Name: Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Leer calciumresponsies in GFP-gelabelde hypothalamusneuronen monitoren met rood fluorescerende indicator en confocale microscopie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar neurale signaaltransmissie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken onze collega&#39;s die hebben deelgenomen aan het werk samengevat hier. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 894), &#39;Integrative analyse van reukzin&#39; de DFG Schwerpunktprogramm 1392 en door de Volkswagen Foundation (TLZ). TLZ is een Lichtenberg hoogleraar van de Volkswagen Stichting.

<ol><li>Almholt, K., Arkhammar, P. O., Thastrup, O., Tullin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+of+the+translocation+of+protein+kinase+Calpha-green+fluorescent+protein+hybrids+and+intracellular+calcium+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization of the translocation of protein kinase Calpha-green fluorescent protein hybrids and intracellular calcium concentrations.</a> Biochem. J. 337 (Pt 2), 211-218 (1999).</li>
<li>Bolsover, S., Ibrahim, O., O'Luanaigh, N., Williams, H., Cockcroft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescent+Ca2%2B+dyes+with+green+fluorescent+protein+and+its+variants%3A+problems+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescent Ca2+ dyes with green fluorescent protein and its variants: problems and solutions.</a> Biochem. J. 356, 345-352 (2001).</li>
<li>Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+requirements+for+the+activation+of+vomeronasal+sensory+neurons+by+MHC+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides.</a> Nat. Neurosci. 12, 1551-1558 (2009).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+identification+of+GnRH+receptor+neurons%3A+a+new+model+for+studying+neural+circuits+underlying+reproductive+physiology+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Genetic identification of GnRH receptor neurons: a new model for studying neural circuits underlying reproductive physiology in the mouse brain.</a> Endocrinology. 152, 1515-1526 (2011).</li>
<li>Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+pancreatic+beta-cells+in+the+intact+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Endocrinol.+Metab%22%5BJournal%5D)">Imaging pancreatic beta-cells in the intact pancreas.</a> Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 290, E1041-E1047 (2006).</li>
<li>Doherty, A. J., Coutinho, V., Collingridge, G. L., Henley, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+internalization+and+surface+expression+of+a+functional%2C+fluorescently+tagged+G-protein-coupled+glutamate+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor.</a> Biochem. J. 341 (Pt 2), 415-422 (1999).</li>
<li>Kurebayashi, N., Harkins, A. B., Baylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fura+red+as+an+intracellular+calcium+indicator+in+frog+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Use of fura red as an intracellular calcium indicator in frog skeletal muscle fibers.</a> Biophys. J. 64, 1934-1960 (1993).</li>
<li>Heyward, P. M., Chen, C., Clarke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonadotropin-releasing+hormone+modifies+action+potential+generation+in+sheep+pars+distalis+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroendocrinology%22%5BJournal%5D)">Gonadotropin-releasing hormone modifies action potential generation in sheep pars distalis gonadotropes.</a> Neuroendocrinology. 58, 646-654 (1993).</li>
<li>Leinders-Zufall, T. Technique for setting up the perfusion of a recording chamber for physiological studies with cultured and acutely dissociated cells. , Avaliable from: 
	 <a target="_blank" href="
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf">
	http://www.warneronline.com/pdf/whitepapers/perfusion_strategies.pdf</a> (1998).</li>
<li>Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+noninvasive+intracellular+pH+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator.</a> Biophys. J. 74, 1591-1599 (1998).</li>
<li>Wen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+genetically+labeled+gonadotropes%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of genetically labeled gonadotropes.</a> Endocrinology. 149, 2701-2711 (2008).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , 2nd edn, Academic Press. (2001).</li>
<li>Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+pheromones+to+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">From pheromones to behavior.</a> Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).</li>
<li>Kelliher, K. R., Wersinger, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+regulation+of+the+sexual+behavior+and+reproductive+physiology+of+the+laboratory+mouse%3A+effects+and+neural+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Olfactory regulation of the sexual behavior and reproductive physiology of the laboratory mouse: effects and neural mechanisms.</a> ILAR J. 50, 28-42 (2009).</li>
<li>Yoon, H., Enquist, L. W., Dulac, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+inputs+to+hypothalamic+neurons+controlling+reproduction+and+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Olfactory inputs to hypothalamic neurons controlling reproduction and fertility.</a> Cell. 123, 669-682 (2005).</li>
<li>Boehm, U., Zou, Z., Buck, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+loops+link+odor+and+pheromone+signaling+with+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Feedback loops link odor and pheromone signaling with reproduction.</a> Cell. 123, 683-695 (2005).</li>
<li>Wilson, J. M., Dombeck, D. A., Diaz-Rios, M., Harris-Warrick, R. M., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+calcium+imaging+of+network+activity+in+XFP-expressing+neurons+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Two-photon calcium imaging of network activity in XFP-expressing neurons in the mouse.</a> J. Neurophysiol. 97, 3118-3125 (2007).</li>
<li>Hu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+near-atmospheric+concentrations+of+CO2+by+an+olfactory+subsystem+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Detection of near-atmospheric concentrations of CO2 by an olfactory subsystem in the mouse.</a> Science. 317, 953-957 (2007).</li>
<li>Perez, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transient+receptor+potential+channel+expressed+in+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A transient receptor potential channel expressed in taste receptor cells.</a> Nat. Neurosci. 5, 1169-1176 (2002).</li>
<li>Trollinger, D. R., Cascio, W. E., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+loading+of+Rhod+2+into+mitochondria+shows+mitochondrial+Ca2%2B+transients+during+the+contractile+cycle+in+adult+rabbit+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Selective loading of Rhod 2 into mitochondria shows mitochondrial Ca2+ transients during the contractile cycle in adult rabbit cardiac myocytes.</a> Biochem Biophys. Res. Commun. 236, 738-742 (1997).</li>
<li>Properties of Asante Calcium Red - a novel ratiometric indicator with long excitation wavelength. Meshik, X. A., Hyrc, K. L., Goldberg, M. P. Neuroscience Meeting Planner, , Society for Neuroscience. San Diego, CA. (2010).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Een belangrijke vraag in de neurowetenschappen is om te begrijpen hoe de hersenen sociale informatie verwerkt. Een grote bron van informatie die nodig is voor de sociale erkenning wordt gecodeerd door olfactorische of feromooncommunicatie signalen. De detectie van deze signalen door neuronale populaties in de neus en de erkenning van de signalen in de hersenen, vooral de hypothalamus, spelen een belangrijke rol in vele maatschappelijke processen en invloed hormonen en andere factoren neuroendocrine 13-16. Een...

There was a typo in the abstract of <a href="http://www.jove.com/video/4213">Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices</a>.

Erratum: Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Cat. N ° </td></tr><tr><td> Agar-agar </td><td> Sigma </td><td> A1296 </td></tr><tr><td> Fura-red/AM </td><td> Invitrogen </td><td> F-3021 </td></tr><tr><td> Pluronic F-127 </td><td> Sigma </td><td> P2443 </td></tr><tr><td> Dimethylsulfoxide </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP231 </td></tr><tr><td> Vibrerende-Blade Microtoom Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9770170 </td></tr><tr><td> Koeling CU 65 voor Microtoom Hyrax V 50 </td><td> Zeiss </td><td> 9920120 </td></tr><tr><td> O 2 / CO 2-Incubator, CB210-UL </td><td> Binder </td><td> 0019389 </td></tr><tr><td> Super lijm, Loctite 406TM </td><td> Henckel </td><td> 142580 </td></tr><tr><td> Dubbele spatels, lepel vorm </td><td>Bochem </td><td> 3182 </td></tr><tr><td> Microlepel spatels, lepel vorm </td><td> Bochem </td><td> 3344 </td></tr><tr><td> Spring Schaar, Moria-Vannas-Wolff - 7mm Blades </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.370-52 </td></tr><tr><td> Spring Schaar, Vannas - 3mm Blades </td><td> Fine Science Tools </td><td> 15.000-00 </td></tr><tr><td> Wagner Schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14.071-12 </td></tr><tr><td> Medische tang, Dumont 7b </td><td> Fine Science Tools </td><td> 11.270-20 </td></tr><tr><td> Grote rechthoekige Open Bath Chamber (RC-27) </td><td> Warner Instruments </td><td> 64-0.238 </td></tr><tr><td> Confocale microscoop BioRad Radiance 2100 </td><td> Zeiss </td><td> na </td></tr></tbody></table>

imaging calcium reacties in gfp-gelabelde neuronen van de hypothalamus mouse brain slices

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Ondanks de enorme toename van de kennis van de onderliggende mechanismen van het coderen van informatie in de hersenen, een centrale vraag over de precieze moleculaire stappen en de activiteit van bepaalde neuronen in multifunctionele kernen van hersengebieden zoals de hypothalamus blijven. Dit probleem omvat de identificatie van de moleculaire componenten betrokken bij de regulatie van verschillende neurohormoon signaalcascades. Verhogingen van de intracellulaire Ca 2 + spelen een belangrijke rol in het reguleren van de gevoeligheid van neuronen, zowel op het niveau van signaaltransductie en synaptische plaatsen. Nieuwe instrumenten ontstaan ​​om neuronen in de veelheid van hersenneuronen identificeren door expressie green fluorescent protein (GFP) onder de controle van een specifieke promotor. Om zowel ruimtelijk als tijdelijk stimulus-geïnduceerde Ca 2 + volgen responsen in GFP-gelabelde neuronen, een niet-green fluorescent Ca 2 + n indicatorkleurstofeeds worden gebruikt. Bovendien is een confocale microscopie favoriete methode imaging individuele neuronen in weefselcoupes vanwege zijn vermogen om neuronen in verschillende vlakken diepte visualiseren in het weefsel en out-of-focus fluorescentie beperken. De ratiometrische Ca 2 + indicator fura-2 werd gebruikt in combinatie met GFP-gelabelde neuronen 1. Echter wordt de kleurstof geëxciteerd door ultraviolet (UV) licht. De kosten van de laser en de beperkte optische indringdiepte van UV licht belemmerd het gebruik in vele laboratoria. Bovendien kan GFP fluorescentie interfereren met de fura-2 signalen 2. Daarom was een rode fluorescerende Ca2 + indicator kleurstof te gebruiken. De enorme Strokes verschuiving van fura red-maakt multicolor analyse van het rode fluorescentie in combinatie met GFP met een excitatiegolflengte. We hadden eerder goede resultaten met behulp van fura-rood in combinatie met GFP-gemerkte olfactorische neuronen 3. De protocollen voor olfactorische weefselcoupes leek te e werkenqually goed in de hypothalamus neuronen 4. Fura-red gebaseerd Ca 2 + imaging werd eveneens met succes in combinatie met GFP-gelabelde pancreatische β-cellen en GFP-gemerkte receptoren tot expressie gebracht in HEK cellen 5,6. Een beetje gril van fura-rood is dat de fluorescentie-intensiteit bij 650 nm is lager dan de indicator bindt calcium 7. Daarom is de fluorescentie van rustende neuronen met lage Ca2 + concentratie relatief hoge intensiteit. Er zij opgemerkt dat andere rode Ca 2 +-indicatorkleurstoffen bestaan ​​of zijn in ontwikkeling, zou dat een beter of betere resultaten in verschillende neuronen en hersengebieden.

In dit protocol, updaten we de recente vooruitgang in de beeldvorming Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signalen van GFP-gemerkte neuronen in hersenweefsel plakjes met een rode fluorescerende Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Indicator kleurstof.

Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices

Ondanks een enorme toename in onze kennis over de mechanismen die ten grondslag liggen aan de codering van informatie in de hersenen, blijft een centrale vraag met betrekking tot de ...

Het algemene doel van deze procedure is om stimulus-geïnduceerde calciumresponsen te monitoren, zowel ruimtelijk als temporeel, in GFP-gelabelde neuronen in hersensecties met behulp van een niet-groene fluorescente calciumindicator-kleurstof. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen te extraheren van een transgene muis die GFP tot expressie brengt in specifieke cellen. De tweede stap is het prepareren van weefselsecties met een microtoom.Vervolgens wordt de laadoplossing van de calciumindicatorkleurstof op de coupes gepipetteerd, zodat de kleurstof door de hersencellen kan worden opgenomen. De laatste stap is het uitvoeren van een tijdstempelopname van fluorescerende cellen met behulp van confocale microscopie. Uiteindelijk worden calciumresponsen in GFP-gelabelde neuronen getoond met behulp van multicolor calcium-imaginganalyse.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor confocale microscopie is dat we calcium kunnen afbeelden in groen fluorescerende GFP-neuronen met behulp van een roodverschoven fluorescerende calciumindicator-kleurstof. De enorme Stokes-verschuiving van de rode kleurstof stelt ons in staat om een multicolor-analyse uit te voeren van de rode fluorescentie in combinatie met het groene GFP met behulp van een enkele excitatiegolflengte. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we geconfronteerd werden met het probleem om calciumsignalen te monitoren in neuronen die we alleen konden identificeren met behulp van een genetische fluorescentietechniek, namelijk het groen fluorescerende eiwit.Ik zal nu verschillende kritieke stappen van deze procedure demonstreren. Begin de procedure door de verhitte agarlopossing in een vierkante Petrischaal tot een hoogte van één centimeter te gieten; nadat de 4% agargel is afgekoeld en gestold, wordt deze gesneden in blokjes van één kubieke centimeter en in een flesje geplaatst voor bewaring. Snijd, na het onthoofden van de muis, de hoofdhuid met een enkelzijdig scheermes in sagittale richting van het frontale bot naar de externen occipitale protuberantie.Open vervolgens de ingesneden hoofdhuid verder, eerst in rostrale laterale richting. Daarna in ventrale richting. Maak vervolgens twee laterale en één rostrale incisie.Splits de schedel voorzichtig open bij het foramen magnum met een kleine veerschaar. Op dit moment moeten het occiput, de interpariëtale botten en de pariëtale botten zijn losgekoppeld. Als de dura mater nog aanwezig is, dient deze voorzichtig met een pincet te worden verwijderd om beschadiging van de hersenen te voorkomen.Verwijder vervolgens het squama-bot, het voorste etmoïdale gat en het frontale foramen. Nu kan het brein eenvoudig worden verwijderd met een omgekeerde microspatel en kunnen de schedelnerven worden doorgebroken. Het brein moet op de ventrale zijde op een snijbestendig oppervlak landen, met de ventrale zijde van het brein naar beneden.Gebruik een enkelzijdig scheermesje om het cerebellum te verwijderen. Dit rechte snijvlak dient als basis voor het monteren van de hersenen op een plaat, zodat coronale hersendoorsneden kunnen worden gemaakt. Lijm vervolgens de hersenen met het snijvlak op de basisplaat van de microtoom met een kleine hoeveeling snelhardende, hoogwaardige cyanoacrylaatlijm.Lijm vervolgens een agarosegelblok van één kubieke centimeter aan de ventrale zijde van de hersenen op de basisplaat van de microtoom om de hersenen te ondersteunen en te fixeren tijdens het snijden. Nadat de lijm is gedroogd, wordt de plaat in het bad van de microtoom geplaatst, dat is gevuld met zuurstofrijke extracellulaire oplossing bij 6 °C. Snijd vervolgens de hersenen met een lage snijsnelheid in plakjes van 300 µm dikte; de coronale hersendoorsneden worden verzameld totdat de gehele hersenen zijn gesneden.Bereid nu een 20%onic F1 27-oplossing in DMSO door DMSO-oplossing toe te voegen aan onic F1 27-poeder. Los dit vervolgens op door de oplossing gedurende twee minuten direct te sonceren. Voeg daarna vijf µL van de 20%onic F1 27-oplossing toe aan een buis met 50 µg celpermeabel furred am.Meng de oplossing met een pipet. Voeg vervolgens 45 µL extracellulaire oplossing toe aan het mengsel en vortex dit. Voeg kort daarna nog eens 325 µL extracellulaire oplossing toe en soniceer de buis nog drie minuten.Voeg na sonificatie 1,156 milliliter gezuursde extracellulaire oplossing toe om de uiteindelijke calciumindicator D-laadoplossing te verkrijgen. Breng de coronale hersensneden over naar een zeswellige celkweekplaat gevuld met gezuursde extracellulaire oplossing, tot maximaal zes sneden per well. Aspireer vervolgens de gezuursde extracellulaire oplossing uit de kamers, waarbij u er alert op toeziet dat de hersensneden niet beschadigd raken.Pipetteer vervolgens 750 µL van de calciumindicator D-laadoplossing direct in elke put; de hersensnijden moeten volledig bedekt zijn door de oplossing met rore am. Incubeer de snijden daarna gedurende 45 tot 60 minuten bij 37 °C in de zuurstof-kooldioxide-celkweekincubator.Vervang aan het einde van de incubatie de calciumindicator DI-laadoplossing door verse, zuurstofrijke extracellulaire oplossing om overbelading van de cellen te voorkomen. Om de door de stimulus geïnduceerde veranderingen in het fluorescentiesignaal te monitoren, brengt u een van de met fure red geladen hersensecties over naar een opnamekamer en positioneert u deze naar wens. Nadat de kamer op de confocale microscoopopstelling is gemonteerd, perfundeert u de sectie gedurende 10 minuten met zuurstofrijke extracellulaire oplossing om elk overschot aan extracellulaire calciumindicator-kleurstof te verwijderen.Nadat het weefsel uit de opnamekamer is gehaald, wordt de PERFUSE eight opgevangen in een vacuümfles. Bekijk vervolgens de slice onder de microscoop bij een lage vergroting. Noteer de oriëntatie van de slice en bepaal het gebied van interesse in de slice, in dit geval het hypothalamische gebied in de hersenen.Schakel daarna over naar een hoge vergroting. Lokaliseer de gewenste cel in de coupe door GFP-beelden vast te leggen en gelijktijdig de fluorescentie-intensiteit van het URA-rode signaal te controleren. Stel het laservermogen in op een waarde die metingen van de verandering in de URA-rode fluorescentie-intensiteit mogelijk maakt en bleaching van de twee fluoroforen voorkomt.Begin vervolgens met het acquisitieren van beelden met een frequentie tussen 0,5 en 2 hertz om de fure- en GFP-signalen te verzamelen. Deze figuur toont het confocale beeld van de GN, RHR Tau GFP-neuronen in een coronale hersensnede. Dit is het relatief uniforme fluorescentiesignaal dat wordt waargenomen na het laden van de hersensnede met fure am en dit is het samengevoegde beeld dat de neuronen toont die zijn geladen met de calciumindicator-kleurstof.Hier zijn voorbeelden van de somatisch stimulus-geïnduceerde calciumresponsen van individuele GFP-gelabelde neuronen in verschillende hypothalamische hersengebieden. De verschillende calciumsignalen tussen de GN RHR-exprimerende neuronen van verschillende hypothalamische kernen kunnen worden vergeleken door de oppervlakte onder de curve te gebruiken als schatting voor de totale verandering in calcium in een bepaalde cel gedurende dezelfde periode. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in minder dan 90 minuten worden uitgevoerd, inclusief de bereiding van de calciumindicator-kleurstof, het laden en de incubatie van de coupes, mits dit correct wordt uitgevoerd.

imaging-calcium-responses-gfp-tagged-neurons-hypothalamic-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

De vomeronasale orgaan (VNO) detecteert intraspecies chemische signalen dat de sociale en reproductieve informatie over te brengen. Wij hebben Ca2 + imaging experimenten met transgene muizen die G-CaMP2 in VNO weefsel. Deze aanpak stelt ons in staat om de ingewikkelde reactie patronen van de vomeronasale neuronen te analyseren om een ​​groot aantal feromonen stimuli.

Imaging neuronale responsen bij Slice Bereidingen van Vomeronasal Het uiten van een genetisch gecodeerd Calcium Sensor

Source: Bancroft, E. A., et al. Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons. J. Vis. Exp. (2020) This video demonstrates the real-time visualization of calcium influx in ventral midbrain neurons derived from mouse embryos. Using a viral vector to express a calcium indicator, the neurons are imaged under a confocal microscope to track changes in fluorescence intensity during spontaneous and neurotransmitter-induced calcium activity.

Visualization of Calcium Influx in Ventral Midbrain Neurons Derived from Mouse Embryos

We beschrijven een experimentele procedure voor het meten van neuronale activiteit door dual optische ramen boven bilaterale primaire somatosensorische corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgene muizen met behulp van 2-foton (2 P) microscopie in vivo.

Imaging neurale activiteit in de primaire somatosensorische Cortex met behulp van Thy1-GCaMP6s transgene muizen

Presenteren we een methode geheel-cel patch-clamp opnamen en twee-foton imaging om vast te leggen van Ca2 + transiënten in neuronale dendrites in acute hersenen segmenten combineren.

Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

Hier presenteren we hoe we het geniculate ganglion van een levende, verdoofde laboratoriummuis kunnen blootleggen en hoe calciumbeeldvorming kan worden gebruikt om de reacties van ensembles van deze neuronen op smaakprikkels te meten, waardoor meerdere proeven met verschillende stimulerende middelen mogelijk zijn. Dit maakt diepgaande vergelijkingen mogelijk van welke neuronen op welke smaakstoffen reageren.

In vivo calciumbeeldvorming van muis geniculate ganglion neuron reacties op smaakprikkels

We presenteren een protocol om de hersenstam van volwassen muizen van de ventrale kant bloot te leggen. Door een gradiënt-brekingsindexlens met een miniatuurmicroscoop te gebruiken, kan calciumbeeldvorming worden gebruikt om de activiteit van inferieure olijfneurale somata in vivo te onderzoeken.

In vivo Calcium beeldvorming in muis inferieure olijf

Dit protocol beschrijft de chirurgische blootstelling van het dorsale wortelganglion (DRG) gevolgd door GCaMP3 (genetisch gecodeerde Ca2 + indicator; Green Fluorescent Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ beeldvorming van de neuronale ensembles met behulp van Pirt-GCaMP3-muizen tijdens het toepassen van een verscheidenheid aan stimuli op de ipsilaterale achterpoot.

In Vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte dorsale wortelganglia

Dit protocol beschrijft de procedure voor het in beeld brengen van calciumresponsen in de superieure colliculus (SC) van wakkere muizen, inclusief het in beeld brengen van de activiteit van één neuron met twee fotonen met behulp van twee-fotonmicroscopie terwijl de cortex intact blijft bij wild-type muizen, en het in beeld brengen van de gehele SC met breedveldmicroscopie bij mutante muizen met gedeeltelijke cortex.

Calciumbeeldvorming bij superieure colliculus bij muizen

Het huidige protocol beschrijft in vivo calciumbeeldvorming voor het meten van de reacties van ensembles van lumbale-6 DRG-neuronen op somatische en viscerale stimuli. Er kunnen grondige vergelijkingen worden gemaakt tussen neuronen die reageren op verschillende stimuli. Dit protocol is waardevol voor het onderzoeken van mechanismen van viscerale pijn en somatische stimulatie, zoals acupunctuur.

In Vivo calciumbeeldvorming van de respons van neuronen in dorsale wortelganglia op somatische en viscerale stimuli

De gyrus dentatus van de hippocampus vervult essentiële en verschillende functies bij het leren en het geheugen. Dit protocol beschrijft een reeks robuuste en efficiënte procedures voor in vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de gyrus dentatus bij vrij bewegende muizen.

In vivo calciumbeeldvorming van korrelcellen in de getande gyrus van de hippocampus bij muizen 

Dit protocol beschrijft in vivo GCaMP-calciumbeeldvorming van intacte trigeminusganglion (TG)-neuronen. Deze beschrijving omvat TG-blootstellingschirurgie, in vivo confocale microscopiebeeldvorming van TG-neuronen, toepassing van somatische stimuli tijdens microscopische beeldvorming van TG-neuronen en analyse van in vivo GCaMP-calciumbeeldvormingsgegevens.

In vivo Calciumbeeldvorming van neuronale ensembles in netwerken van primaire sensorische neuronen in intacte trigeminusganglia

Leer calciumresponsies in GFP-gelabelde hypothalamusneuronen monitoren met rood fluorescerende indicator en confocale microscopie. Deze methode ondersteunt onderzoek naar neurale signaaltransmissie.

Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices

Meer video's verkennen