Imaging Calcium Reacties in GFP-gelabelde neuronen van de hypothalamus Mouse Brain Slices

Het algemene doel van deze procedure is om door stimulus geïnduceerde calciumresponsen te monitoren, zowel in GFP-gelabelde neuronen, spatieel en temporeel in hersensneden, met behulp van een niet-groen fluorescerende calciumindicatorkleurstof. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen van een transgene muis te extraheren die GFP in specifieke cellen tot expressie brengt. De tweede stap is het bereiden van weefselsneden met een microtoom.

Vervolgens wordt de calciumindicatorkleurstof oplossing gepipetteerd op de sneden om de kleurstof door de hersencellen te laten opnemen. De laatste stap is om een tijdstempelopname van fluorescerende cellen uit te voeren met behulp van confocale microscopie. Uiteindelijk worden calciumresponsen in GFP-gelabelde neuronen getoond met behulp van multikleurige calciumbeeldvormingsanalyse.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden van confocale microscopie is dat we calcium kunnen beeldvormen in groen fluorescerende GFP-tech neuronen met behulp van een roodverschoven fluorescerende calciumindicatorkleurstof. De enorme golflengteverplaatsing van de minder rode kleurstof stelt ons in staat om multikleurige analyse van de rode fluorescentie in combinatie met de groene GFP uit te voeren met behulp van een enkele excitatiegolflengte. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we geconfronteerd werden met het probleem van het monitoren van calciumsignalen in neuronen die we alleen konden identificeren met behulp van een genetische fluorescerende techniek, namelijk het groene fluorescente eiwit.

Ik zal nu verschillende kritische stappen van deze procedure demonstreren. Begin de procedure door de verwarmde agaroplossing in een vierkante petrischaal te gieten tot een hoogte van één centimeter. Na afkoeling en verharding wordt de 4% agargel in blokken van één kubieke centimeter gesneden en in een fles voor opslag geplaatst. Na het onthoofden van de muis wordt de schedel met een enkelzijdige scheermes in de centrale sagittale richting gesneden van het voorste bot tot de externe occipitale uitsteeksel.

Vervolgens wordt de gesneden schedel verder geopend in de rostrale laterale richting. Dan in de ventrale richting. Maak vervolgens twee laterale en één rostrale snede.

In het foramen magnum scheidt u voorzichtig met kleine veerscharen het schedeldak af. Op dit moment moeten de occipitale interpariëtale en pariëtale botten worden losgemaakt. Als het hersenvlies nog aanwezig is, verwijdert u het voorzichtig met een pincet om schade aan de hersenen te voorkomen.

Verwijder vervolgens het squamale bot, de voorste etmoïdale en het voorste foramen. Nu kan de hersenen gemakkelijk worden verwijderd met een omgekeerde microlepel en kunnen de hersenzenuwen worden doorgesneden. De hersenen moeten op hun ventrale kant op een snijbestendig oppervlak landen met de ventrale kant van de hersenen naar beneden.

Gebruik een enkelzijdig scheermes om de kleine hersenen te verwijderen. Dit rechte snedenvlak zal de basis vormen voor het bevestigen van de hersenen op een plaat om het snijden van coronale hersensneden mogelijk te maken. Plak vervolgens de hersenen met de snedenvlak op de basisplaat van de microtoom met behulp van een kleine hoeveelheid van de snel uithardende hoogwaardige cyanoacrylaat superlijm.

Vervolgens wordt een blok agargel van één kubieke centimeter op de ventrale kant van de hersenen op de basisplaat van de microtoom gelijmd om de hersenen te ondersteunen en te fixeren tijdens het snijden. Nadat de lijm is opgedroogd, plaatst u de plaat in het bad van de microtoom met zes graden Celsius koude geoxideerde extracellulaire oplossing. Snijd vervolgens de hersenen in sneden van 300 micrometer dikte met een lage snijtempo, de coronale hersensneden worden verzameld totdat de hele hersenen is gesneden.

Bereidt nu een 20% onische F1 27 in DMSO-oplossing voor door DMSO-oplossing toe te voegen aan onische F1 27-poeder. Los vervolgens op door de oplossing direct twee minuten te sonificeren. Voeg daarna vijf microliters van 20% onische F1 27-oplossing toe aan een buis met 50 microgram van de celpermeabele furred am.

Meng de oplossing met een pipet. Voeg vervolgens 45 microliters extracellulaire oplossing toe aan het mengsel en vortex het. Voeg kort daarna nog eens 325 microliters extracellulaire oplossing toe en sonificeer de buis nog drie minuten.

Na sonificatie voegt u 1,156 milliliter geoxideerde extracellulaire oplossing toe om de uiteindelijke calciumindicator D-laadoplossing te verkrijgen. Breng de coronale hersensneden over in een zeswel-celkweekplaat gevuld met geoxideerde extracellulaire oplossing tot maximaal zes sneden per wel. Zuig vervolgens de geoxideerde extracellulaire oplossing uit de kamers af, zorg ervoor dat de hersensneden niet worden beschadigd.

Pipet vervolgens 750 microliters van de calciumindicator D-laadoplossing direct in elke wel. De hersensneden moeten bedekt worden door de oplossing die rore am bevat. Incubeer vervolgens de sneden in de zuurstof koolstofdioxide celkweekincubator gedurende 45 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius.

Aan het einde van de incubatie vervangt u de calciumindicator DI-laadoplossing door verse geoxideerde extracellulaire oplossing om overbelasting van de cellen te voorkomen. Om de door stimulus geïnduceerde veranderingen in het fluorescerende signaal te monitoren, brengt u een van de fure red-geladen hersensneden over naar een opnamekamer en plaatst u deze zoals gewenst. Na het monteren van de kamer op de confocale microscoopopstelling, perfuseert u de snede gedurende 10 minuten met geoxideerde extracellulaire oplossing om eventuele overtollige extracellulaire calciumindicatorkleurstof te verwijderen.

Na het verlaten van de opnamekamer wordt de PERFUSE acht verzameld in een vacuümfles. Bekijk vervolgens de snede door de microscoop bij lage vergroting. Noteer de oriëntatie van de snede en zoek het gebied van belang in de snede op, in ons geval het hypothalamische gebied in de hersenen.

Vervolgens verandert u naar hoge vergroting. Vind de cel van belang in de snede door