Zuivering en Aggregatie van het amyloïde voorlopereiwit intracellulaire domein

Het doel van deze procedure is om het amyloïde precursor-eiwit intracellulaire domein, ook bekend als A ICD, te zuiveren en een protocol te presenteren voor thermische aggregatie en karakterisering van de A ICD door middel van atoomkrachtmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst A GST-fusie van A ICD in bacteriën tot expressie te brengen. Vervolgens wordt het G-S-T-A-I-C-D-eiwit gezuiverd en gekliefd met trombine om de GST van A ICD te scheiden en wordt de GST verwijderd.

Daarna wordt thermische aggregatie van A ICD geïnduceerd. Ten slotte worden de A ICD-aggregaten afgebeeld met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die aantonen dat de A ICD kan worden gezuiverd tot homogeniteit in een hoeveelheid die voldoende is voor biochemische en biofysische analyse.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek boven bestaande methoden, die complexe chromatografiestappen vereisen, is dat zeer puur en oplosbaar. A ICD kan op de werktafel worden geïsoleerd met behulp van standaardreagentia en apparatuur. A ICD geproduceerd door dit protocol is geschikt voor verdere biochemische en biofysische karakterisering.

De procedure zal worden gedemonstreerd door Amina ti. Een voormalige postdoc voor mijn laboratorium, Dr. Andres Oberer, zal demonstreren hoe de atoomkrachtmicroscopie-beeldvorming van A ICD uit te voeren om het recombinante A PP intracellulaire domein of A ICD tot expressie te brengen. Begin met BL 21-cellen getransformeerd met de pgx 41-vector, die het humane A ICD bevat, gefuseerd met het C-terminus van GST met een enkele kolonie, inoculeer 10 milliliter LB-bouillon met ampicilline en incubeer een nacht bij 37 graden Celsius met krachtig schudden de volgende ochtend.

Incubeer 400 milliliter LB-ampicilline in een literflas met vijf milliliter van de overnachtelijke cultuur. Incubeer bij 37 graden Celsius met krachtig schudden tot de optische dichtheid bij 600 nanometer 0,4 tot 0,6 heeft bereikt. Dit duurt normaal gesproken twee tot 2,5 uur om de expressie van G-S-T-A-I-C-D te induceren.

We voegen 0,4 millimolair IPTG toe en incuberen bij 37 graden Celsius met krachtig schudden gedurende vijf uur. Centrifugeer de cellen bij 6.000 keer G gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius en bewaar de pellet bij min 80 graden Celsius. Na het voorbereiden van lysis, buffer en het gooien van bacteriën op ijs, voeg 20 milliliter buffer toe aan de pellet en gebruik een combinatie van vortexen en tation op ijs met een pipet grondig.

Reese schorsen het bacteriële pellet door de Reese geschorste bacteriële lysate door een voorgekoelde emulsifier of French press te laten passeren. Bij 30.000 PSI laat het lysate een tweede keer door de emulsifier passeren en verzamel het lysate in een voorgekoelde 50 milliliter buis. Centrifugeer het lysate bij 15.000 keer G en vier graden Celsius gedurende 30 minuten.

Scheiden en breng het supinate over in een voorgekoelde 50 milliliter buis. Voeg 500 microliter van een 50% slurry van glutathion toe. Roteer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius terwijl het monster roteert.

Maak na de incubatie een verse elutiebuffer. Giet het lysate en de slurry in een wegwerpbare vijf inch polystyreen chromatografiekolom met grove filters. Was de kolom vijf keer met drie milliliter PBS.

Dicht de bodem van de kolom af en voeg 500 microliter kamertemperatuur, elutiebuffer toe. Sluit de bovenkant van de kolom af en roteerd gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verzamel het vroege gewicht in een gekoelde 1,5 milliliter micro afvalbuis.

Herhaal de elutie nog twee keer. Dialyseer het eluaat in een 10.000 molecuulgewicht cutoff dialyse membraan in vier liter PBS een nacht bij vier graden Celsius de volgende dag. Dialyseer tegen een extra vier liter PBS bij vier graden Celsius gedurende één uur.

Verwijder het eiwit uit de dialyse cassette en voer een eiwit kwantificeringstest uit om de opbrengst van G-S-T-A-I-C-D te bepalen. Een typische zuivering uit 400 milliliter cultuur resulteert in opbrengsten van meer dan 20 milligram gezuiverd eiwit bij concentraties van 10 tot 20 milligram per milliliter. Verdeel het eiwit in 200 microliter aliquoten en bewaar bij min 80 graden Celsius.

Om het A ICD van GST te bevrijden, ontdooi 200 microliter van gezuiverd G-S-T-A-I-C-D en voeg 20 microreleases van één eenheid per microliter trombine toe, incubeer een nacht bij 37 graden Celsius de volgende dag, verwijder eventueel geaggregeerde materiaal door centrifugatie bij 20.000 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Breng het SUPINAAT over in een voorgekoelde microbuis om GST en trombine te verwijderen. Voeg 50 microliter van 50% glutathion aro slurry en 50 microliter 50%p en wino zaine aro slurry toe.

Incubeer met rotatie gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Centrifugeer kort om de agro-kralen te sedimenteren en verwijder het supinate in een verse buis. Extraheer het GST nog vier keer met glutathion.

Voer een eiwit kwantificatie test uit op vijf microliter van het gezuiverde A ICD. Typische opbrengsten van een 400 milliliter cultuur zijn 50 tot 100 microgram bij een concentratie van 0,2 tot 0,5 milligram per milliliter. Na het verdunnen van vers bereid A ICD in PBS tot een concentratie van 0,1 milligram per milliliter werd thermische aggregatie geïnduceerd door de monsters gedurende 48 uur te incuberen bij 43 graden Celsius bij 800 RPM in een verwarmde shaker.

Verdun het monster 20 keer met gedeïoniseerd water en breng twee microliter aan op vers gekliefde. Mica droogt het monster een nacht in een drooggemaakt om de geaggregeerd A ICD te visualiseren met behulp van atoomkrachtmicroscopie in tapping mode met goud gecoate. Micro scherpe nitride cantilevers met een nominale tipradius van twee nanometer.

Typische tapping amplituden tijdens beeldvorming, een 10 tot 20 nanometer bij de resonantiefrequentie van de cantilevers. De expressie en relatieve verrijking van G-S-T-A-I-C