Name: Isolatie van cardiomyocyten Kernen van Post-mortem weefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Leer cardiomyocyt-kernen isoleren uit postmortaal weefsel met homogenisatie, dichtheidsgradientcentrifugatie en fluorescentie-geactiveerde cel sortering. Deze methode biedt hoge zuiverheid voor genexpressie- en epigenetische analyses.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We willen graag Marcelo Toro erkennen voor de hulp bij flowcytometrie. Deze studie werd ondersteund door de Zweedse Hart-en Long Foundation, EU-Commissie KP7 &quot;CardioCell&quot;, Zweedse Raad voor Onderzoek, AFA verzekeringen en ALF. OB werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft.

1. Isolatie van de Cardiac Kernen <ol><li> Coat ultracentrifuge buizen (Beckman centrifugebuizen # 363664) met 10 ml van 1% BSA / PBS coating oplossing. Cap de buizen en laten roteren gedurende 30 min in een buis rotator. Verwijder de coatingoplossing en laat de centrifugebuis drogen (een buis per muizenhart is voor de analyse van de muis hart, afwisselend tot 5 muizen hart of 1 g hartweefsel van een andere soort (bijv. humane) kunnen worden verwerkt in een buis). </li><li> Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd op het ijs. Ontleden van de linker ventrikel van verse of snap-bevroren muis hart met een scalpel. Merk dit protocol geoptimaliseerd voor muizenhart, maar kan ook worden aangepast om rat of menselijk hart. Als alternatief gebruik tot 1 g van het hartweefsel van een andere soort. </li><li> Knip het monster in kleine hokjes met een scalpel. </li><li> Breng de weefselstukken in een 50 ml Falcon buis gevuld met 15 ml lysisbuffer. </li><li> Homogeniseer dehartweefsel met T-25 Ultra-Turrax probe homogenisator (IKA) bij 24.000 rpm gedurende 10 sec. </li><li> Verdun het homogenaat met een gelijk volume lysis buffer 30 ml. </li><li> Gebruik een glazen douncer (40 ml) verder gehomogeniseerd het weefsel en de kernen vrij. Voer acht slagen met een grote ruimte stamper. </li><li> Passeer de ruwe kernen te isoleren door middel van een 100 micrometer en 70 micrometer nylon mesh cel zeef (BD Biosciences), achter elkaar. </li><li> Draai beneden de ruwe kernen isoleren in een gekoelde centrifuge (4 ° C) 700 g gedurende 10 minuten. </li><li> Verwijder de bovenstaande vloeistof door het omkeren van de buizen en veeg de binnenkant van de buis met een papieren handdoek. Zorg ervoor dat u de kernen pellet te verstoren. </li><li> Los de ruwe kernen in 5 ml sucrose buffer isoleren door pipetteren de oplossing een paar keer op en neer. Toevoegen nog 25 ml buffer sucrose op de opgeloste pellet. </li><li> Voeg 10 ml vers bereide sucrose buffer om de gecoate ultracentrifuge buis (zie stap 1.1). &lt;/ Li&gt; <li> Voorzichtig bedekken de toegevoegde 10 ml sucrose buffer met de geresuspendeerde kernen pellet opgelost in sucrose buffer vanaf stap 1.9. </li><li> De balans van de centrifugebuizen voordat u ze in een JS13.1 gratis swingende rotor en plaats de rotor op een high-speed centrifuge (Beekman Avanti S-25). </li><li> Draai de kernen monster bij 13.000 xg bij 4 ° C gedurende 60 minuten. </li><li> Wanneer de rotatie is voltooid voorzichtig de buizen van de rotor en het supernatans door omkeren van de buizen en afvegen van het resterende vuil van de binnenzijde van de buizen met een papieren handdoek. </li><li> Los de kernen pellet in 1 ml van de kernen opslagbuffer (NSB plus buffer). Let op: NSB plus bevat 1,5 mM spermine als een DNA-stabilisator. </li><li> Ga verder met stap 2.1, immunokleuring van cardiomyocyt kernen. </li></ol> 2. Immunokleuring voor flowcytometrie <ol><li> Bereid de negatieve controle voor immunokleuring. Neem een ​​hoeveelheid van 20 ul uit de kernen monster en eendd 980 pi NSB plus buffer. </li><li> Voeg anti-pericentriolar materiaal 1 antilichaam (konijn anti-PCM-1, Atlas Antilichamen) om de kernen monster in een verdunning van 1:500 tot immunolabel cardiomyocyt kernen. Voeg de isotype antilichaam in dezelfde verdunning de anti-PCM-1 antilichaam met de negatieve controle, bereid in stap 2.1. </li><li> Incubeer negatieve controle en monsterbuis bij 4 ° C gedurende de nacht. </li><li> Was de negatieve controle en monster ten minste een keer met NSB plus buffer (spin down buizen in een gekoelde centrifuge (4 ° C) bij 700 xg gedurende 10 minuten. Gooi supernatant en de kernen pellet in 1 ml van de NSB plus buffer op te lossen). </li><li> Voeg anti-konijn fluorescerende secundair antilichaam (FITC of APC) om negatieve controle en proef de buis in een verdunning van 1:1000. </li><li> Incubeer negatieve controle en monsterbuis bij 4 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Was negatieve controle en monster ten minste eenmaal met NSB plus buffer (spin neer buizen in een gekoelde centrifuge (4 ° C) 700 g gedurende 10 min. Gooi bovenstaande vloeistof en los de kernen pellet in 1 ml van de NSB plus buffer). </li><li> Ga verder met de flowcytometrische analyse en sortering. </li></ol> 3. Flowcytometrie <ol><li> Coat kernen collectie buizen (Falcon 15 ml) met 1% BSA / PBS-oplossing voor u flowcytometrie sorteren, zoals beschreven in stap 1.1 te starten. </li><li> Filter het monster en de negatieve controle door middel van een 30 micrometer cel zeef en plaats eerst de negatieve controle op de flowcytometer (BD instroom). Definieer de eerste en de tweede poort naar de kernen en singlets (enkele kernen) te definiëren, op basis van voorwaartse verstrooiing (FSC), voorwaartse verstrooiing pulsbreedte (FS pulsbreedte) en zijwaartse verstrooiing (SSC) (afb. 2a en b). Het toevoegen van een DNA-kleuring (DRAQ5 (1:500)) om het monster kan helpen om de kernen de bevolking in eerste instantie te identificeren. </li><li> Plaats de immunolabeled monster en definiëren van de derde poort aan cardiomyocyt kernen (PCM-1-positve) isoleren van niet-cardiomyocyt kernen (PCM-1-negatief). Start het sorteren(Fig. 2c en d). </li></ol> Optioneel: Met het oog op de nucleaire DNA-inhoud (ploïdie) te analyseren en om de celcyclus analyse uit te voeren voeg toe een passende DNA-vlek op de kernen (bijv. Hoechst 33342 of DRAQ5) (fig. 2e). <ol start="4"><li> Na flowcytometrie sorteren, plaats de kernen op het ijs en opnieuw te analyseren naar de sorteerruimte zuiverheid (afb. 3a en b) te bepalen. </li><li> Draai beneden de gesorteerde kernen in de verzameling buizen 1500 xg in een gekoelde centrifuge 15 minuten. </li><li> Los het kernen pellet in een buffer verenigbaar met de stroomafwaartse toepassing. </li></ol> 4. Representatieve resultaten Kernen morfologie en integriteit kan worden beoordeeld door DNA-vlekken en gevisualiseerd door microscopie (afb. 1). Succesvolle PCM-1 labeling kan worden geëvalueerd door epifluorescente microscopie en door flow cytometrie (Fig. 1 en Fig. 2c en d). PCM-1-positive en negatieve populaties moet goed van elkaar gescheiden (fig. 2c en d). In muizen linkerventrikel ongeveer 30% van kernen moeten cardiomyocyten kernen zijn (Fig. 2d). Sorteren zuiverheid kan worden beoordeeld door opnieuw het analyseren van de gesorteerde kernen (fig. 3a en b). Beide kernen de bevolking moet een sorteer-zuiverheidsgraad van meer dan 95%. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig1.jpg" /> Figuur 1. PCM-1 zijn cardiomyocyt kernen. Cardiac kernen (a) gekleurd met antilichamen tegen PCM-1 (b) en Nkx2.5 (c) in een volwassen muizenhart. (D) PCM-1-label kernen worden omgeven door cardiomyocyte cytoplasma (myosine heavy chain (MHC)) en drukken de transcriptiefactor Nkx2.5, documenteren de juiste identificatie van cardiomyocyten kernen door PCM-1 kleuring (schaalbalken 20 pm en 10 um (d, inzet)). (E) Cardiac kernen isolaten gevisualiseerd met de DNA-vlek DRAQ5. (F en g) Cardiomyocyte kernen worden aangeduid met antilichamen tegen PCM-1 (schaal bar 10 urn). Let op, de epinuclear kleuringspatroon van PCM-1 in myocyte kernen in weefsel sectie en in afgelegen kernen (pijlen). <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig2.jpg" /> Figuur 2. Flowcytometrische sorteren van cardiomyocyt kernen. (A) Cardiac kernen worden geïdentificeerd door voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC). (B) Een tweede poort identificeert enkele kernen van FSC en FS pulsbreedte 5. (C, d) TL gating kan de scheiding van cardiomyocyten kernen (PCM-1-positieve) en niet-cardiomyocyten (PCM-1-negatieve) kernen van hartweefsel. (E) Muis cardiomyocyt veelal (&gt; 80%) diploïde (2n), slechts een klein deel is tetraploïde (4n) 6. Let op, de menselijke cardiomyocyten bevatten een hogere frequentie van polyploïdie kernen (&gt; 2n) 7,8. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4205/4205fig3.jpg" /> <strong&gt; Figuur 3. Zuiverheid analyse van gesorteerde cardiomyocyten niet-cardiomyocyt kernen. Re-analyse van gesorteerde niet-cardiomyocyt (a) en cardiomyocyten kernen (b). Beide populaties laten een sorteer-zuiverheidsgraad van meer dan 99%.

<ol><li>Ang, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limitations+of+conventional+approaches+to+identify+myocyte+nuclei+in+histologic+sections+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Cell+physiology%22%5BJournal%5D)">Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart.</a> American journal of physiology. Cell physiology. , 298-1603 (2010).</li>
<li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cardiomyocyte+nuclei+and+assessment+of+ploidy+for+the+analysis+of+cell+turnover%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">Identification of cardiomyocyte nuclei and assessment of ploidy for the analysis of cell turnover.</a> Experimental cell research. 327, 188-194 (2011).</li>
<li>Bergmann, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Cardiomyocyte+Renewal+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Evidence for Cardiomyocyte Renewal in Humans.</a> Science. 324, 98-102 (1126).</li>
<li>Walsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+cell+cycle+control+and+growth+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte cell cycle control and growth estimation.</a> Cardiovascular Research. , 1-31 (2010).</li>
<li>Spalding, K., Bhardwaj, R. D., Buchholz, B., Druid, H., Frisén, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrospective+birth+dating+of+cells+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retrospective birth dating of cells in humans.</a> Cell. 122, 133-143 (2005).</li>
<li>Adler, C. P., Friedburg, H., Herget, G. W., Neuburger, M., Schwalb, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability+of+cardiomyocyte+DNA+content%2C+ploidy+level+and+nuclear+number+in+mammalian+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch%22%5BJournal%5D)">Variability of cardiomyocyte DNA content, ploidy level and nuclear number in mammalian hearts.</a> Virchows Arch. 429, 159-164 (1996).</li>
<li>Herget, G. W., Neuburger, M., Plagwitz, R., Adler, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+content%2C+ploidy+level+and+number+of+nuclei+in+the+human+heart+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">DNA content, ploidy level and number of nuclei in the human heart after myocardial infarction.</a> Cardiovascular Research. 36, 45-51 (1997).</li>
<li>Adler, C. P., Friedburg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+DNA+content.+ploidy+level+and+cell+number+in+geriatric+hearts%3A+postmortem+examinations+of+human+myocardium+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial DNA content. ploidy level and cell number in geriatric hearts: postmortem examinations of human myocardium in old age.</a> Mol. Cell Cardiol. 18, 3953-39 (1986).</li>
<li>Dubois, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRPA+is+a+specific+cell-surface+marker+for+isolating+cardiomyocytes+derived+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells.</a> Nature. 29, 1011-1018 (2011).</li>
<li>Hattori, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nongenetic+method+for+purifying+stem+cell-derived+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 7, 61-66 (2010).</li>
<li>Fransioli, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+c-kit-Positive+Cell+Response+to+Pathological+Challenge+in+the+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Evolution of the c-kit-Positive Cell Response to Pathological Challenge in the Myocardium.</a> Stem Cells. 26, 1315-1324 (2008).</li>
<li>Elliott, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NKX2-5%28eGFP%2Fw%29+hESCs+for+isolation+of+human+cardiac+progenitors+and+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">NKX2-5(eGFP/w) hESCs for isolation of human cardiac progenitors and cardiomyocytes.</a> Nature Methods. 8, 1037-1040 (2011).</li>
<li>Laflamme, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+Cardiomyocyte+Repopulation+by+Extracardiac+Progenitors+in+Transplanted+Human+Hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Evidence for Cardiomyocyte Repopulation by Extracardiac Progenitors in Transplanted Human Hearts.</a> Circulation Research. 90, 634-640 (2002).</li>
<li>Srsen, V., Fant, X., Heald, R., Rabouille, C., Merdes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+proteins+form+an+insoluble+perinuclear+matrix+during+muscle+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Centrosome proteins form an insoluble perinuclear matrix during muscle cell differentiation.</a> BMC cell biology. 10, 28(2009).</li>
<li>Spoelgen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flow+cytometry-based+technique+to+measure+adult+neurogenesis+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel flow cytometry-based technique to measure adult neurogenesis in the brain.</a> Journal of neurochemistry. 119, 165-175 (2011).</li>
<li>Soonpaa, M. H., Kim, K. K., Pajak, L., Franklin, M., Field, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyocyte+DNA+synthesis+and+binucleation+during+murine+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Cardiomyocyte DNA synthesis and binucleation during murine development.</a> The American journal of physiology. 271, H2183-H2189 (1996).</li>
<li>Olivetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cardiac+hypertrophy+and+ischemic+cardiomyopathy+do+not+affect+the+proportion+of+mononucleated+and+multinucleated+myocytes+in+the+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Aging, cardiac hypertrophy and ischemic cardiomyopathy do not affect the proportion of mononucleated and multinucleated myocytes in the human heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1463-1477 (1996).</li>
<li>Okada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+sorting+of+neuronal+and+glial+nuclei+from+central+nervous+system+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+physiology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric sorting of neuronal and glial nuclei from central nervous system tissue.</a> Journal of cellular physiology. 226, 552-558 (2011).</li>
<li>Matevossian, A., Akbarian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Nuclei+Isolation+from+Human+Postmortem+Brain+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Neuronal Nuclei Isolation from Human Postmortem Brain Tissue.</a> J. Vis. Exp. (20), e914(2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Nauwkeurige identificatie van cardiomyocyt kernen is van cruciaal belang voor de analyse van regeneratieve processen in het myocard 2,3. Conventionele technieken voor cardiomyocyten van sel isoleren zijn hoofdzakelijk gebaseerd op enzymatische afbraak van de extracellulaire matrix en de daaropvolgende zuivering van interstitiële cellen door centrifugeren lage snelheid. Verdere zuivering van levende cardiomyocyten van embryonale stamcellen (SER) kan worden uitgevoerd door immunokleuring met markers zoals Sirpa...

<table border="1"><tbody><tr><td> 1. Lysisbuffer </td></tr><tr><td> Naam van het serum </td></tr><tr><td> 0,32 M sucrose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM CaCl2 </td></tr><tr><td> 5 mM magnesiumacetaat </td></tr><tr><td> 2,0 mM EDTA </td></tr><tr><td> 0,5 mM EGTA </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 2. Sucrose buffer </td></tr><tr><td> Naam van het serum </td></tr><tr><td> 2.1 M sucrose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 8) </td></tr><tr><td> 5 mM magnesiumacetaat </td></tr><tr><td> 1 mM DTT </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> 3. Kernen opslagbuffer (NSB plus) </td></tr><tr&gt; <td> Naam van het serum </td></tr><tr><td> 0,44 M sucrose </td></tr><tr><td> 10 mM Tris-HCl (pH = 7,2) </td></tr><tr><td> 70 mM KCl </td></tr><tr><td> 10 mM MgCl2 </td></tr><tr><td> 1,5 mM spermine </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td> Reagentia en apparatuur </td><td> Vennootschap </td></tr><tr><td> Isotype konijnen-IgG-CHIP Grade, # ab37415 </td><td> Abcam </td></tr><tr><td> Konijn anti-PCM-1 antilichaam, # HPA023374 </td><td> Atlas Antilichamen </td></tr><tr><td> Donkey sec. antilichaam, anti-konijn Alexa Fluor 488, # A-21206 of een gelijkwaardige sec. fluorescentie-antilichaammethode </td><td> Life Technologies </td></tr><tr><td> DRAQ5 </td><td> Biostatus </td></tr><tr><td> cell filters 30 pm, 70 pm en 100 pm </td><td> BD Biosciences </td></tr><tr><td> Glas douncer (40 ml) enstamper &quot;L&quot; </td><td> VWR (Wheaton Industries Inc) </td></tr><tr><td> T-25 Ultra-Turrax Homogenizer </td><td> IKA Duitsland </td></tr><tr><td> Dispergeren hulpmiddel S25 N-18 G </td><td> IKA Duitsland </td></tr><tr><td> Beckman Avanti Centrifuge </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Falcon Buizen 15 ml en 50 ml </td><td> VWR </td></tr><tr><td> Beckman Centrifugebuizen # 363664 </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> JS13.1 gratis swingende rotor </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Instroom cytometer </td><td> Beckman Coulter </td></tr><tr><td> Tube Rotator </td><td> VWR </td></tr></tbody></table>

isolatie van cardiomyocyten kernen van post-mortem weefsel

Isolation of Cardiomyocyte Nuclei from Post-mortem Tissue

Identificatie van cardiomyocyten kernen is een uitdaging in het weefsel secties als de meeste strategieën vertrouwen op cytoplasmatische marker-eiwitten 1. Zeldzame gebeurtenissen in hartspiercellen zoals de proliferatie en apoptose vereisen een nauwkeurige identificatie van de cardiale myocyten kernen om celvernieuwing in de homeostase en in pathologische voorwaarden 2 te analyseren. Hier bieden we een methode om cardiomyocyt kernen te isoleren van post mortem weefsel door de dichtheid sedimentatie en immunokleuring met antilichamen tegen pericentriolar materiaal 1 (PCM-1) en de daarop volgende flowcytometrie sorteren. Deze strategie zorgt voor een hoge doorvoer analyse en isolatie met het voordeel van het werken even goed op verse en bevroren weefsel archiefmateriaal. Dit maakt het mogelijk te onderzoeken materiaal reeds verzamelde biobanken. Deze techniek is en getest in een groot aantal soorten en geschikt voor diverse toepassingen later zoals koolstof-14 datering 3 cel-cykel analyse 4, visualisatie van thymidine-analogen (bv. BrdU en IDU) 4, transcriptoom en epigenetische analyse.

Cardiale kernen worden geïsoleerd via dichtheid sedimentatie en immunolabeled met antilichamen tegen pericentriolar materiaal 1 (PCM-1) te identificeren en cardiomyocyten kernen sorteren op flowcytometrie.

Isolatie van cardiomyocyten Kernen van Post-mortem weefsel

De identificatie van cardiomyocytkernen in weefselcoupes is uitdagend gebleken, aangezien de meeste strategieën uitsluitend vertrouwen op cytoplasmatische markerproteïnen1. Zeldzame gebeurtenissen ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van cardiomyocytenkernen uit postmortem weefsel. Dit wordt bereikt door het weefsel eerst te homogeniseren met een probe-homogenisator en een glazen stamper, gevolgd door verschillende filtratiestappen. De tweede stap is het isoleren van de kernfractie van de andere cellulaire fracties door middel van dichtheidsgradientcentrifugatie.Vervolgens worden de cardiomyocytekernen immunogelabeld met een antilichaam tegen PCM1. De laatste stap is het isoleren van de gelabelde cardiomyocytekernen middels fluorescentie-geactiveerde celsortering. Uiteindelijk, vlak voor verdere downstream manipulatie, wordt de zuiverheid van de cardiomyocytekernen bevestigd door re-analyse van de gesorteerde nucleaire fracties.Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat cardiomyocytekernen even goed geanalyseerd kunnen worden vanuit vers of bevroren gearchiveerd weefsel op een high-throughput wijze. DNA-gebaseerde studies in cardiomyocyten zijn om verschillende redenen bijzonder uitdagend. Ten eerste vormen cardiomyocyten slechts ongeveer 20 30% van de cellen in het hart.Bovendien zijn ze in aanzienlijke mate genucleerd. Daarnaast zijn cardiomyocyten in aanzienlijke mate polyploïd. De hier beschreven methode overwint al deze hindernissen.Voordat u met de procedure begint: coat ultracentrifugebuisjes met 10 milliliters van een coatingoplossing bestaande uit 1%BSA plus PBS. Nadat de buisjes gedurende 30 minuten zijn geroteerd, verwijdert u de coatingoplossing en laat u ze aan de lucht drogen.Start de procedure voor de isolatie van cardiaca nuclei door met een scalpel de linker ventrikel te dissekeren uit een snap-frozen muizenhart. Trim het gedisseceerde monster tot kleine segmenten en breng de weefselstukjes vervolgens over in een conische buis van 50 milliliter gevuld met 15 milliliter lysisbuffer. Homogeniseer daarna het hartweefsel met een probe-homogenisator op 24 000 RPM gedurende 10 seconden en verdun het homogenaat vervolgens met een gelijk volume lysisbuffer tot 30 milliliter. Breng het homogenaat over naar een glazen down-homogenisator en gebruik acht slagen met een stamper met grote speling om de nuclei vrij te maken.Filter vervolgens de ruwe kernen. Isoleer deze eerst via een cellzeef van 100 micron en daarna via een cellzeef van 70 micron in een schone conische buis van 50 milliliter. Centrifugeer het ruwe kernisolaat vervolgens gedurende 10 minuten bij 700 ×g en vier graden Celsius.Keer de buis om om het supernatant voorzichtig te verwijderen en veeg vervolgens de binnenkant van de buis schoon met een papieren handdoek. Let erop dat de pellet met celkernen niet wordt verstoord. Pipetteer de oplossing meerdere keren op en neer om de ruwe kernen opnieuw te suspenderen.Resuspendeer in vijf milliliter sucrosebuffer en voeg vervolgens nog eens 25 milliliter sucrosebuffer toe aan de kernsuspensie. Voeg daarna 10 milliliter vers bereide sucrosebuffer toe aan een van de eerder voorbereide gecoate ultracentrifugebuizen. Breng vervolgens voorzichtig de oplossing van de geresuspendeerde kernpellet aan bovenop de buffer.Nadat de buis in een vrijhangende rotor is gebalanceerd, wordt de rotor in een hogesnelheidscentrifuge geplaatst en het kernmonster 60 minuten gecentrifugeerd bij 13,000 ×g en vier °C. Wanneer de centrifugatie is voltooid, worden de buizen voorzichtig uit de rotor verwijderd en opnieuw omgekeerd. Om het supernatant te verwijderen, wordt het resterende residu zoals voorheen met een papieren handdoek van de binnenkant van de buis afgeveegd, waarna het kernpellet wordt geresuspendeerd in één mL kernbewaarbuffer.Voordat u begint met de immunokleuringsprocedure, brengt u een aliquot van 20 µL van het kernmonster over naar een faxbuisje. Voeg 980 µL kernbewaarbuffer toe aan de aliquot en label het buisje als negatieve controle. Voeg nu anti-PCM1-antilichaam toe aan het kernmonster en de buisjes met de negatieve controle in een verdunning van 1:500.Incubeer beide buisjes vervolgens gedurende de nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag, na het wassen van de buisjes met de nucleusbewaarbuffer en het weggooien van het supernatant, worden de nucleuspellets gesuspendeerd in nog een milliliter nucleusbewaarbuffer.Voeg vervolgens een anti-konijn fluorescent secundair antilichaam toe aan de celmonsters in een verdunning van 1:100 en incubeer deze gedurende één uur bij 4 °C. Na het wassen van de buisjes met kernopslagbuffer worden de pellets opnieuw gesuspendeerd in 1 mL kernopslagbuffer voor flowcytometrische sortering en analyse. Nadat de buisjes voor het opvangen van kernen zijn gecoat met BSA en PBS, zoals aan het begin van de video, begint men met het filteren van het monster en de negatieve controle door individuele cellenzeven van 30 µm. Voeg vlak voor het laden een DNA-kleuring toe.Voeg een verdunning van 1:500 toe voor de identificatie van de kernpopulaties. Laad de negatieve controle in de flowcytometer. Gebruik de parameters voor forward scatter en side scatter om de eerste gate te plaatsen voor het definiëren van de cardiale kernen, vergelijkbaar met de DOT-plot die hier wordt getoond.Gebruik vervolgens de parameters voor forward scatter en forward scatter pulse width om een tweede gate rond de kern-singlets te creëren, vergelijkbaar met de hier getoonde DOT-plot. Laad nu het immunogelabelde monster en plaats de derde gate om de PCM one positieve cardiomyocytenkernen te differentiëren van de PCM one negatieve niet-cardiomyocytenkernen. Gebruik de nucleaire DNA-kleuring om het DNA-gehalte te analyseren en om een celcyclusanalyse uit te voeren, vergelijkbaar met de analyse die door dit histogram wordt geïllustreerd.Nadat de kernen op basis van hun PCM1-positiviteit zijn gesorteerd, worden de gesorteerde kernen op ijs geplaatst en wordt een aliquot van elk gesorteerd monster opnieuw geanalyseerd om de zuiverheid van de sortering te bepalen. Centrifugeer vervolgens de gesorteerde kernen in hun opvangbuisjes gedurende 15 minuten bij 1500 ×g en 4 °C. Na het verwijderen van de supernatanten worden de kernpellets geresuspendeerd in een buffer die compatibel is met de gewenste downstream-applicatie.In deze eerste figuur is een hart van een volwassen muis gekleurd met een kernkleurstof en antilichamen tegen PCM one, de harttranscriptiefactor NK X 2.5 en myosin heavy chain of MHC. Hier wordt een close-up getoond van de overlay uit de vorige figuur. Let op hoe de met PCM one gelabelde kernen in het wit de transcriptiefactor NK X 2.5 in het rood tot expressie brengen en omringd zijn door cardiomyocyten-cytoplasma in het groen.Deze gegevens tonen samen de nauwkeurigheid aan waarmee PCM one-kleuring cardiomyocytekernen identificeert. De inzet benadrukt het epi-nucleaire kleuringspatroon van PCM one in myocardkernen, zoals verder aangegeven door de pijlen in het experiment dat in de volgende drie figuren wordt afgebeeld; geïsoleerde hartkernen werden gekleurd met de DNA-kleurstof DRAC five en met antilichamen tegen PCM one. Hier, in de overlay van de vorige twee figuren, markeren de pijlen opnieuw het epi-nucleaire kleuringspatroon van PCM one in de geïsoleerde cardiomyocytekernen.Deze dotplot laat zien dat ongeveer 30% van de met deze methode geïsoleerde kernen cardiomyocytenkernen zijn, zoals aangegeven door hun PCM one-labeling. Ten slotte, zoals deze histogrammen illustreren, zijn muis cardiomyocytenkernen primair diploïd, wat blijkt uit de twee N-piek, en is slechts een klein deel tetraploïd, zoals aangegeven door de kleinere vier N-piek. Een van de voordelen van deze techniek is dat deze eenvoudig kan worden aangepast voor andere soorten.Net als bij mensen.

isolation-of-cardiomyocyte-nuclei-from-post-mortem-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Huidige kennis over de cellulaire basis van hartziektes vertrouwt vooral op studies op diermodellen. Hier beschrijven we en validatie van een nieuwe methode om enkele levensvatbare hartspiercellen te verkrijgen van kleine chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Menselijke hartspiercellen en kan worden gebruikt voor elektrofysiologische studies en drugstesten.

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

Het kwantificeren van cardiomyocytenvernieuwing is een uitdaging. Het hier beschreven protocol levert een belangrijke bijdrage aan deze uitdaging door nauwkeurige en gevoelige kwantificering van neo-cardiomyocytkerngeneratie en kern-ploïdie mogelijk te maken.

Gelijktijdig Beoordeling van Cardiomyocyte DNA Synthese en Ploïdie: een methode om Assist Kwantificering van Cardiomyocyte Regeneration en Omzet

Om celdeling te onderscheiden van variaties in de celcyclus in cardiomyocyten, presenteren we protocollen met behulp van twee transgene muislijnen: Myh6-H2B-mCh transgene muizen, voor de ondubbelzinnige identificatie van cardiomyocytenkernen, en CAG-eGFP-anillin muizen, voor het onderscheid tussen celdeling en variaties in de celcyclus.

Visualisatie van celcyclus Variaties en Bepaling van Nucleatie in Postnatale Cardiomyocytes

Het doel van dit werk is het ontwikkelen van een methode om cardiomyocyten reproduceerbaar te isoleren van het volwassen hart en het DNA-gehalte en nucleatie te meten.

Isolatie van Cardiomyocyten uit vaste harten voor immunocytochemie en ploidy-analyse

Gepresenteerd is een protocol voor de isolatie van menselijke en dierlijke ventriculaire cardiomyocyten van vibratome-cut myocardische plakjes. Hoge opbrengsten van calciumtolerante cellen (tot 200 cellen/mg) kunnen worden verkregen uit kleine hoeveelheden weefsel (&lt;50 mg). Het protocol is van toepassing op myocardium dat tot 36 uur aan koude ischemie wordt blootgesteld.

Isolatie van human ventriculaire cardiomyocyten van Vibratome-Cut Myocardial Slices

We ontwikkelden een simple-methode voor het isoleren van hoogwaardige individuele muishartcellen door de antegrade perfusietechniek. Deze methode is Langendorff-vrij en nuttig voor het isoleren van ventriculaire en atriale myocyten of interstitiële cellen, zoals hartfibroseblasten of voorlopers.

Een Antegrade Perfusie methode voor Cardiomyocyt isolatie van muizen

De gouden standaard in de cardiologie voor cellulaire en moleculaire functionele experimenten zijn cardiomyocyten. Dit artikel beschrijft aanpassingen aan de niet-Langendorff-techniek om cardiomyocyten bij muizen te isoleren.

Een eenvoudige en effectieve methode om cardiomyocyten van muizen consequent te isoleren

Hier beschrijven we een protocol om een voldoende hoeveelheid enkele niet-cardiomyocyten met hoge levensvatbaarheid te isoleren uit een post-myocardinfarct (MI) muizenhart. Dit kan worden gebruikt voor daaropvolgende single-cell sequencing, flowcytometrie-analyse en primaire celcultuur.

Voorbereiding van een niet-cardiomyocytencelsuspensie voor single-cell RNA-sequencing van een post-myocardinfarct volwassen muizenhart

Hier presenteren we een protocol dat de voorbereiding van celkernen beschrijft. Na microdissectie en enzymatische dissociatie van hartweefsel in afzonderlijke cellen, werden de voorlopercellen bevroren, gevolgd door isolatie van zuivere levensvatbare cellen, die werden gebruikt voor single-nucleus RNA-sequencing en de single-nucleus assay voor transposase-toegankelijk chromatine met high-throughput sequencing-analyses.

Kernisolatie van hartvoorlopercellen van muizen voor epigenoom- en genexpressieprofilering met eencellige resolutie

Weefselmonsters van de coronaire endarterectomie werden verwerkt om enkele kernen te isoleren met behulp van een geoptimaliseerd dissociatieprotocol. De integriteit van de geïsoleerde kernen werd gevalideerd via drie complementaire benaderingen: trypan blue exclusion kleuring om membraanintegriteit te beoordelen, DAPI-gebaseerde confocale microscopie om de kernmorfologie te bevestigen, en flowcytometrie om kernopbrengst en zuiverheid te kwantificeren.

Isolatie van enkele kernen uit het coronaire endarterectomieweefsel van coronaire bypass-transplantatiepatiënten

Leer cardiomyocyt-kernen isoleren uit postmortaal weefsel met homogenisatie, dichtheidsgradientcentrifugatie en fluorescentie-geactiveerde cel sortering. Deze methode biedt hoge zuiverheid voor genexpressie- en epigenetische analyses.

Isolatie van cardiomyocyten Kernen van Post-mortem weefsel

Meer video's verkennen