Name: Cel specifieke analyse van Arabidopsis Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Leer hoe je GFP-expresserende protoplasten uit Arabidopsis-bladen isoleert met fluorescentie-geactiveerde celsortering. Deze methode maakt celtype-specifieke genexpressie-analyse en metabolische profilering mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Werk in de Buchanan-Wollaston lab op cel-type en het ontwikkelingsstadium tot specifieke profilering wordt ondersteund door de AGRON-OMICS project (subsidie ​​# LSHG-CT-2006 tot 037.704) in de 6 e Kaderprogramma progamma van de Europese Commissie. Werk in de Gifford lab op cel-type specifieke profilering wordt ondersteund door een BBSRC New Investigator Grant (BB/H019502/1). De KC274 en KC464 Arabidopsis lijnen werden verkregen van AAR Webb (Universiteit van Cambridge).

1. Protoplast Generation <ol><li> Oogst bladmateriaal en snijd 1 mm brede stroken (figuur 1) met een scheermesje. Voor monsters die meer dan een enkel blad tot 15 bladeren kunnen eenvoudig worden gestapeld voor het snijden. </li><li> Onmiddellijk over blad strips in een 9 cm Petrischaal ronde met 20 ml oplossing A (400 mM mannitol, 20 mM MES-hydraat, 20 mM KCl, 10 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 0,1% BSA en 2,5 mM β-mercaptoethanol, pH 5,7) met inbegrip protoplasting enzymen (1,2% cellulose R-10, 0,6% cellulose RS en 0,4% macerozyme R-10) en RNase en transcriptie remmers (1 x ProtectRNA en 10 ug / ml Actinomycine D) voorzichtig scheiden blad en strips infiltreren vacuüm gedurende 2 x 5 min. </li><li> Place petrischaal op een schudapparaat ingesteld op 90 rpm bij kamertemperatuur en protoplast voor 3-4 uur. <ol><li> Tijdens de incubatie het blad strips worden gescheiden van elkaar door middel van eenset van platte pincet, op de helft van intervallen van een uur. </li></ol></li><li> Plaats een 70 pm cel zeef (Fisher Scientific) in een 50 ml buis en voorzichtig de protoplasting oplossing te filteren door. Dit verwijdert het blad strips die worden bijgehouden door de zeef terwijl de protoplasten doorlopen. </li><li> Was het blad strips met 4 ml oplossing A en voorzichtig filter door dezelfde zeef. </li><li> Breng de protoplasten in ronde bodem en centrifugeer de protoplast oplossing bij 300 xg gedurende 5 minuten tot pellet de protoplasten. </li><li> Zuig zoveel af van de supernatant mogelijk zonder de protoplasten. </li><li> Was de protoplasten met 5 ml oplossing A en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant </li><li> Resuspendeer de protoplasten in een geschikt volume van oplossing A met een Pasteur pipet of een cut-off P1000 tip. </li></ol> 2. FACS van bladprotoplasten </p&gt; <ol><li> Onmiddellijk voor sorteren, resuspendeer de protoplasten met een (niet-cut) P1000 tip om protoplasten samenklonteren te voorkomen. </li><li> Breng protoplasten naar een sorteer buis door een 50 urn filter filcon (BD Biosciences) en verdun naar gelang van verstopping te voorkomen het mondstuk van de cel sorteerder. De protoplasten worden gesorteerd met behulp van een 100 urn nozzle bij een druk van 20 psi (omhulsel) en 21-21,5 psi (sample), een frequentie van 39,2 kHz en een incidentie van &lt;4000 (deze instellingen optimaal op BD Influx celsorteerder (BD Biosciences). Optimalisatie op andere mobiele sorteermachines kan nodig zijn aanpassingen aan deze instellingen). </li><li> GFP positieve protoplasten worden geïdentificeerd door een 488 nm argon laser en het uitzetten van de uitvoer van de 580/30 banddoorlaatfilter (oranje) versus de 530/40 banddoorlaatfilter (groen). GFP-positieve protoplasten worden in de hoge 530/low 580 inwoners, met niet-GFP protoplasten in de lage 530 / lage 580 inwoners en dode / stervende protoplasten en puin in de hoge 580 populatiening (figuur 2). <ol><li> Bij het ​​sorteren protoplasten waaruit RNA wordt geëxtraheerd, moet protoplasten direct worden gesorteerd in tenminste 4 volumes van een lysis buffer met een reductiemiddel (bijvoorbeeld β-mercaptoethanol). Bovendien moet het soort tijd van een monster beperkt tot 20-30 min, en maximaal twee tot drie monsters verwerkt tegelijk. </li><li> Voor visualisatie van gesorteerd protoplasten dient de protoplasten direct gesorteerd in ten minste 8 volumedelen oplossing A en vervolgens verzameld door centrifugatie om de protoplasten te concentreren. </li></ol></li></ol> 3. Representatieve resultaten Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het verkrijgen protoplasten van Arabidopsis bladeren, die worden gebruikt voor fluorescentie geactiveerde celsortering (figuur 1). Protoplast in de aanwezigheid van RNase en transcriptionele remmers voorkomt dat de cellen from montage van een transcriptionele respons. Dit heeft tot gevolg hebben die tot veel dode en stervende protoplasten, die een aanzienlijke mate van autofluorescentie zijn. Bij het sorteren de protoplasten bereid met deze werkwijze is het dus zeer gebruikelijk om een ​​aantal verschillende populaties in grafieken van 580 nm 530 nm versus fluorescentie voor het sorteren. Voorbeelden samen met de sortering poorten in dit protocol worden getoond in Figuur 3. Protoplasten kunnen worden gesorteerd in 8 volumedelen oplossing A en opgevangen voor visualisatie de verrijking verifiëren. Figuur 2G toont een voorbeeld van het gebruik van de TP382 lijn, die GFP expressie in de sluitcellen. Voorbeelden van de opbrengsten verkregen met deze methode, zowel vóór als na amplificatie worden weergegeven in tabel 1. De verkregen hoeveelheden zijn voldoende voor amplificatie met behulp van de Ovation Pico WTA-systeem (500 pg-50 ng) en dus subsequent analyse door een van beide qPCR (Figuur 4), next generation sequencing of microarray. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig1.jpg" /> Figuur 1. Algemene workflow voor het experiment. 1) Oogst bladeren van belangstelling van een GFP uiten Arabidopsis lijn. 2) Snel gesneden in ~ 1 mm brede stroken en onmiddellijk over te zetten naar protoplasting oplossing en vacuüm te infiltreren. 3) Incubeer gedurende 3-4 uur. 4) voorzichtig filtraat protoplastfusie oplossing door een 70 pm zeef, over te brengen naar beneden buizen en pellet protoplasten rond door centrifugeren. 5) Vlak voor het sorteren, resuspendeer protoplasten en transfer naar een sorteer buis door een 50 pm filter. 6) Sorteer GFP positieve en negatieve GFP levensvatbaar protoplasten. 7) Protoplasten kan nu worden geanalyseerd, hetzij visueel of met behulp van technieken zoals qPCR, next generation sequencing of microarray. Figuur 2. Het KC464, KC274 en TP382 lijnen gebruikt in deze studie. A) dwarsdoorsnede van een blad weer KC464 GFP expressie in de adaxiale epidermis. B) protoplasten uit bladeren KC464. C) dwarsdoorsnede van een blad weer KC274 GFP expressie in de vasculatuur. D) protoplasten uit bladeren KC274. E) TP382 blad weer GFP-expressie in de sluitcellen. F) protoplasten uit bladeren TP382. G) Voorbeeld van de verrijking verkregen door FACS van GFP expressie sluitcellen in de complexe achtergrond van blad cellen, waaruit blijkt GFP met protoplasten van de hoge 530/low 580 inwoners van protoplasten uit TP382 bladeren. AF: Confocale microscoop beelden; G: Fluorescentie microscoop beeld. Scale bars op beelden zijn 50 pm. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig3.jpg" /><html> Figuur 3. Typische FACS verkrijging puntdiagrammen van de uitvoer van de 580/30 nm (oranje) vs 530/40 nm (groen) banddoorlaatfilters (BD Influx cell sorter). De getoonde sorteren poorten die gewoonlijk gebruikt tijdens het sorteren. A) puntdiagram van Col-4 leaf verkregen protoplasten protoplasted in afwezigheid van remmers, met een laag 530/low 580 bevolking. B) Dot plot van wt Col-4 leaf verkregen protoplasten protoplasted in de aanwezigheid van remmers, een verschuiving in de 580 fluorescentie vanwege stress en kleuring van de remmers. CE) puntdiagrammen van blad afgeleid uit de protoplasten KC74, KC464 en TP382 lijnen respectievelijk protoplasted in de aanwezigheid van remmers die de GFP die in de populaties hoge 530/low 580 populaties. De percentages van de gebeurtenissen in het GFP (hoge 530/low 580) populaties worden gegeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . e_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4214/4214fig4.jpg" /> Figuur 4. GFP expressie in de representatieve populatie gated fracties zoals weergegeven in figuur 3. Twee biologische herhalingen werden voor elke fractie type, geamplificeerd met de Ovation Pico WTA System en qPCR met GFP-specifieke primers (tabel 2) werd vervolgens uitgevoerd. De weergegeven waarden zijn de hoogste (rood), laagste (groen) en de gemiddelde relatieve waarden. De hoge 580 bevolking was in dit geval in tweeën gesplitst, lage 530/low 580 en hoge 530/low 580, waarvoor een enkele biologische repliceren dus werd gebruikt alleen de enkele waarde is aangegeven. ACT2 (At3g18780) werd gebruikt als standaard voor alle monsters. Blad: Hele blad. Unsorted: Unsorted protoplasten. GFP1: hoge 530/low 580 en REST1: lage 530/low 580, GFP2: hoge 530/high 580 en REST2: 530/high laag 580, zoals in figuur 3 en de insert. De resultaten zijn een verificatie of optische beoordeling van GFP celinhoud in de gesorteerde fracties (bijvoorbeeld figuur 2G). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4214/4214fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Monster </td><td> Aantal bladeren </td><td> Aantal cellen </td><td> RNA opbrengst (Ng) </td><td> RNA opbrengst (Versterkt; ng) </td></tr><tr><td> Hele blad A Hele vleugel B </td><td> 1 1 </td><td> - - </td><td> 8001 10525 </td><td> 4623 *** 4572 *** </td></tr><tr><td> Unsorted protoplasten A Unsorted protoplasten B </td><td> 5 5 </td><td> - - </td><td> 2433 2625 </td><td> 1152 *** 3321 *** </td></tr><tr><td> GFP1 A REST1 A </td><td> 15 </td><td> 6039 (0,39% *) 55389 (6.40% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 861 489 </td></tr><tr><td> GFP1 B REST1 B </td><td> 15 </td><td> 10.783 (0,63% *) 57.040 (7,49% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 537 420 </td></tr><tr><td> GFP2 REST2 </td><td> 15 </td><td> 18.337 (1,49% *) 62.405 (73,49% *) </td><td> - ** - ** </td><td> 360 411 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Monsters met FACS geanalyseerd en qPCR te bepalen welke fractie bevatte levende GFP-expressie protoplasten. Ook in deze tabel is de totale RNA opbrengst ng voor en na amplificatie met de Ovation Pico WTA System (NuGen). GFP1, GFP2, en REST1 REST2 fracties worden getoond in het inzetstuk in figuur 4. * Het percentage cellen van de totale cel soort run is tussen haakjes naast het aantal cellen in de breuk. Deze percentages zijn niet gecorreleerd aanelkaar elk monster de FACS sorteren loopt fracties &#39;Rest&#39; zijn eerder dan voor GFP fracties vanwege het veel grotere aantal verzamelde Rest cellen gestopt. ** 50 ng gebruikt als input voor amplificatiereacties volgens de fabrikant protocol. <table border="1"><tbody><tr><td> Grondverf </td><td> Volgorde </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.fw </td><td> GCCTGAGGGATACGTGCAGGAGA </td></tr><tr><td> mGFP5-ER.rv </td><td> TGGCGGGTCTTGAAGTTGGCT </td></tr><tr><td> ACT2.fw </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr><tr><td> ACT2.rv </td><td> GCCATCCAAGCTGTTCTCTC </td></tr></tbody></table> Tabel 2. QPCR primers.

<ol><li>Efroni, I., Eshed, Y., Lifschitz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+of+Simple+and+Compound+Leaves%3A+A+Critical+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis of Simple and Compound Leaves: A Critical Review.</a> Plant Cell. 22, 1019-1032 (2010).</li>
<li>Kleber, R., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Quality+Assessment+of+RNA+From+Cell-Specific+Samples+Obtained+by+Laser+Microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation and Quality Assessment of RNA From Cell-Specific Samples Obtained by Laser Microdissection.</a> Methods Mol. Biol. 323, 367-377 (2006).</li>
<li>Birnbaum, K., Shasha, D. E., Wang, J. Y., Jung, J. W., Lamberts, G. M., Galbraith, D. W., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Gene+Expression+Map+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A Gene Expression Map of the Arabidopsis root.</a> Science. 302, 1956-1960 (2003).</li>
<li>Warnasooriya, S. N., Montgomery, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+Tissue-+and+Organ-specific+Phytochrome+Responses+using+FACS-assisted+Cell-type+Specific+Expression+Profiling+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana.</a> J. Vis. Exp. (39), e1925(2010).</li>
<li>Beal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simple+Method+For+Gene+Expression+and+Chromatin+Profiling+of+Individual+Cell+Types+Within+a+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">A Simple Method For Gene Expression and Chromatin Profiling of Individual Cell Types Within a Tissue.</a> Dev. Cell. 18, 1030-1040 (2010).</li>
<li>Mustroph, A., Zanetti, M. E., Jang, C. J. H., Holtan, H. E., Repetti, P. P., Galbraith, D. W., Girke, T., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+translatomes+of+discrete+cell+populations+resolves+altered+cellular+priorities+during+hypoxia+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Profiling translatomes of discrete cell populations resolves altered cellular priorities during hypoxia in Arabidopsis.</a> PNAS. 106, 18843-18848 (2009).</li>
<li>Brady, S. M., Orlando, D. A., Lee, J. Y., Wang, J. Y., Koch, J., Dinneny, J. R., Mace, D., Ohler, U., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dominant+Root+Expression+Patterns+Revealed+in+a+High-Resolution+Spatiotemporal+Expression+Map%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dominant Root Expression Patterns Revealed in a High-Resolution Spatiotemporal Expression Map.</a> Science. 318, 801-806 (2007).</li>
<li>Gifford, M. L., Dean, A., Gutierrez, R. A., Coruzzi, G. M., Birnbaum, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+nitrogen+responses+mediate+developmental+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Cell-specific nitrogen responses mediate developmental plasticity.</a> PNAS. 105, 803-808 (2008).</li>
<li>Dinneny, J. R., Long, T. A., Wang, J. Y., Jung, J. W., Mace, D., Pointer, S., Barron, C., Brady, S. M., Schiefelbein, J., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+identity+mediates+the+response+of+Arabidopsis+roots+to+abiotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell identity mediates the response of Arabidopsis roots to abiotic stress.</a> Science. 320, 942-945 (2008).</li>
<li>Peterson, S. V., Johansson, A. I., Kowalczyk, M., Makoveychuk, A., Wang, J. Y., Moritz, T., Grebe, M., Benfey, P. N., Sandberg, G., Ljung, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Auxin+Gradient+and+Maximum+in+the+Arabidopsis+Root+Apex+Shown+by+High-Resolution+Cell-Specific+Analysis+of+IAA+Distribution+and+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Auxin Gradient and Maximum in the Arabidopsis Root Apex Shown by High-Resolution Cell-Specific Analysis of IAA Distribution and Synthesis.</a> Plant Cell. 21, 1659-1668 (2009).</li>
<li>Yadav, R. K., Girke, T., Pasala, S., Xie, M., Reddy, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+map+of+the+Arabidopsis+shoot+apical+meristem+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem stem cell niche.</a> PNAS. 106, 4941-4946 (2009).</li>
<li>Harkins, K. R., Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W., Galbraith, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+photosynthesis-related+gene+fusions+is+restricted+by+cell+type+in+transgenic+plants+and+in+transfected+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Expression of photosynthesis-related gene fusions is restricted by cell type in transgenic plants and in transfected protoplasts.</a> PNAS. 87, 816-820 (1990).</li>
<li>Yang, Y., Costa, A., Leonhardt, N., Siegel, R. S., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+strong+Arabidopsis+guard+cell+promoter+and+it%27s+potential+as+a+research+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation of a strong Arabidopsis guard cell promoter and it's potential as a research tool.</a> Plant Methods. 4, 6(2008).</li>
<li>Gardner, M. J., Baker, A. J., Assie, J. -M., Poethig, R. S., Haseloff, J. P., Webb, A. A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GAL4+GFP+enhancer+trap+lines+for+analysis+of+stomatal+guard+cell+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">GAL4 GFP enhancer trap lines for analysis of stomatal guard cell development and gene expression.</a> J. Exp. Bot. 60, 213-226 (2009).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

We hebben een werkwijze beschreven dat het gebruik van Arabidopsis planten die GFP in de bladeren protoplast en volgende celsortering met FACS maakt. Deze methode levert voldoende hoeveelheden RNA te gebruiken voor amplificatie en daardoor daaropvolgende analyse door een qPCR of microarray. De fracties worden gesorteerd sterk verrijkt GFP-bevattende cellen, zoals aangetoond door qPCR (Figuur 2). Om een ​​hoge opbrengst van levende protoplasten is het essentieel snel werken tijdens de eerste stappen van de procedure, totdat het blad strips zijn vacuüm geïnfiltreerd met de inhibitor bevattende protoplast oplossing. Bovendien, bij het genereren van 1 mm blad strips is het zeer belangrijk te snijden of knippen de bladeren dan &quot;hakken&quot; of mash, omdat dat leidt tot overmatige slijtage en dus een lagere opbrengst protoplast. Een essentieel verschil tussen de hier beschreven methode en published methoden is het gebruik van RNase remmers en transcriptie remmers. De meeste methoden ontwikkeld voor Arabidopsis stammen waaruit protoplasten kunnen gemakkelijker worden gegenereerd. Echter werkt met bladeren, behalve mesofyl, moet de protoplast generatietijd verhogen. Daarom is het belangrijk om deze remmers omvatten om tegen veranderingen in genexpressie bescherming als gevolg van de protoplast generatie behandeling zelf (gegevens niet getoond). De aanwezigheid van de remmers leidt tot een onvermogen om een ​​transcriptie reactie te ontwikkelen, hetzij door het inschakelen of uitschakelen van genen, die waarschijnlijk om de protoplasten kwetsbaarder omdat dit leidt tot een verlies van plasticiteit waarmee tegen de spanningen van de protoplasting procedure. We hebben de hier beschreven werkwijze met succes met een aantal GFP tot expressie Arabidopsis lijnen. Belangrijk is, hebben we gebruik gemaakt van deze methode met GFP lijnen GFP tot expressie brengen, hetzij sterk inde kern, of veel zwakker in een cytosolisch non-localized/diffuse wijze, zoals het geval is met de KC464 en KC274 lijnen hier gebruikt. Beide soorten lijnen zijn geschikt voor de methode geven hoogverrijkt fracties van GFP-expressie protoplasten (figuur 2 en 3). De werkwijze kan gemakkelijk worden aangepast aan andere fluoroforen, hoewel de fluorofoor worden gekozen voor fluorescentie die significant verschilt van de autofluorescentie van dode / stervende cellen om het vermogen om levende cellen te selecteren behouden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Cellulase R-10 </td><td> Melford </td><td> C8001 </td></tr><tr><td> Cellulase RS </td><td> Melford </td><td> C8003 </td></tr><tr><td> Macerozyme R-10 </td><td> Melford </td><td> M8002 </td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3912 </td></tr><tr><td> ProtectRNA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R7397 </td></tr><tr><td> Actinomycine D </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A1410 </td></tr><tr><td> 70 urn celzeef </td><td> Visser </td><td> FB35181 </td></tr><tr><td> 50 pm filcon cup-type filters </td><td> BD Biosciences </td><td> 340630 </td></tr></tbody></table>

cel specifieke analyse van<em&gt; arabidopsis</em&gt; bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

Na starten van het blad primordium wordt biomassa accumulatie voornamelijk bepaald door celproliferatie en uitbreiding in de bladeren 1. De Arabidopsis leaf is een complex orgaan bestaat uit vele verschillende celtypes en verschillende structuren. Tegelijkertijd de groeiende bladeren bevat cellen in verschillende stadia van ontwikkeling, met de cellen die het verst van de steel als eerste te stoppen uitbreiding ondergaan senescentie 1. Verschillende cellen in het blad Daarom verdelen, verlengen of differentiatie, actieve, gestrest of dood, en / of reageren op stimuli in sub-sets van de cellulaire type tegelijk. Hierdoor genomisch onderzoek van het blad uitdagende, bijvoorbeeld bij het analyseren van expressie gegevens van hele bladeren, signalen van genetische netwerken die in verschillende cellulaire respons zones of celtypen worden verward, wat resulteert in een onjuiste profiel wordt gegenereerd. Om dit aan te pakken, eneveral werkwijzen beschreven waarmee studies van cel genexpressie. Deze omvatten laser-capture microdissectie (LCM) 2 of GFP tot expressie brengende planten voor protoplast en volgende fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) 3,4, de recent beschreven INTACT voor nucleaire neerslag 5 en immunoprecipitatie van polysomen 6. FACS is met succes gebruikt voor een aantal studies, waaronder waaruit blijkt dat de celidentiteit en afstand van de wortelpunt een significant effect op de expressie profielen van een groot aantal genen 3,7 had. FACS van GFP lijnen zijn ook gebruikt om cel-specifieke transcriptionele regulatie in wortel stikstof reacties en laterale wortelvorming 8, 9 zoutstress auxine verdeling in de wortel 10 tonen en een genexpressie kaart van de Arabidopsis shoot apicale meristeem 11 maken. HoewelFACS is eerder gebruikt om Arabidopsis leaf verkregen protoplasten gebaseerd op autofluorescentie 12,13 sorteren, tot dusver het gebruik van FACS op Arabidopsis lijnen GFP tot expressie brengen in de bladeren zeer beperkt 4. In het volgende protocol beschrijven we een werkwijze voor het verkrijgen Arabidopsis bladprotoplasten die compatibel zijn met FACS terwijl het minimaliseren van het effect van de protoplast generatie regime. We tonen de werkwijze volgens de KC464 Arabidopsis lijn, die uitdrukkelijk GFP in de epidermis adaxiale 14, KC274 lijn, die uitdrukkelijk GFP in het vaatweefsel 14 en TP382 Arabidopsis lijn, die een dubbele GFP expressie construct gekoppeld aan een nucleair lokalisatiesignaal in de sluitcellen (data niet getoond, figuur 2). Momenteel gebruiken deze methode zowel celtype specifieke expressie tijdens de ontwikkeling en stress, alsook heterogene celpopulaties bestuderen in verschillende stadia van senescentie.

Werkwijze voor het produceren<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladprotoplasten die compatibel zijn met fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS), waardoor studies van specifieke celpopulaties. Deze werkwijze is compatibel met elk<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Lijn die GFP uitdrukt in een subset van cellen.

Cel specifieke analyse van<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

Na de initiatie van het bladprimordium wordt de biomassa-accumulatie hoofdzakelijk gecontroleerd door celproliferatie en -expansie in de bladeren1. Echter, de ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van een populatie celtype-specifieke protoplasten uit een blad. Dit wordt bereikt door eerst planten te kweken die GFP tot expressie brengen in specifieke celtypen in het blad. De tweede stap is het oogsten van de bladeren en het genereren van protoplasten middels een enzymatische digestie.Vervolgens worden de protoplasten gefilterd en gesorteerd met behulp van fluorescence-activated cell sorting of FACS. De laatste stap is het bevestigen van de nauwkeurigheid van de sortering met fluorescentiemicroscopie. Uiteindelijk kunnen de gesorteerde protoplasten worden gebruikt voor de analyse van celtype-specifieke genexpressie, proteomische analyse of metabolische profilering.Fluorescentie-geactiveerde cel sortering is eerder met succes gebruikt voor wortels, maar hier wordt het ingezet voor het isoleren van bladcellen. Labeling met GFP voorafgaand aan deze methode was beperkt vanwege interferentie door chlorofylfluorescentie. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien een snelle maar zorgvuldige monsterpreparatie cruciaal is om de uitgebreide fysiologische veranderingen die tijdens cel sortering kunnen optreden te minimaliseren.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat zij niet weten hoe de cel-sorter moet worden ingesteld of hoe een nauwkeurige sortering kan worden bevestigd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de plantensystembiologie. Het probleem bij het identificeren van genregulatienetwerken in complexe meercellige organen, zoals een blad, is dat verschillende celtypen verschillende groepen genen tot expressie brengen.Deze genetische informatie gaat verloren bij de oogstanalyse van een heel blad ter demonstratie van de procedure. Naast mij staan Ellison As en Sanjeev Kuma, die technische ondersteuning bieden voor dit werk in ons laboratorium. Vul eerst een ronde Petrischaal van negen centimeter met 20 milliliters van oplossing A, die proto-platingenzymen en transcriptionele en RNA-remmers bevat.Oogst vervolgens het gewenste bladmateriaal voor monsters die uit meer dan één blad bestaan, zoals het hier getoonde monster. Stapel de bladeren op tot een stapel van maximaal 15 bladeren. Gebruik daarna een scheermesje om de bladeren in stroken van één millimeter breed te snijden.Breng de bladstroken onmiddellijk over naar de Petrischaal met een platte pincet, scheid de stroken voorzichtig en voer vervolgens twee keer vacuüminfiltratie uit op de monsters, telkens gedurende vijf minuten. Plaats de Petrischaal daarna op een orbitale schudmachine ingesteld op 90 RPM bij kamertemperatuur en laat de monsters drie tot vier uur inkleven. Gebruik tijdens de incubatie de pincet om de bladstroken om de halve uur van elkaar te scheiden.Filter na de digestie de protoplastenoplossing voorzichtig door een cellzeef van 70 micron in een buis van 50 milliliter. De bladstripjes worden tegengehouden, waardoor ze worden verwijderd, terwijl de protoplasten door de zeef filteren.Gebruik nu vier milliliter van oplossing A om de bladstrips voorzichtig te spoelen en vang het spoelmiddel op in de 50 milliliter buis. Breng vervolgens de protoplastensuspensie over in ronde bodembuisjes en centrifugeer de protoplasten gedurende vijf minuten bij 300 ×g en kamertemperatuur. Zuig voorzichtig zoveel mogelijk van het supernatant af zonder de pellet te verstoren, en was de protoplasten vervolgens met vijf milliliter van oplossing A onder dezelfde centrifugecondities.Verwijder tot slot het drijvende supernatant en gebruik een afgeknotte P 1000-tip om de PROTOPLASTEN vlak voor het sorteren opnieuw te suspenderen in een geschikt volume van oplossing A. Gebruik een niet-afgeknotte P 1000-tip om eventuele klonten in de protoplastenoplossing uiteen te drijven. Dissocieer de cellen verder door de protoplasten door een 50 micron fillon-filter in een verzamelbuis te filteren.Verdun vervolgens de celoplossing naar behoren om verstopping van de celopname-nozzle te voorkomen. Nadat de optimale condities voor de celopname zijn bepaald, worden de GFP-positieve protoplasten geïdentificeerd met een 488 nanometer Argonne-laser door de output van het 580 30 banddoorlaatfilter te vergelijken met die van het 530 40 banddoorlaatfilter. Let op dat de GFP-positieve protoplasten verschijnen in de populatie met een hoge 530- en lage 580-waarde.Bij de non-GFP-protoplasten in de populatie met lage 530 en lage 580, verschijnen de dode en stervende protoplasten en het debris in de populatie met hoge 580. Voor visualisatie van de gesorteerde protoplasten via fluorescentiemicroscopie worden de protoplasten direct na sortering in ten minste acht volumes van oplossing A gesorteerd. Na sortering kunnen de protoplasten door centrifugatie worden geconcentreerd; de protoplasten kunnen in acht volumes van oplossing A worden gesorteerd en worden verzameld voor visualisatie met een fluorescentiemicroscoop om de verrijking te verifiëren. Deze eerste afbeelding toont een voorbeeld van een verrijking van de TP 382-cellijn, die GFP tot expressie brengt in de sluitcellen. Voorbeelden van de opbrengsten die met deze methode zijn verkregen, zowel voor als na amplificatie, zijn samengevat in deze tabel.De verkregen hoeveelheden tussen 500 picogram en 50 nanogram zijn voldoende voor amplificatie met het ovation PICO WTA-systeem en daaropvolgende analyse via kwantitatieve PCR, next generation sequencing of microarray. Deze volgende reeks afbeeldingen toont verschillende protoplastcellijnen die zijn geïsoleerd en gesorteerd volgens de zojuist beschreven methode. Deze eerste protoplasten zijn afgeleid van KC 2 74, bladeren, een dwarsdoorsnede van een KC 2 74.Het blad laat zien dat GFP tot expressie komt in het vasculair systeem. Deze protoplasten werden geïsoleerd uit KC 4 64 bladeren en een dwarsdoorsnede van een KC 4 64 blad laat zien dat GFP-expressie wordt aangetroffen in de A dal epidermis. Tot slot werden deze protoplasten afgeleid van TP 3 82 bladeren in TP 3 82 bladeren.Het GFP wordt hier tot expressie gebracht in de sluitcellen. Typische dot plots van de FACS-acquisitie worden getoond, die de output illustreren van de 580/30 nanometer versus de 530/40 nanometer banddoorlaatfilters. De getoonde sorting gates zijn die welke gewoonlijk tijdens het sorteren worden gebruikt.Deze eerste dotplot van protoplasten afgeleid van bladeren van Col-4, geprepareerd in afwezigheid van inhibitoren, laat een enkele populatie zien met een lage 530- en lage 580-fluorescentie. Daarentegen demonstreert deze dotplot van protoplasten afgeleid van bladeren van wildtype Col-4, geprepareerd in aanwezigheid van inhibitoren, de verschuiving in de 580-fluorescentie die optreedt door de stress en kleuring veroorzaakt door de inhibitoren. Deze dotplots zijn respectievelijk van protoplasten afgeleid van bladeren van de lijnen KC 74, KC 64 en TP 82.Deze monsters werden ook geanalyseerd in aanwezigheid van inhibitoren, waaruit bleek dat het GFP zich bevond in de populaties met een hoge 530 en lage 580. Voor dit representatieve, kwantitatieve PCR-experiment werden eerst monsters verkregen voor elk fractietype. De monsters werden vervolgens geamplificeerd met behulp van het ovation PICO WTA-systeem en kwantitatieve PCR.Er is gebruikgemaakt van GFP-specifieke primers. De getoonde waarden zijn de hoogste in het rood en de laagste in het groen; gemiddelde of enkele waarden met actin 2 als referentiegen worden aangegeven door de horizontale gele balken. De resultaten vormen een reverificatie van de optische beoordelingen van het GFP-celgehalte in de gesorteerde fracties.De populatie met een hoge 530 en lage 580 vertoonde de hoogste meetbare niveaus van GFP-expressie. Terwijl de populatie met een hoge 530 en hoge 580 ongeveer 1000 keer lagere GFP-expressie vertoonde, vertoonden de populaties met een lage 530 en lage 580, en een lage 530 en hoge 580 lage niveaus van GFP-expressie die vergelijkbaar waren met die van de controlepopulaties van het volledige blad en de ongesorteerde protoplasten. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in vier tot vijf uur worden voltooid, van plant tot gesorteerde celpopulatie. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de cel sorter constant te monitoren en indien nodig opnieuw te kalibreren om de sorteernauwkeurigheid te behouden.Deze procedure is gevonden. Andere methoden, zoals microray-analyse, kunnen worden uitgevoerd om genexpressieniveaus in verschillende celtypen te vergelijken en te contrasteren. Nu deze techniek is ontwikkeld, analyseren we de genexpressie in specifieke bladceltypen in verschillende ontwikkelingsstadia, en we zullen dit vergelijken met gegevens van het gehele blad die zijn gegenereerd in het agronomics-project.Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u enkelvoudige celtypen uit bladeren kunt isoleren met behulp van fluorescence-activated cell sorting.

cell-specific-analysis-arabidopsis-leaves-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een methode voor het isoleren van specifieke celtypen uit plantaardig materiaal wordt gedemonstreerd. Deze techniek maakt gebruik van transgene marker lijnen uitdrukken fluorescerende eiwitten in het bijzonder celtypen, cellulaire dissociatie en fluorescentie geactiveerde cel sortering. Daarnaast wordt een groei setup hier vast te staan ​​dat vergemakkelijkt de behandeling...

Fluorescentie geactiveerde celsortering van plantenprotoplasten

De moleculaire basis van ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties wordt onderzocht met behulp van transgene planten die weefsel-en orgaan-specifieke fytochroom gebreken vertonen. De isolatie van specifieke cellen vertonen geïnduceerde fytochroom chromofoor uitputting door middel van fluorescentie-Activated Cell Sorting gevolgd door middel van microarray-analyses wordt gebruikt om genen die betrokken zijn bij de ruimtelijke-specifieke fytochroom reacties te identificeren.

Onderzoeken Tissue-en orgel-specifieke fytochroom Reacties met behulp van FACS-assisted Cell-type-specifieke expressie profilering in Arabidopsis thaliana</em

We beschrijven het gebruik van perfluorodecalin als een infiltratieve montage medium. Dit is een eenvoudige methode voor het verbeteren van de diepte van beeldvorming...

Een eenvoudige methode voor de Imaging Arabidopsis Met behulp van Leaves Perfluorodecalin als een Infiltratieve Imaging Medium

We hebben een techniek ontwikkeld om eiwit-eiwit interacties in planten te testen. Een geel fluorescerend eiwit (YFP) wordt opgesplitst in twee niet-overlappende fragmenten. Elk fragment is gekloond in-frame aan een gen van belang via de Gateway-systeem, waardoor de expressie van fusie-eiwitten. Reconstitutie van YFP-signaal treedt alleen op wanneer de lijkschouwing eiwitten met elkaar omgaan.

Detectie van eiwit interacties in Plant met behulp van een Gateway-compatibele Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) Systeem

Een fundamentele zoektocht in de celbiologie is het definiëren van de mechanismen die de identiteit van de organellen die eukaryotische cellen te maken ten grondslag liggen. Hier stellen we een methode om de genen die verantwoordelijk zijn voor de morfologische en functionele integriteit van plantaardige organellen met behulp van fluorescentie microscopie en next-generation sequencing tools te identificeren.

Fluorescentie-microscopie Screening en next-generation sequencing: Handige hulpmiddelen voor de identificatie van genen betrokken bij organel Integriteit

Wij bieden hier een efficiënt en betrouwbaar protocol voor immunokleuringen, fluorescentie in situ hybridisatie, DNA kleuring gevolgd door kwantitatieve, hoge-resolutie beeldvorming in whole-mount Arabidopsis thaliana eitjes. Deze methode is succesvol gebruikt om chromatine modificaties en nucleaire architectuur te analyseren.

Een efficiënte methode voor kwantitatieve, single-cell analyse van chromatine modificatie en Nucleaire Architectuur in zijn geheel-mount Ovules in<em&gt; Arabidopsis</em

Ca2 + signalering reguleert diverse biologische processen in planten. Hier presenteren we benaderingen voor het toezicht op abiotische stress geïnduceerde ruimtelijke en temporele Ca2 + signalen in Arabidopsis cellen en weefsels met behulp van de genetisch gecodeerde Ca 2 +-indicatoren Aequorin of Case12.

Meten Ruimtelijke en temporele Ca 2 + Signalen in Arabidopsis Planten

Live confocale imaging biedt biologen met een krachtig hulpmiddel om de ontwikkeling te bestuderen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de live confocale beeldvorming van de ontwikkeling van Arabidopsis bloemen.

Live confocale Imaging van de ontwikkelingslanden Arabidopsis Flowers

Hier presenteren we een protocol voor het bestuderen van de plant groei gedrag en vooral fenotypen op een reproduceerbare wijze. Variabele en op de dezelfde tijd stabiel lichtomstandigheden, tonen we hoe te verstrekken. Goede analyses, is afhankelijk van voldoende monster getallen en geldige statistische evaluaties.

Analyse van Arabidopsis thaliana groei gedrag in verschillende kwaliteiten van het licht

Wij rapporteren een eenvoudig en veelzijdig methode voor het uitvoeren van fluorescerende live-imaging van Arabidopsis thaliana bladeren gedurende een langere periode van tijd. We gebruiken een transgene Arabidopsis plant die een fluorescerende verslaggever-gen uitdrukt onder de controle van een promotor immuniteit-gerelateerde als voorbeeld voor het verkrijgen van Spatio begrip van de immuunreacties van de plant.

Een veelzijdige methode voor de montage van Arabidopsis vertrekt naar Intravital Time-lapse Imaging

Leer hoe je GFP-expresserende protoplasten uit Arabidopsis-bladen isoleert met fluorescentie-geactiveerde celsortering. Deze methode maakt celtype-specifieke genexpressie-analyse en metabolische profilering mogelijk.

Cel specifieke analyse van

Meer video's verkennen