie...

Isolatie van eiwitten uit viraal DNA-eiwitcomplexen

TruTip is een eenvoudige nucleïnezuur extractie technologie waarbij een poreuze monolithische bindende matrix wordt in een pipetpunt. Bijgevolg monstervoorbereiding compatibel is met de meeste vloeistofverwerking instrumenten, en kan worden gebruikt voor vele medium tot hoog-klinische toepassingen en soorten monsters.

High-throughput, geautomatiseerde extractie van DNA en RNA uit klinische monsters met behulp TruTip Technology op Common Liquid Handling Robots

We beschrijven een efficiente en rendabele methode voor het extraheren van nucleïnezuur uit uitstrijkjes ter karakterisering van bacteriële 16S rRNA gen gebruiken amplicon sequencing. De methode maakt het mogelijk voor een gemeenschappelijke aanpak voor de verwerking van meerdere soorten monster en herbergt een aantal downstream-analytische processen.

Efficiënte Nucleic Acid Extraction en 16S rRNA Gene Sequencing voor Bacteriële Gemeenschap karakterisering

We beschrijven hier een eenvoudige en snelle papieren DNA extractiewerkwijze HIV provirale DNA uit vol bloed gedetecteerd met kwantitatieve PCR. Dit protocol kan worden verlengd voor gebruik bij het detecteren andere genetische merkers of alternatieve amplificatiewerkwijzen.

Filtratie Isolatie van nucleïnezuren: Een eenvoudige en snelle DNA Extraction Method

Het doel van dit protocol is te specifiek tag en selectief isoleren viraal DNA van geïnfecteerde cellen voor de karakterisatie van het virale genoom geassocieerde eiwitten.

Zuivering van viraal DNA voor de identificatie van geassocieerde virale en cellulaire eiwitten

Hier presenteren we een nieuwe aanpak om te identificeren plantenvirussen met dubbele streng DNA genomen. Wij gebruiken standaard methoden uittreksel DNA en RNA van besmette bladeren en uitvoeren van de volgende generatie sequencing. Bioinformatic hulpmiddelen assembleren sequenties in contigs, identificeren van contigs vertegenwoordigen virus genomen en genomen aan taxonomische groepen toewijzen.

Het combineren van de analyse van DNA in een ruwe Virion extractie met de analyse van RNA van besmette bladeren om te ontdekken van nieuwe Virus Genomes

Hier wordt een DNA-extractieprotocol beschreven met behulp van magnetische kralen om DNA-extracties van hoge kwaliteit van muggen te produceren. Deze extracties zijn geschikt voor een downstream next-generation sequencing benadering.

Een op magnetische kraal gebaseerd mosquito-DNA-extractieprotocol voor sequencing van de volgende generatie

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de bereiding en bufferkalibratie van celextracten uit exonuclease V knock-out stammen van Escherichia coli BL21 Rosetta2 (ΔrecBCD en ΔrecB). Dit is een snelle, eenvoudige en directe benadering voor expressie in celvrije eiwitsynthesesystemen met behulp van lineaire DNA-sjablonen.

Celvrije eiwitsynthese uit exonuclease-deficiënte cellulaire extracten met behulp van lineaire DNA-sjablonen

Een kort protocol voor eiwitkleuring met Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels wordt beschreven zonder gebruik te maken van organische oplosmiddelen of azijnzuur als in de klassieke kleuren procedures met CBB.

Kleuring van eiwitten in Gels met Coomassie G-250 zonder organisch oplosmiddel en azijnzuur

Leer een elektriciteitsvrije methode voor sequentiële isolatie van nucleïnezuren en eiwitten uit diverse monsters. Deze techniek gebruikt vaste-fase extractie met een pipet en is ideaal voor veldonderzoek.

Elektriciteit-Free, Sequential nucleïnezuur en eiwit isolatie

Meer video's verkennen