Cel specifieke analyse van Arabidopsis Bladeren met fluorescentie-geactiveerde celsortering

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van een populatie celtype-specifieke protoplasten uit een blad. Dit wordt bereikt door eerst planten te kweken die GFP tot expressie brengen in specifieke celtypen in het blad. De tweede stap is het oogsten van de bladeren en het genereren van protoplasten middels een enzymatische digestie.

Vervolgens worden de protoplasten gefilterd en gesorteerd met behulp van fluorescence-activated cell sorting of FACS. De laatste stap is het bevestigen van de nauwkeurigheid van de sortering met fluorescentiemicroscopie. Uiteindelijk kunnen de gesorteerde protoplasten worden gebruikt voor de analyse van celtype-specifieke genexpressie, proteomische analyse of metabolische profilering.

Fluorescentie-geactiveerde cel sortering is eerder met succes gebruikt voor wortels, maar hier wordt het ingezet voor het isoleren van bladcellen. Labeling met GFP voorafgaand aan deze methode was beperkt vanwege interferentie door chlorofylfluorescentie. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien een snelle maar zorgvuldige monsterpreparatie cruciaal is om de uitgebreide fysiologische veranderingen die tijdens cel sortering kunnen optreden te minimaliseren.

Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode problemen ondervinden, omdat zij niet weten hoe de cel-sorter moet worden ingesteld of hoe een nauwkeurige sortering kan worden bevestigd. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de plantensystembiologie. Het probleem bij het identificeren van genregulatienetwerken in complexe meercellige organen, zoals een blad, is dat verschillende celtypen verschillende groepen genen tot expressie brengen.

Deze genetische informatie gaat verloren bij de oogstanalyse van een heel blad ter demonstratie van de procedure. Naast mij staan Ellison As en Sanjeev Kuma, die technische ondersteuning bieden voor dit werk in ons laboratorium. Vul eerst een ronde Petrischaal van negen centimeter met 20 milliliters van oplossing A, die proto-platingenzymen en transcriptionele en RNA-remmers bevat.

Oogst vervolgens het gewenste bladmateriaal voor monsters die uit meer dan één blad bestaan, zoals het hier getoonde monster. Stapel de bladeren op tot een stapel van maximaal 15 bladeren. Gebruik daarna een scheermesje om de bladeren in stroken van één millimeter breed te snijden.

Breng de bladstroken onmiddellijk over naar de Petrischaal met een platte pincet, scheid de stroken voorzichtig en voer vervolgens twee keer vacuüminfiltratie uit op de monsters, telkens gedurende vijf minuten. Plaats de Petrischaal daarna op een orbitale schudmachine ingesteld op 90 RPM bij kamertemperatuur en laat de monsters drie tot vier uur inkleven. Gebruik tijdens de incubatie de pincet om de bladstroken om de halve uur van elkaar te scheiden.

Filter na de digestie de protoplastenoplossing voorzichtig door een cellzeef van 70 micron in een buis van 50 milliliter. De bladstripjes worden tegengehouden, waardoor ze worden verwijderd, terwijl de protoplasten door de zeef filteren.

Gebruik nu vier milliliter van oplossing A om de bladstrips voorzichtig te spoelen en vang het spoelmiddel op in de 50 milliliter buis. Breng vervolgens de protoplastensuspensie over in ronde bodembuisjes en centrifugeer de protoplasten gedurende vijf minuten bij 300 ×g en kamertemperatuur. Zuig voorzichtig zoveel mogelijk van het supernatant af zonder de pellet te verstoren, en was de protoplasten vervolgens met vijf milliliter van oplossing A onder dezelfde centrifugecondities.

Verwijder tot slot het drijvende supernatant en gebruik een afgeknotte P 1000-tip om de PROTOPLASTEN vlak voor het sorteren opnieuw te suspenderen in een geschikt volume van oplossing A. Gebruik een niet-afgeknotte P 1000-tip om eventuele klonten in de protoplastenoplossing uiteen te drijven. Dissocieer de cellen verder door de protoplasten door een 50 micron fillon-filter in een verzamelbuis te filteren.

Verdun vervolgens de celoplossing naar behoren om verstopping van de celopname-nozzle te voorkomen. Nadat de optimale condities voor de celopname zijn bepaald, worden de GFP-positieve protoplasten geïdentificeerd met een 488 nanometer Argonne-laser door de output van het 580 30 banddoorlaatfilter te vergelijken met die van het 530 40 banddoorlaatfilter. Let op dat de GFP-positieve protoplasten verschijnen in de populatie met een hoge 530- en lage 580-waarde.

Bij de non-GFP-protoplasten in de populatie met lage 530 en lage 580, verschijnen de dode en stervende protoplasten en het debris in de populatie met hoge 580. Voor visualisatie van de gesorteerde protoplasten via fluorescentiemicroscopie worden de protoplasten direct na sortering in ten minste acht volumes van oplossing A gesorteerd. Na sortering kunnen de protoplasten door centrifugatie worden geconcentreerd; de protoplasten kunnen in acht volumes van oplossing A worden gesorteerd en worden verzameld voor visualisatie met een fluorescentiemicroscoop om de verrijking te verifiëren. Deze eerste afbeelding toont een voorbeeld van een verrijking van de TP 382-cellijn, die GFP tot expressie brengt in de sluitcellen. Voorbeelden van de opbrengsten die met deze methode zijn verkregen, zowel voor als na amplificatie, zijn samengevat in deze tabel.

De verkregen hoeveelheden tussen 500 picogram en 50 nanogram zijn voldoende voor amplificatie met het ovation PICO WTA-systeem en daaropvolgende analyse via kwantitatieve PCR, next generation sequencing of microarray. Deze volgende reeks afbeeldingen toont verschillende protoplastcellijnen die zijn geïsoleerd en gesorteerd volgens de zojuist beschreven methode. Deze eerste protoplasten zijn afgeleid van KC 2 74, bladeren, een dwarsdoorsnede van een KC 2 74.

Het blad laat zien dat GFP tot expressie komt in het vasculair systeem. Deze protoplasten werden geïsoleerd uit KC 4 64 bladeren en een dwarsdoorsnede van een KC 4 64 blad laat zien dat GFP-expressie wordt aangetroffen in de A dal epidermis. Tot slot werden deze protoplasten afgeleid van TP 3 82 bladeren in TP 3 82 bladeren.

Het GFP wordt hier tot expressie gebracht in de sluitcellen. Typische dot plots van de FACS-acquisitie worden getoond, die de output illustreren van de 580/30 nanometer versus de 530/40 nanometer banddoorlaatfilters. De getoonde sorting gates zijn die welke gewoonlijk tijdens het sorteren worden gebruikt.

Deze eerste dotplot van protoplasten afgeleid van bladeren van Col-4, geprepareerd in afwezigheid van inhibitoren, laat een enkele populatie zien met een lage 530- en lage 580-fluorescentie. Daarentegen demonstreert deze dotplot van protoplasten afgeleid van bladeren van wildtype Col-4, geprepareerd in aanwezigheid van inhibitoren, de verschuiving in de 580-fluorescentie die optreedt door de stress en kleuring veroorzaakt door de inhibitoren. Deze dotplots zijn respectievelijk van protoplasten afgeleid van bladeren van de lijnen KC 74, KC 64 en TP 82.

Deze monsters werden ook geanalyseerd in aanwezigheid van inhibitoren, waaruit bleek dat het GFP zich bevond in de populaties met een hoge 530 en lage 580. Voor dit representatieve, kwantitatieve PCR-experiment werden eerst monsters verkregen voor elk fractietype. De monsters werden vervolgens geamplificeerd met behulp van het ovation PICO WTA-systeem en kwantitatieve PCR.

Er is gebruikgemaakt van GFP-specifieke primers. De getoonde waarden zijn de hoogste in het rood en de laagste in het groen; gemiddelde of enkele waarden met actin 2 als referentiegen worden aangegeven door de horizontale gele balken. De resultaten vormen een reverificatie van de optische beoordelingen van het GFP-celgehalte in de gesorteerde fracties.

De populatie met een hoge 530 en lage 580 vertoonde de hoogste meetbare niveaus van GFP-expressie. Terwijl de populatie met een hoge 530 en hoge 580 ongeveer 1000 keer lagere GFP-expressie vertoonde, vertoonden de populaties met een lage 530 en lage 580, en een lage 530 en hoge 580 lage niveaus van GFP-expressie die vergelijkbaar waren met die van de controlepopulaties van het volledige blad en de ongesorteerde protoplasten. Zodra de techniek onder de knie is, kan deze, mits correct uitgevoerd, in vier tot vijf uur worden voltooid, van plant tot gesorteerde celpopulatie. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om de cel sorter constant te monitoren en indien nodig opnieuw te kalibreren om de sorteernauwkeurigheid te behouden.

Deze procedure is gevonden. Andere methoden, zoals microray-analyse, kunnen worden uitgevoerd om genexpressieniveaus in verschillende celtypen te vergelijken en te contrasteren. Nu deze techniek is ontwikkeld, analyseren we de genexpressie in specifieke bladceltypen in verschillende ontwikkelingsstadia, en we zullen dit vergelijken met gegevens van het gehele blad die zijn gegenereerd in het agronomics-project.

Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u enkelvoudige celtypen uit bladeren kunt isoleren met behulp van fluorescence-activated cell sorting.