Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices

Het algemene doel van deze procedure is om stimulus-geïnduceerde calciumresponsen te monitoren, zowel ruimtelijk als temporeel, in GFP-gelabelde neuronen in hersensecties met behulp van een niet-groene fluorescente calciumindicator-kleurstof. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen te extraheren van een transgene muis die GFP tot expressie brengt in specifieke cellen. De tweede stap is het prepareren van weefselsecties met een microtoom.

Vervolgens wordt de laadoplossing van de calciumindicatorkleurstof op de coupes gepipetteerd, zodat de kleurstof door de hersencellen kan worden opgenomen. De laatste stap is het uitvoeren van een tijdstempelopname van fluorescerende cellen met behulp van confocale microscopie. Uiteindelijk worden calciumresponsen in GFP-gelabelde neuronen getoond met behulp van multicolor calcium-imaginganalyse.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden voor confocale microscopie is dat we calcium kunnen afbeelden in groen fluorescerende GFP-neuronen met behulp van een roodverschoven fluorescerende calciumindicator-kleurstof. De enorme Stokes-verschuiving van de rode kleurstof stelt ons in staat om een multicolor-analyse uit te voeren van de rode fluorescentie in combinatie met het groene GFP met behulp van een enkele excitatiegolflengte. We kwamen voor het eerst op het idee voor deze methode toen we geconfronteerd werden met het probleem om calciumsignalen te monitoren in neuronen die we alleen konden identificeren met behulp van een genetische fluorescentietechniek, namelijk het groen fluorescerende eiwit.

Ik zal nu verschillende kritieke stappen van deze procedure demonstreren. Begin de procedure door de verhitte agarlopossing in een vierkante Petrischaal tot een hoogte van één centimeter te gieten; nadat de 4% agargel is afgekoeld en gestold, wordt deze gesneden in blokjes van één kubieke centimeter en in een flesje geplaatst voor bewaring. Snijd, na het onthoofden van de muis, de hoofdhuid met een enkelzijdig scheermes in sagittale richting van het frontale bot naar de externen occipitale protuberantie.

Open vervolgens de ingesneden hoofdhuid verder, eerst in rostrale laterale richting. Daarna in ventrale richting. Maak vervolgens twee laterale en één rostrale incisie.

Splits de schedel voorzichtig open bij het foramen magnum met een kleine veerschaar. Op dit moment moeten het occiput, de interpariëtale botten en de pariëtale botten zijn losgekoppeld. Als de dura mater nog aanwezig is, dient deze voorzichtig met een pincet te worden verwijderd om beschadiging van de hersenen te voorkomen.

Verwijder vervolgens het squama-bot, het voorste etmoïdale gat en het frontale foramen. Nu kan het brein eenvoudig worden verwijderd met een omgekeerde microspatel en kunnen de schedelnerven worden doorgebroken. Het brein moet op de ventrale zijde op een snijbestendig oppervlak landen, met de ventrale zijde van het brein naar beneden.

Gebruik een enkelzijdig scheermesje om het cerebellum te verwijderen. Dit rechte snijvlak dient als basis voor het monteren van de hersenen op een plaat, zodat coronale hersendoorsneden kunnen worden gemaakt. Lijm vervolgens de hersenen met het snijvlak op de basisplaat van de microtoom met een kleine hoeveeling snelhardende, hoogwaardige cyanoacrylaatlijm.

Lijm vervolgens een agarosegelblok van één kubieke centimeter aan de ventrale zijde van de hersenen op de basisplaat van de microtoom om de hersenen te ondersteunen en te fixeren tijdens het snijden. Nadat de lijm is gedroogd, wordt de plaat in het bad van de microtoom geplaatst, dat is gevuld met zuurstofrijke extracellulaire oplossing bij 6 °C. Snijd vervolgens de hersenen met een lage snijsnelheid in plakjes van 300 µm dikte; de coronale hersendoorsneden worden verzameld totdat de gehele hersenen zijn gesneden.

Bereid nu een 20%onic F1 27-oplossing in DMSO door DMSO-oplossing toe te voegen aan onic F1 27-poeder. Los dit vervolgens op door de oplossing gedurende twee minuten direct te sonceren. Voeg daarna vijf µL van de 20%onic F1 27-oplossing toe aan een buis met 50 µg celpermeabel furred am.

Meng de oplossing met een pipet. Voeg vervolgens 45 µL extracellulaire oplossing toe aan het mengsel en vortex dit. Voeg kort daarna nog eens 325 µL extracellulaire oplossing toe en soniceer de buis nog drie minuten.

Voeg na sonificatie 1,156 milliliter gezuursde extracellulaire oplossing toe om de uiteindelijke calciumindicator D-laadoplossing te verkrijgen. Breng de coronale hersensneden over naar een zeswellige celkweekplaat gevuld met gezuursde extracellulaire oplossing, tot maximaal zes sneden per well. Aspireer vervolgens de gezuursde extracellulaire oplossing uit de kamers, waarbij u er alert op toeziet dat de hersensneden niet beschadigd raken.

Pipetteer vervolgens 750 µL van de calciumindicator D-laadoplossing direct in elke put; de hersensnijden moeten volledig bedekt zijn door de oplossing met rore am. Incubeer de snijden daarna gedurende 45 tot 60 minuten bij 37 °C in de zuurstof-kooldioxide-celkweekincubator.

Vervang aan het einde van de incubatie de calciumindicator DI-laadoplossing door verse, zuurstofrijke extracellulaire oplossing om overbelading van de cellen te voorkomen. Om de door de stimulus geïnduceerde veranderingen in het fluorescentiesignaal te monitoren, brengt u een van de met fure red geladen hersensecties over naar een opnamekamer en positioneert u deze naar wens. Nadat de kamer op de confocale microscoopopstelling is gemonteerd, perfundeert u de sectie gedurende 10 minuten met zuurstofrijke extracellulaire oplossing om elk overschot aan extracellulaire calciumindicator-kleurstof te verwijderen.

Nadat het weefsel uit de opnamekamer is gehaald, wordt de PERFUSE eight opgevangen in een vacuümfles. Bekijk vervolgens de slice onder de microscoop bij een lage vergroting. Noteer de oriëntatie van de slice en bepaal het gebied van interesse in de slice, in dit geval het hypothalamische gebied in de hersenen.

Schakel daarna over naar een hoge vergroting. Lokaliseer de gewenste cel in de coupe door GFP-beelden vast te leggen en gelijktijdig de fluorescentie-intensiteit van het URA-rode signaal te controleren. Stel het laservermogen in op een waarde die metingen van de verandering in de URA-rode fluorescentie-intensiteit mogelijk maakt en bleaching van de twee fluoroforen voorkomt.

Begin vervolgens met het acquisitieren van beelden met een frequentie tussen 0,5 en 2 hertz om de fure- en GFP-signalen te verzamelen. Deze figuur toont het confocale beeld van de GN, RHR Tau GFP-neuronen in een coronale hersensnede. Dit is het relatief uniforme fluorescentiesignaal dat wordt waargenomen na het laden van de hersensnede met fure am en dit is het samengevoegde beeld dat de neuronen toont die zijn geladen met de calciumindicator-kleurstof.

Hier zijn voorbeelden van de somatisch stimulus-geïnduceerde calciumresponsen van individuele GFP-gelabelde neuronen in verschillende hypothalamische hersengebieden. De verschillende calciumsignalen tussen de GN RHR-exprimerende neuronen van verschillende hypothalamische kernen kunnen worden vergeleken door de oppervlakte onder de curve te gebruiken als schatting voor de totale verandering in calcium in een bepaalde cel gedurende dezelfde periode. Zodra men deze techniek beheerst, kan deze in minder dan 90 minuten worden uitgevoerd, inclusief de bereiding van de calciumindicator-kleurstof, het laden en de incubatie van de coupes, mits dit correct wordt uitgevoerd.