Name: Massaspectrometrische analyse van glycosfingolipiden antigenen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 9 s
Description: Leer een gevoelige massaspectrometrie-methode voor analyse van glycosfingolipiden antigenen in immuuncellen. Deze techniek verbetert de detectie van laagfrequente glycolipiden voor immunologisch en oncologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DZ wordt ondersteund door MD Anderson Cancer Center en NIH subsidies AI079232. MD Anderson Cancer Center wordt gedeeltelijk ondersteund door NIH subsidie ​​CA16672.

1. Lab Bezorgdheid over veiligheid <ol><li> Alle organische oplosmiddelen moeten worden opgeslagen in specifieke gebieden met een duidelijk label. Zie labels door produceert voor soorten van de benodigde brandblussers. </li><li> Gebruik gemaakt van verschillende reagentia zijn potentieel kankerverwekkend en kan depressie veroorzaken. Deze reagentia moeten worden behandeld in een chemische kap met ventilatie (zie tabel van specifieke reagentia en apparatuur voor bijzonderheden). </li><li> Het wordt aanbevolen om bij het werken met organische oplosmiddelen en cellen, persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen, labjas, en oogbescherming worden gebruikt op elk moment. </li></ol> 2. Extractie van glycosfingolipiden van Rat leukemiecellen <ol><li> Store RBL rat leukemiecellen 8 (10 miljoen tot 100 miljoen) in 16x100 mm glazen buizen onder -80 ° C omstandigheden. Cellen worden geteld door een hemocytometer na trypan blauw kleuring. Levensvatbaarheid van cellen moet hoger zijn dan 95%. </li><li> Pak de lipiden met behulp van uitgebreide sonication vier keer voor elke 1-2 uur met gemengde oplosmiddelen polariteit. Gebruik 6 ml chloroform-methanol 1:1 (v / v) als de eerste en laatste oplosmiddel. Zes milliliter isopropanol: hexaan: H 2 O 55:25:20 (v / v / v, bovenste fase verwijderd door afzuiging voor gebruik) kan vervolgens worden gebruikt als de tweede en derde oplosmiddel. Dit oplosmiddel wordt bereid door isopropanol: hexaan: H 2 O in een verhouding 55:25:20 goed schudden, en waardoor een bovenste fase verschijnt, die zal worden verwijderd. Houd de onderste fase voor gebruik. </li><li> Volg sonicatie met centrifugeren om het onoplosbare materiaal pellet. Zwembad de supernatanten. Drogen in een Speedvac gedurende 4 uur. Stikstofstroom of roterende verdamper kan worden gebruikt als Speedvac niet beschikbaar. Gebruik een goede koude val te verdampte organische oplosmiddelen bevatten. Verontreiniging van organisch oplosmiddel in vacuümpompolie zal degraderen de efficiency van de vacuümpomp. </li><li> Voer een voorlopige analyse met high performance dunnelaagchromatografie (HPTLC). Om glycolipiden kwantificerenBereid een 0,2% orcinol in 50% zwavelzuur (100 mg in 50 ml) en een standaard Galactose (40 mg in 100 ml voorraadoplossing). Bereid in 30 pl reactievolume een serie verdunningen te gebruiken als standaard curve (van 0 g / l tot 20 g / L). Voeg 20 ul van elk Methanol verdunningsreeks monster. Los elk monster glycolipide in 200 pl methanol, ultrasone trillingen, en gebruik 20 ul van glycolipide hoeveelheidsmeting. In 1,5 ml Eppendorf buisjes met draad caps (Sarstedt, 72.692.005), voeg 0,4 ml 0,2% orcinol in 50% zwavelzuur aan elk monster met een reeks Galactose-H 2 O-Methanol oplossingen die dienen voor standaardcurve . Koken 5 min in verwarmingsblok bij 100 ° C. Lees optische dichtheid van kleur reactie bij 440 nm met behulp van Sunrise Tecan Microplate Reader. Uitvoeren HPTLC gebruikt chloroform: methanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) als oplosmiddel voor de neutrale lipiden behandeld met chloroform-methanol 1:1 (v / v). Gebruik isopropanol: hexaan: H 2 O 55:25:20 (v / v / v) alshet oplosmiddel voor het zuur lipiden (gangliosiden). Het geïsoleerde neutrale GSLs werd opgelost in 200 pi oplosmiddel chloroform: methanol 1:1 (v / v) en geladen op Merck silicagel dunnelaagchromatografie plaatje Drummond microcaps. De platen werden in oplosmiddel chloroform: methanol: H 2 O 60:35:8 (v / v / v) en gedroogd. De glycosfingolipiden werden gevisualiseerd door orcinol-zwavelzuur bij 300 ° C. </li><li> Om scheiden van de neutrale lipiden uit de zure lipiden, fractie van de neutrale en zure lipiden door anionenuitwisselingschromatografie op een kleine kolom van DEAE Sephadex A-25 [the DEAE Sephadex A25 hars kan worden bereid door het weken Sephadex A-25 hars poeder in chloroform: methanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) gedurende een nacht. Zuig het supernatant tot de Sephadex A25 hars wordt alles wat overblijft. Voeg verse chloroform: methanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) aan de hars te wassen. Herhaal dit drie keer om de negatief geladen resten te verwijderen van Sephadex A25 hars]. </li><li> Ontbinden, Ultrasone trillingen (niet langer dan 10 min) en de lipiden uit stap 2.1 in chloroform resuspenderen: methanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) te leveren. </li><li> Bereid een kleine DEAE Sephadex A25 (Cl-formulier) kolom met behulp van glaswol en een 9 &quot;Pasteur pipet. Verpak de glaswol zorgvuldig, zodat harspoeder niet door de kolom. Voeg DEAE Sephadex A25 (Cl-formulier) hars aan de&quot; nek &quot;van de 9&quot; Pasteur pipet zonder dat de kolom droog. Zorg ervoor dat u geen hars in eluens te zien. De monsters opgelost in chloroform: methanol: H 2 O 30:60:8 (v / v / v) opgelost. De neutrale lipide fractie is de doorstroom fractie. </li><li> Elueer het zure lipidenfractie (gebonden aan de harsen) met 8 ml natriumacetaat in methanol. Droog zowel de neutrale en zure fracties, hen door dialyse ontzouten, droog ze door Speedvac en analyseren door HPTLC. </li></ol> De zure fractie bevat gangliosiden, die kan worden gedialyseerd Stap 3 reactie direct.De neutrale fractie bevat niet alleen neutrale glycosfingolipiden, maar ook fosfolipiden (fosfatidylcholine en sfingomyeline), die moet worden verwijderd door een acetylering reactie. In onze ervaring, de methode van dialyse cassette, efficiënter en gemakkelijker dan een dialysebuis of omgekeerde fase C18 kolomchromatografie. <ol start="9"><li> De volgende stap is het verwijderen van fosfolipiden uit neutrale glycosfingolipiden door een acetylering en peracetylation reactie. Droog de DEAE Sephadex A-25 doorvoer fractie in de Speedvac (met koeling) gedurende 4 uur. Nadat de monsters droog zijn, zet ze terug in de Speedvac en droog gedurende nog eens 4 uur. Zorg ervoor dat deze monsters helemaal droog zijn, omdat het resterende water zal de peracetylation reactie te voorkomen. </li><li> Peracetylate de monsters met 1 ml pyridine en 0,5 ml azijnzuuranhydride in het donker bij kamertemperatuur of 37 ° C geïncubeerd. Deze hoeveelheid pyridine en azijnzuuranhydride is juist voor uptot 200 ug glycosfingolipiden. Deze reactie kan worden uitgevoerd bij 37 ° C, de GSLs hebben betere oplosbaarheid. </li><li> Droog de geperacetyleerde materiaal door Speedvac gedurende 3 uur, met de toevoeging van 1 ml tolueen 3x (coevaporation) om volledige verdamping verzekeren. Als de monsters nog steeds niet helemaal droog, Speedvac tot het droog is. </li><li> Bereid een Florisil (Sigma-Aldrich) kolom (30-60 mesh, 10 x 80 mm) in een Pasteur pipet met glaswol, met Florisil kralen. Florisil beads moet volledig worden gedroogd voor gebruik door incubatie in een 110 ° C oven. Vul de kralen in de Pasteur pipet tot de hals en equilibreer in 1,2-dichloorethaan-hexaan 4:1 (v / v). </li></ol> Elutie van de Florisil kolom is zeer snel. Snelle volatiliteit van de oplosmiddelen kan leiden tot kolom drogen. Dus alle oplosmiddelmengsels worden bereid voor het uitvoeren van de kolom aangezien het niet mogelijk om de waarde stoppen tijdens de elutie. <ol start="13"><li> Breng de peracetylated monster in 1 ml 1,2-dichloorethaan-hexaan 4:1 (v / v), en was de kolom met 6 ml van hetzelfde oplosmiddel, gevolgd door 10 ml 1,2-dichloorethaan. Elueren neutrale geperacetyleerde GSLs met 6 ml 1,2-dichloorethaan-aceton 1:1 (v / v). Deze stap verwijdert de geperacetyleerde fosfolipiden van glycosfingolipiden, omdat de geperacetyleerde glycosfingolipiden binden aan de Florisil kolom, terwijl geperacetyleerde fosfolipiden niet. </li><li> Droog de fracties door Speedvac gedurende 2 uur en deacetylate met 2 ml 0,5 M natriummethoxide [Sigma-Aldrich, 403067] in 2 ml methanol gedurende 3 uur bij kamertemperatuur. </li><li> Neutraliseer het mengsel met 3 ml van azijnzuur [azijnzuur / methanol 15/85 v / v], drogen Speedvac, ontzouten door dialyse [Los het gedroogde produkten in 3 ml water, en injecteer in de Slide-A-Lyzer Dialyse Cassette, dialyseren tegen water gedurende 24 uur. Ververs het water ten minste twee keer]. Droog de gedialyseerde GSLs (in water oplossing) door Speedvac totdat de monsters helemaal droog zijn. </li&gt; </ol> 3. Chemische modificatie (Permethylation) van glycosfingolipiden 13 <ol><li> Introduceren GSLs (1-20 ug) naar een glazen buis met schroefdop en Teflon liner en voeg dimethylsulfoxide (150 pl) zonder speciale droogomstandigheden of inert gas atmosfeer. </li><li> Bereid poedervormige natriumhydroxide (40-60 mg) van natriumhydroxide deeltjes door vermalen in een chemische mortier met een stamper. Zorg ervoor dat de poeders op te slaan in een zeer droge omgeving en voorzichtig zijn om het slijpen in de chemische kap te doen om te voorkomen dat het ademen van de poeders zijn. </li><li> Voeg vervolgens de natriumhydroxide poeder aan de monsteroplossing met een spatel. Voeg joodmethaan (80 pl) met 100 microliter Halmilton spuit [of 100 microliter VWR gekalibreerde pipet verbonden met een spuit door rubber slangen kunnen worden gebruikt] en schud het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. </li><li> Quench de methylering reactie met water (2 ml). Pak de permethylated producten 3 keer doorde toevoeging van dichloormethaan (2 ml) [glycolipiden zijn in de dichloormethaanfase, de onderste fase, zodat de bovenste fase kan worden overgebracht naar een nieuwe glazen buis en geëxtraheerd met dichloormethaan opnieuw]. </li><li> Was de gecombineerde dichloormethaanextracten 3 maal met 2 ml water [de bovenste fase, die het water, kan vervolgens worden verwijderd]. Na de laatste wassing, breng de monsters naar een nieuwe buis en droog met de Speedvac. </li><li> Monsters kunnen vervolgens worden opgelost in 100 tot 200 pl methanol voor ESI-MS analyse. </li></ol> 4. MALDI-TOF analyse van de Permethylated Gycosphingolipids <ol><li> Voer MALDI-TOF-MS en MALDI-TOF/TOF-MS/MS experimenten op MALDI TOF-TOF massaspectrometer (Applied Biosystems 4700, Foster City, CA). Bereid de matrix door het mengen van 50% volume van 10 mg / ml dihydroxybenzoëzuur (DHB) in acetonitril en 50% volume van 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) in water. </li><li> De DHB matrix kan worden gespot op de MALDI target (1 pi), gevolgd door 1 pi (bevattende 100 ng GSLs) spot monster opgelost in methanol. Breng langzaam en laat ze drogen voor de analyse. </li></ol> 5. Ion Trap MS analyse van Permethylated glycosfingolipiden <ol><li> Voer massaspectrometrie op een lineaire ion trap massaspectrometer (LTQ, ThermoScientific, San Jose, CA) met een Nanoelectrospray bron, 0,30 pl / min debiet bij 230 ° C capillaire temperatuur in positieve ionmodus met 30-50% botsingsenergie. Stel botsing energieën tot een minimale residuele overvloed aan precursorion verlaten. Detecteer alle ionen zoals natrium-adducten. </li><li> Identificeer de iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) in een mengsel van isobare Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) en iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) normen door vergelijking van de verschillende patronen van MS 4 product ionen uit de sodiated molecuulion via de glycan fragment m / z 667 en de terminal disaccharide 1 - buteen ion m / z 445 (dat wil zeggenX → 667 → 445 →, X betekent dat de moleculaire ion gedetecteerd bij MS 1) van zuivere permethylated iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) normen via ESI-LIT-MS met die van permethylated Gb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer). </li></ol>

<ol><li>Schnaar, R. L., Suzuki, A., Stanley, P. Chapter 10 Glycosphingolipids. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchnaar%2C+RL+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).</li>
<li>Bendelac, A. Chapter 17 NKT cells and other Innate-like T and B lineages. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBendelac%2C+A+%22Fundamental+Immunology%22">Fundamental Immunology</a>. Paul, W. E. , 6th edition, Lippincott Williams & Wilkins. (2011).</li>
<li>Jacewicz, M., Clausen, H., Nudelman, E., Donohue-Rolfe, A., Keusch, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+shigella+diarrhea.+XI.+Isolation+of+a+shigella+toxin-binding+glycolipid+from+rabbit+jejunum+and+HeLa+cells+and+its+identification+as+globotriaosylceramide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of shigella diarrhea. XI. Isolation of a shigella toxin-binding glycolipid from rabbit jejunum and HeLa cells and its identification as globotriaosylceramide.</a> J. Exp. Med. 163 (6), 1391-1404 (1986).</li>
<li>Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+function+of+iGb3%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protein+Pept.+Sci%22%5BJournal%5D)">The immunological function of iGb3.</a> Curr. Protein Pept. Sci. 7 (4), 325-333 (2006).</li>
<li>Miyamoto, K., Miyake, S., Yamamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+glycolipid+prevents+autoimmune+encephalomyelitis+by+inducing+TH2+bias+of+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic glycolipid prevents autoimmune encephalomyelitis by inducing TH2 bias of natural killer T cells.</a> Nature. 413 (6855), 531-534 (2001).</li>
<li>Zhou, D., Levery, S. B., Hsu, F. F., Wang, P. G., Teneberg, S., Almeida, I. C., Li, Y., Xu, H., Wang, L. X., Xia, C., Ibrahim, N. K., Michael, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+mapping+of+glycomes%3A+implications+for+cancer+diagnosis+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioscience%22%5BJournal%5D)">Immunologic mapping of glycomes: implications for cancer diagnosis and therapy.</a> Frontiers in Bioscience. S3, 1520-1532 (2011).</li>
<li>Li, Y., Thapa, P., Hawke, D., Kondo, Y., Furukawa, K., Furukawa, K., Hsu, F. F., Adlercreutz, D., Weadge, J., Palcic, M. M., Wang, P. G., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+glycosphingolipidomics+and+NKT+cell+development+in+mouse+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Immunologic glycosphingolipidomics and NKT cell development in mouse thymus.</a> J. Proteome Res. 8 (6), 2740-2751 (2009).</li>
<li>Li, Y., Zhou, D., Xia, C., Wang, P. G., Levery, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+quantitation+of+isoglobotriaosylceramide+in+the+presence+of+isobaric+components+using+electrospray+ionization-ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Sensitive quantitation of isoglobotriaosylceramide in the presence of isobaric components using electrospray ionization-ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 166-176 (2008).</li>
<li>Li, Y., Teneberg, S., Thapa, P., Bendelac, A., Levery, S. B., Zhou, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+detection+of+isoglobo+and+globo+series+tetraglycosylceramides+in+human+thymus+by+ion+trap+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Sensitive detection of isoglobo and globo series tetraglycosylceramides in human thymus by ion trap mass spectrometry.</a> Glycobiology. 18 (2), 158-165 (2008).</li>
<li>Hakomori, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+permethylation+of+glycolipid%2C+and+polysaccharide+catalyzed+by+methylsulfonyl+carbanion+in+dimethyl+sulfoxide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+%28Tokyo%29%22%5BJournal%5D)">A rapid permethylation of glycolipid, and polysaccharide catalyzed by methylsulfonyl carbanion in dimethyl sulfoxide.</a> J. Biochem. (Tokyo). 55, 205(1964).</li>
<li>Ciucanu, I., Kerek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+simultaneous+methylation+of+fatty+and+hydroxy+fatty+acids+for+gas-liquid+chromatographic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr.+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid and simultaneous methylation of fatty and hydroxy fatty acids for gas-liquid chromatographic analysis.</a> Carbohydr. Res. 131, 209(1984).</li>
<li>Kang, P., Mechref, Y., Klouckova, I., Novotny, M. V. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (23), 3421-3428 (2005).</li>
<li>Levery, S. B., Hakomori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+methylation+analysis+of+glycolipids+using+capillary+gas+chromatography-chemical+ionization+mass+fragmentography+with+selected+ion+monitoring%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Microscale methylation analysis of glycolipids using capillary gas chromatography-chemical ionization mass fragmentography with selected ion monitoring.</a> Methods Enzymol. 138, 13-25 (1987).</li>
<li>Spooncer, E., Fukuda, M., Klock, J. C., Oates, J. E., Dell, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+polyfucosylated+lactosaminoglycan+from+human+granulocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of polyfucosylated lactosaminoglycan from human granulocytes.</a> J. Biol. Chem. 259 (8), 4792-4801 (1984).</li>
<li>Ciucanu, I., Costello, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+oxidative+degradation+during+the+per-O-methylation+of+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Elimination of oxidative degradation during the per-O-methylation of carbohydrates.</a> J. Am. Chem. Soc. 125, 16213(2003).</li>
<li>Platt, F. M., Neises, G. R., Karlsson, G. B., Dwek, R. A., Butters, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-butyldeoxygalactonojirimycin+inhibits+glycolipid+biosynthesis+but+does+not+affect+N-linked+oligosaccharide+processing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">N-butyldeoxygalactonojirimycin inhibits glycolipid biosynthesis but does not affect N-linked oligosaccharide processing.</a> J. Biol. Chem. 269 (43), 27108-27114 (1994).</li>
<li>Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Chapter 47 Structural Analysis of Glycans. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMulloy%2C+B+%22Essentials+of+Glycobiology%22">Essentials of Glycobiology</a>. Varki, A., Cummings, R. D., Esko, J. D., Freeze, H. H., Stanley, P., Bertozzi, C. R., Hart, G. W., Etzler, M. E. , 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2009).</li>
<li>Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+1.+Mining+structural+details+by+MSn%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).</li>
<li>Zhang, H., Singh, S., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congruent+strategies+for+carbohydrate+sequencing.+2.+FragLib%3A+an+MSn+spectral+library%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 2. FragLib: an MSn spectral library.</a> Anal. Chem. 77 (19), 6263-6270 (2005).</li>
</ol>

DZ is een consultant voor Biotex, Houston, TX, en een uitvinder die betrokken zijn bij patenten met betrekking tot technologieën genoemd in dit artikel, worden afgegeven of in de toepassing.

De glycome, een term die in analogie met het genoom en proteoom, verwijst naar alle saccharide structuren van een organisme. Om volledig te begrijpen het spruitstuk functies van glycosylering vereist een geïntegreerde aanpak waarin zowel functionele en structurele glycomics studies. Beide worden gecompliceerd door de non-template gerichte aard van glycan biosynthese de resulterende complexiteit en diversiteit van glycaanstructuren, er vaak van aglycone structuur moduleren glycan ligand-receptor interacties op moleculair niveau en het functionele belang van lage abundantie liganden. Het is algemeen aanvaard dat massaspectrometrie (MS) is een onmisbare methode voor structurele studies glycomics, met name voor het identificeren en karakteriseren lage abundantie liganden. Om glycanen of glycoconjugaten als moleculaire species te observeren, maken we vaak gebruik van een zeer efficiënte, lage energie ionisatie methode, genaamd electrospray ionisatie (ESI). Meer detscheelde karakterisering van glycan structuur, is het essentieel om individuele moleculaire species selecteren en de glycanen breken in kleinere stukken. Dit wordt meestal gedaan door middel van botsing-geïnduceerde dissociatie, wat inhoudt dat het activeren van de glycanen door botsing met inert gas moleculen. De toegenomen energie induceert band breuk, en systematische analyse van de resulterende fragmenten geeft informatie over de moleculaire structuur van de glycan. Vaak kunnen &quot;handtekening&quot; fragmenten worden gegenereerd dat diagnostische zijn voor bepaalde glycan structurele kenmerken. Samen met de molecuulmassa Deze fragmenten kunnen soms voldoende voor het identificeren glycanen, maar in het verleden veel informatie nodig om volledig te karakteriseren, vooral als de structuur roman. Deze methoden bestaan ​​uit suiker samenstelling analyse, gaschromatografie massaspectrometrie analyse van gedeeltelijk gemethyleerde alditol acetaten voor linkage analyse en specifieke glycosidase spijsvertering 17. 18-19, meerdere ronden van lage energie fragmentatie, die effectief kan worden uitgevoerd in een ion-trap massaspectrometer (IT-MS), verbetert de opbrengst van informatie glycan massaspectrale analyse . Met vier of vijf keer fragmentatie (die niet kan worden gedaan met andere MS instrumenten), is te onderscheiden isomere glycanen die dezelfde suikercomponenten gerangschikt in verschillende suikerkoppelingen bevatten, zelfs wanneer deze samen aanwezig in mengsels van componenten met dezelfde moleculaire massa (isobaren). Voor deze analyse de glycanen werden gederivatiseerd, ter vervanging van alle vrije hydroxylgroepen met methylgroepen met permethylation. Terwijl structurele toewijzing van de glycanen is mogelijk zonder permethylation, de permethylation verhoogt de gevoeligheid 17. Levery en Zhou, hebben samen alle potentiële voordelen van IT-MS methode, zoals de detectie van isomere structures met signature diagnostische ionen, die slechts in 4 en MS MS spectra 5, voor de zeer gevoelige identificatie en kwantificering van glycosfingolipiden aanwezig in de vorm van meerdere isobare mengsels 7-9. In theorie kunnen we in staat zijn om elk bestaand glycolipide structuur te identificeren, in afwachting van de beschikbaarheid van standaard glycolipiden, die chemisch gesynthetiseerd kunnen worden. De kritische stappen van deze analyse zijn de opbrengst van GSLs uit biologische monsters. Typisch 80 ug van GSL kan worden teruggevorderd van 100 miljoen tumorcellen, zoals RBL. Om voldoende moleculaire ionen voor meerdere ronden van fragmentatie in ion-trap massaspectrometers genereren, ten minste 10 microgram van tumor GSLs vereist. Lage opbrengst van GSLs gedurende zuivering leidt tot geringe hoeveelheden ionen, die niet konden worden onderworpen aan verdere fragmentatie. Het succes van de analyse is afhankelijk van de hoeveelheid GSLs die worden teruggewonnen. Typisch, eindconcentration van permethylated GSLs moet tot 1 mg / ml, opgelost in methanol, alvorens geanalyseerd op een nano-electrospray bron. De grens voor een grondige analyse MS n is afhankelijk van de hoeveelheden van specifieke ionen in MS 1 profiel. Een typische e 7 ion overvloed is voor een grondig MS 5 analyse. De lage opbrengst van GSLs tijdens zuivering kan worden veroorzaakt door verminderde GSLs tijdens peracetylation stap (waardoor de fosfolipiden), wanneer de per-geacetyleerde GSLs is gebonden aan Florisil hars chromatografiekolom, gewassen en vervolgens geëlueerd. De binding van per-geacetyleerd GSLs op silicagel waarborgen, moeten de monsters tweemaal geladen om de chromatografiekolom na doorstromen.

<table><tbody><tr><td>1,2-Dichloor&amp;#8211;ethaan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34872</td><td>Carcinogeen</td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>VMR</td><td>JT9524-0</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuuranhydride</td><td>Fluka</td><td>45830</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fischer</td><td>A18P-4</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fischer</td><td>C606-1</td><td>Carcinogeen</td></tr><tr><td>DEAE Sephadex A25 (Cl-vorm)</td><td>GE Healthcare Biosciences</td><td>AB 17&amp;#8212;170-01</td><td>100 gram</td></tr><tr><td>Decaan (anhydrisch):</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>457116</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>Dichloorazijnzuur</td><td>Sigma</td><td>D54702</td><td>Carcinogeen</td></tr><tr><td>Dialyse cassette</td><td>Fischer(Pierce)</td><td>66110</td><td>Slide-A-Lyzer, 3500 MWCO, 3-12 ml</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Scientific</td><td>20684</td><td></td></tr><tr><td>Ethylacetaat</td><td>Fischer</td><td>UN1173</td><td></td></tr><tr><td>Florisil</td><td>Fluka</td><td>46384</td><td>voor het vullen van de chromatografiekolom</td></tr><tr><td>Hexanen</td><td>EMD</td><td>HX0290-6</td><td></td></tr><tr><td>Jodiummethaan</td><td>Riedel de Haen, Duitsland</td><td>03810</td><td>gestabiliseerd met zilverfolie, carcinogeen</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>VWR/EMD</td><td>MXO475-1</td><td></td></tr><tr><td>Neutrale glycosphingolipide Qualmix</td><td>Matreya</td><td>1505</td><td></td></tr><tr><td>Monosialganglioside mengsel</td><td>Matreya</td><td>1508</td><td></td></tr><tr><td>Disialoganglioside mengsel</td><td>Matreya</td><td>1509</td><td></td></tr><tr><td>Lactosylceramide en sialosylderivaten</td><td>Matreya</td><td>1510</td><td></td></tr><tr><td>Gangliotetraosylceramide en sialosylderivaten</td><td>Matreya</td><td>1511</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9"</td></tr><tr><td>Pyridine:</td><td>Sigma</td><td>270407</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide:</td><td>BDH</td><td>0292</td><td>500 gram</td></tr><tr><td>Natriummethoxide</td><td>Sigma</td><td>404367</td><td>0,5 M oplossing in methanol</td></tr><tr><td>Tolueen</td><td>J.T. Baker</td><td>9351-03</td><td>4 L</td></tr><tr><td>Pasteurpipetten</td><td>Fischer</td><td>13-678-6A</td><td>9"</td></tr><tr><td>Glasvezel (glaswol)</td><td>Corning Incorporated</td><td>3950</td><td>Pyrex 9989 glas</td></tr><tr><td>12x75 mm glazen buisjes</td><td>Fischer</td><td>14-962-10B</td><td></td></tr><tr><td>Gekalibreerde pipetten (100 microliter)</td><td>VMR</td><td>53432-921</td><td></td></tr><tr><td>16x100 mm wegwerpbuisjes van borosilicaatglas x1.000</td><td>Fischer</td><td>14-961-29</td><td>Met schroefdoppen</td></tr><tr><td>Doppen voor glazen buisjes</td><td>Kimble</td><td>40566C</td><td>maat/13-415</td></tr><tr><td>Merck TLC-platen</td><td>Sigma</td><td>Z 29, 301-6</td><td></td></tr><tr><td>Glazen tank voor TLC</td><td>Sigma</td><td>Z 12,619-5</td><td></td></tr><tr><td>Drummond Microcaps</td><td>Drummond scientific company</td><td>1-000-0100</td><td>10 &amp;mu;l, voor het aanbrengen van TLC-monsters</td></tr><tr><td>Sunrise Microplate Absorbance Reader</td><td>Tecan</td><td>A-5082</td><td></td></tr><tr><td>Whatman chromatografiepapier</td><td>Fischer</td><td>05-716-3E</td><td>18 cm x 34 cm voor TLC-tank</td></tr><tr><td>Orcinol-ijzer(III)chloride spuitreagens</td><td>Sigma</td><td>O7875</td><td>Voor het detecteren van glycosphingolipiden op TLC-platen</td></tr><tr><td>Prevel spuitunit</td><td>Sigma</td><td>Z 36,555-6</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Fischer</td><td>FS20</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Speedvac</td><td>Savant</td><td>AS160</td><td>Met chemische val voor organische oplosmiddelen</td></tr><tr><td>MALDI TOF-TOF massaspectrometer</td><td>Applied Biosystems</td><td>Proteomics 4700</td><td></td></tr><tr><td>Ion Trap massaspectrometer</td><td>Thermo</td><td>LTQ</td><td></td></tr></tbody></table>

massaspectrometrische analyse van glycosfingolipiden antigenen

Mass Spectrometric Analysis of Glycosphingolipid Antigens

Glycosfingolipiden (GSL&#39;s) behoren tot de klasse van Glycoconjugaat biomacromoleculen die structurele informatie voor belangrijke biologische processen zoals embryonale ontwikkeling, signaaltransductie en immune receptorherkenning 1-2 dragen. Ze bevatten complex suikereenheden in de vorm van isomeren en lipide groepen met variaties zoals vet acyl ketenlengte, onverzadiging en hydroxylering. Zowel koolhydraten en ceramide delen kunnen basis van biologische betekenis. Bijvoorbeeld tri-hexosylceramides omvatten globotriaosylceramide (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) en isoglobotriaosylceramide (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) die identieke moleculaire massa maar verschillende suikerkoppelingen van koolhydraatonderdeel verantwoordelijk voor totaal verschillende biologische functies hebben 3-4. In een ander voorbeeld is aangetoond dat modificatie van de ceramide van alpha-galactosylceramide, een krachtige agonist ligand voor invariant NKT cellen, verandert hun cytokine secretie profielen en functie in diermodellen van kanker en auto-immuunziekten 5. De moeilijkheid bij het ​​uitvoeren van een structurele analyse van isomeren in immune organen en cellen dienen als een barrière voor het bepalen van vele biologische functies 6. Hier geven we een gevisualiseerde uitvoeringsvorm van een werkwijze voor relatief eenvoudige, snelle en gevoelige analyse van glycosfingolipiden profielen in immuuncellen 7-9. Deze methode is gebaseerd op extractie en chemische modificatie (permethylation, zie figuur 5A hieronder, alle OH groepen zijn vervangen door hexose MeO na permethylation reactie) van glycosfingolipiden 10-15, gevolgd door daaropvolgende analyse met matrix-assisted laser desorptie / ionisatie time- of-flight massaspectrometrie (MALDI-TOF/MS) en ion trap massaspectrometrie. Deze methode vereist 50000000 immuuncellen voor een volledige analyse. De experimenten kan worden voltooid binnen een week. De relatieve hoeveelheden van de verschillende glycosfingolipiden worden afgebakend door vergelijking met synthetische normen. Deze methode heeft een gevoeligheid van 1% meten iGb3 onder Gb3 isomeren toen 2 fmol totale iGb3/Gb3 mengsel aanwezig 9. Ion trap massaspectrometrie kan gebruikt worden om isomeren te analyseren. Bijvoorbeeld, de aanwezigheid van globotriaosylceramide en isoglobtriaosylceramide in hetzelfde monster te analyseren, kan men de fragmentatie van glycosfingolipiden moleculen structureel onderscheid tussen beide (zie hieronder figuur 5). Bovendien chemische modificatie van de suikergroepen (via een permethylation reactie) verbetert de ionisatie en fragmentatie efficiëntie voor een grotere gevoeligheid en specificiteit, en verhoogt de stabiliteit van siaalzuurresten. De extractie en chemische modificatie van glycosfingolipiden kan worden uitgevoerd in een gecertificeerde klassieke chemische afzuigkap en massaspectrometrie kan door kernfaciliteiten met ion trap MS instrumenten.

Een voorbeeld van een MALDI MS analyse van de glycosfingolipiden van rat leukemiecellijn RBL (een antigen presenterende cel die het glycosfingolipiden antigenen presenteert NKT cellen) wordt getoond in Figuur 3. De ionen kunnen worden toegewezen aan specifieke glycosfingolipiden structuren (Figuur 3A). In RBL-cellen behandeld met NB-DGJ 16, een geneesmiddel dat glycosfingolipiden synthese significante reductie van alle glycosfingolipiden waargenomen (Figuur 3B) remt. Structuurisomeren niet kan worden onderscheiden. De MS / MS capaciteit van de Applied Biosystems 4700 kan fragmentatie van ionen MS1 MS 2 fragmenten, waardoor beperkte structurele informatie te genereren. Echter MS2 analyse vaak niet voldoende om oligosaccharide isomeren discrimineren. De Ion Trap-MS analyse van glycosfingolipiden maakt de studie van isomeren, zoals iGb3 (Galα3Galβ4Glcβ1Cer) en Gb3 (Galα4Galβ4Glcβ1Cer) die voorkomen als de trihexosylceramide ionen gedetecteerd in figuur 3A. Om dergelijke isomeren detecteren werden standaard iGb3 en Gb3 geanalyseerd door meerdere rondes van fragmentatie tot verschillen gevonden (Figuur 4A en 4B). In het voorbeeld hier gepresenteerd (figuur 5C) iGb3 en Gb3 kan worden gediscrimineerd door het vergelijken van de standaard iGb3 en Gb3. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig1.jpg" /> Figuur 1. Stroomschema van de glycosfingolipiden extractieprocedure en chemische modificatie van glycosfingolipiden (permethylation). Glycosfingolipiden werden uit cellen door organische oplosmiddelen. Als u niet-glycosfingolipiden te verwijderen, kan lipiden zijn geperacetyleerde en gedeacetyleerd. Tweede glycosfingolipiden chemisch zijn gemodificeerd door een permethylation reactie die verbeterd gevoeligheid en specificiteit van MS detection. Tenslotte werden de glycosfingolipiden profielen bepaald met MALDI-TOF massaspectrometrie en ion trap massaspectrometrie. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig2.jpg" /> Figuur 2. Glycosfingolipiden Kwantificatie door orcinol zwavelzuurmethode: Kwantificering van glycosfingolipiden toepassing van een 0,2% orcinol in 50% zwavelzuur en Glucose standaardcurve. <img alt="Figuur 3" fo:content-width="4.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig3.jpg" /> Figuur 3. Glycosphingolipidomics van rat leukemiecellen A. Representative MALDI massaspectrum;. Elk ion vormt een specifieke glycosfingolipiden structuur kunnen structurele isomeren niet te onderscheiden B. NB-DGJ, een medicijn dat glycosfingolipiden synthese s remt.ignificantly reduceert alle glycosfingolipiden geproduceerd in RBL-cellen. <img alt="Figuur 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig4.jpg" /> Figuur 4. Tandem Massaspectrometrie van isomeren van glycosfingolipiden. A. Kenmerkend ontbinding trajecten voor positieve modus ion trap massaspectrometrie van permethylated GSLs Gb 3 Cer en IGB 3 Cer. Gb 3 en IGB 3 duidelijk gescheiden door hun fragmentatiepatronen. De verschillen in koppeling worden in de MS 4 product ionen in overeenstemming met de isobare m / z 445 precursors. B. Representatieve resultaten geeft iGB3 kan worden gemeten in een mengsel van isomeren iGb3/Gb3. Sterren geven diagnostische ionen voor iGb3 alleen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om</a>foto voor vergroting figuur. <img alt="Figuur 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4224/4224fig5.jpg" /> Figuur 5. Ion trap MS maakt analyse van isomeren van glycosfingolipiden. A. Standaard iGb3 en Gb3 tonen verschil van fragmentatie profiel na 4 rondes van fragmentatie in een ionenval LTQ massaspectrometer. B. Kenmerk MS 4 profiel van ionen afkomstig van iGb3 of Gb3. C. Trihexosyleramides zijn mengsels van iGb3 en Gb3 isomeren die kunnen worden geïdentificeerd door ion trap MS methode (figuur door Dapeng Zhou). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4224/4224fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

Een specifieke en gevoelige methode om inzicht te krijgen in de expressie profiel van glycosfingolipiden antigenen in het immuunsysteem organen en cellen wordt beschreven. De methode maakt gebruik van de ion trap massaspectrometrie waardoor stapsgewijze versnippering van glycosfingolipiden moleculen voor structurele analyse in vergelijking met chemisch gesynthetiseerde standaard.

Massaspectrometrische analyse van glycosfingolipiden antigenen

Glycosfingolipiden (GSL's) behoren tot de klasse van glycoconjugaat-biomacromoleculen, die structurele informatie bevatten voor belangrijke biologische processen ...

Het algemene doel van deze procedure is het creëren van een specifieke en gevoelige methode om inzicht te krijgen in het expressieprofiel van glyco-finger lipide antigenen in immuunorganen en cellen. Dit wordt bereikt door eerst de glyco-finger lipiden uit de cellen te extraheren. De tweede stap is het scheiden van neutrale glyco-finger lipiden van zure glyco-finger lipiden.Nadat de fosfolipiden uit de neutrale lipiden zijn verwijderd, worden de geëxtraheerde glycolipiden chemisch gemodificeerd middels een permethyleringsreactie, waarbij alle hydroxylgroepen van hexosen worden vervangen door methoxygroepen. Uiteindelijk worden de geëxtraheerde glycolipiden geanalyseerd met behulp van matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight massaspectrometrie, afgekort als MALDI-TOF MS, en iontrap massaspectrometrie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals analytische HPLC en antilichaamkleuring, is dat massaspectrometrie gevoeliger is en nauwkeurige massa's van moleculen meet.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het vakgebied van de immunologie, zoals het meten van glycolipide antigenen met een lage abundantie. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie of diagnose van kanker, aangezien veel glycolipide antigenen, zoals GD two en global H, worden tot expressie gebracht als kankerbiomarkers. Ik zal de procedure demonstreren als bachelorstudent uit het laboratorium van professor DA pen Zoe.Dr. David Hawk zal procedures uitvoeren op de massaspectrometrie-instrumenten. Bereid vóór het starten van deze procedure rat basofiele leukemiecellen voor door de cellen te tellen met een hemocytometer. Na trypaanblauw-kleuring moet de levensvatbaarheid van de cellen hoger zijn dan 95%. Extraheer de lipiden door eerst zes milliliter van een chloroform-methanol mengsel in een volumeverhouding van één-op-één aan de cellen toe te voegen.Pas uitgebreide sonicatie toe gedurende één tot twee uur met het oplosmiddel van gemengde polariteit. Herhaal deze procedure tweemaal met een volumetrische verhouding van 55 tot 25 tot 20 isopropanol hexaan water, bereid zoals beschreven in de schriftelijke procedure, als finale extractie. Voeg zes milliliter chloroform en methanol toe en voer vooraf sonicatie uit.Volg de sonicatie met centrifugatie om het onoplosbare materiaal te pelletteren bij 4,000 RPM gedurende vijf minuten. Verwijder de Senna voordat deze gedurende vier uur worden gedroogd in een speed vac. Om de neutrale lipiden van de zure lipiden te scheiden, wordt anionuitwisselingschromatografie gebruikt op een kleine kolom van de A e sedex A 20.Nadat de DEAE SEDEX A 25 is voorbereid zoals beschreven in de schriftelijke procedure bij deze video, wordt de kolom klaargemaakt met een glazen wand en een pasta-pipet van negen inch. Pak de glazen wand zorgvuldig in, zodat er geen harspoeder door de kolom kan lekken. Voeg DEAE sedex A 25-hars toe aan de hals van de negen inch pasta-pipet zonder de kolom te laten uitdrogen.Zorg ervoor dat er geen hars in het buisje zit. Los de lipiden op, sonicate deze en resuspendeer ze in een volumetrische verhouding van 30:60:8 van chloroform, methanol en water, en breng de opgeloste monsters aan op de kolom. De neutrale lipiden zullen door de kolom stromen, terwijl de geladen lipiden in de kolom achterblijven; elueer de zure lipidfractie met 8 mL natriumacetaat in methanol.Hier wordt de gedroogde negatief geladen fractie getoond na behandeling met natriumacetaat. Ontzout de fracties door middel van dialyse met behulp van de slide Eliza dialyse-cassette na de dialyse. Droog de fracties met een SpeedVac vóór de preliminaire analyse van de lipiden met behulp van high performance thin layer chromatografie of H-P-T-L-C; om H-P-T-L-C uit te voeren, lost u de geïsoleerde neutrale glycosfingolipiden of gsl op in 200 µL van een chloroform-methanol-oplosmiddel in een volumeverhouding van 1:1.Breng het monster aan op een silica-gel dunne-laag chromatografieplaat. Ontwikkel de platen in een volumeverhouding van 60:35:8 chloroform:methanol:water nadat de plaat is gedroogd. Visualiseer de glyco-vingerafdruk lipiden met arseen-zwavelzuur bij 300 °C voor de zure lipiden of gangliosiden.Gebruik een volumeverhouding van 55:25:20 van isopropanol:hexaan:water als oplosmiddel en voer de H-P-T-L-C op dezelfde wijze uit. Op dit punt bevat de neutrale fractie niet alleen neutrale glycofingerlipiden, maar ook fosfolipiden, die verwijderd moeten worden door middel van een acetylerings- en para-acetyleringsreactie. Droog vervolgens de DEAE sedex A 25 pass-through fractie gedurende vier uur in de SpeedVac met koeling.Nadat de monsters droog zijn, plaatst u ze terug in de SpeedVac en droogt u ze nog vier uur lang. Zorg ervoor dat deze monsters volledig droog zijn, aangezien elk residu aan water de para-acetyleringsreactie zal verhinderen. Voeg één milliliter PERINE en 0,5 milliliter azijnzuuranhydride toe aan de monsters voor de para-acetyleringsreactie van maximaal 200 microgram glycosphingolipiden, waarbij u deze donker incubeert bij 37 °C gedurende de nacht.Bij een temperatuur waarbij de GSL beter zijn, voegt men één milliliter tolueen toe om volledige verdamping te garanderen en droogt men het geparaffineerde materiaal gedurende drie uur met een speed vac. Als de monsters nog niet volledig droog zijn, wordt de speed VAC gebruikt tot ze droog zijn; hier wordt het gedroogde paraffine-monster getoond. Bereid ondertussen een Florisil-kolom voor door de Florisil-beads eerst volledig te drogen door incubatie in een oven van 110 °C.Bereid vervolgens de kolom voor in een pasta-pipet met glaswol door de korrels tot aan de hals in de pasta-pipet te vullen en te equilibreren in een volumeverhouding van vier op één van 1,2-dichloorethaan-hexaan. Elutie uit de flues-celkolom verloopt zeer snel. De hoge vluchtigheid van de oplosmiddelen kan leiden tot het uitdrogen van de kolom. Daarom moeten alle oplosmiddelmengsels worden bereid voordat de kolom wordt gebruikt.Aangezien het niet mogelijk is om de kolom tijdens de elutie te stoppen, wordt het monster in één milliliter aangebracht in een volumeverhouding van vier op één van 1,2-dichloorethaan/hexaan. Was de kolom met zes milliliter van hetzelfde oplosmiddel, gevolgd door 10 milliliter 1,2-dichloorethaan voor de elutie.Meng de neutrale percet GSL met zes milliliters van een volumetrische verhouding van één-op-één van één twee dichloorethanol en aceton. Deze stap verwijdert de percet-fosfolipiden van de glyco-vingerlipiden, omdat de percet-glyco-vingerlipiden binden aan de fluorol-kolom terwijl de percet-fosfolipiden dat niet doen. Na het drogen van de fracties met een SpeedVac gedurende twee uur, vindt de deacetylering plaats met twee milliliters 0,5 M natriummethoxide en twee milliliters methanol gedurende drie uur bij kamertemperatuur.Na de incubatie wordt het mengsel geneutraliseerd met drie milliliter methanol en azijnzuur, waarna het wordt gedroogd met een SpeedVac. De dialyse wordt uitgevoerd door de gedroogde producten op te lossen in drie milliliter water en deze in een slide Eliza dialyse cassette te injecteren, gevolgd door dialyse tegen water gedurende 24 uur, waarbij het water minstens tweemaal wordt ververst. Droog de gedialyseerde gsl met een SpeedVac totdat de monsters volledig droog zijn. Voor permethylering: breng eerst GSL in een hoeveelheid van 150 microliters dimethylsulfoxide over in een glazen buisje met schroefdop en Teflon-liner. Bereid in de zuurkast, zonder speciale droogcondities of een inerte gasatmosfeer, gepoederd natriumhydroxide door natriumhydroxide-deeltjes te malen in een chemische vijzel met een stamper. Voeg vervolgens met een spatel het natriumhydroxidepoeder toe aan de monsteroplossing.Voeg vervolgens 80 µL IO-methaan toe met een Hamilton-spuit van 100 µL. Schud het mengsel gedurende één uur bij kamertemperatuur. Nadat de methyleringsreactie is gestopt met twee milliliter water, worden de permethylerede producten geëxtraheerd door toevoeging van twee milliliter dichloormethaan. Glycolipiden bevinden zich in de dichloormethaanfase, wat de onderste fase is, waardoor de bovenste fase kan worden overgebracht naar een nieuwe glazen buis.De permanent gemethyleerde producten kunnen vervolgens opnieuw worden geëxtraheerd met dichloormethaan voor een totaal van drie extracties. Was de gecombineerde dichloormethaanextracten drie keer met 2 mL water, waarbij na elke wasbeurt de bovenste waterige fase wordt weggegooid. Na de laatste wasbeurt worden de monsters overgebracht naar een nieuwe buis en gedroogd. Met behulp van een speedvac kunnen de monsters vervolgens worden opgelost in 100 tot 200 µL methanol voor massaspectrometrie-analyse. Zoals beschreven in de schriftelijke procedure werden de monsters ingediend bij de proteomics-faciliteit van het University of Texas MD Anderson Cancer Center en geanalyseerd met een MALDI-TOF/TOF-massaspectrometer en een ion-trap LTQ-massaspectrometer.Hier wordt een voorbeeld getoond van de MALDI MS-analyse van de glyco-fingerlipiden uit de ratleukemie-cellijn RBL, een type antigeenpresenterende cel dat glyco-fingerlipidantigenen presenteert aan NKT-cellen. De ionen kunnen worden toegewezen aan specifieke glyco-fingerlipidstructuren in RBL-cellen die zijn behandeld met het geneesmiddel dat de synthese van glyco-fingerlipiden remt. Er werd een significante afname van alle glyco-fingerlipiden waargenomen.Structurele isomeren kunnen niet van elkaar worden onderscheiden. De msms-capaciteit van het gebruikte biosystems 4, 700 maakt fragmentatie van MS1-ionen naar MS2-fragmenten mogelijk, waardoor beperkte structurele informatie kan worden gegenereerd. MS2-analyse is echter vaak onvoldoende om oligosacharide-isomeren te onderscheiden, terwijl de ion-trap MS-analyse van glyco-fingerlipiden de studie van oligosacharide-isomeren mogelijk maakt om dergelijke isomeren te detecteren.Standaard IGB drie en GB drie werden geanalyseerd via meerdere rondes van fragmentatie totdat verschillen werden gevonden, zoals weergegeven in deze karakteristiek. MS vier-profiel van ionen afgeleid van IGB drie of GB drie wanneer verschillende ratio's van IGB drie en GB drie worden gemengd; een standaardcurve kan worden opgesteld op basis van de ionenovervloed van kenmerkende ionen afgeleid van elk isomeer. In het hier gepresenteerde voorbeeld konden IGB drie en GB drie worden onderscheiden door vergelijking met de standaarden.Dit spectrum vertegenwoordigt de MS4-analyse van 1 3 2 5, waarbij de moleculaire ionen IMR's van GB3 en IGB3 vertegenwoordigen; kenmerkende ionen voor IGB3 en kenmerkende ionen voor GB3 werden gevonden, wat wijst op de aanwezigheid van een mengsel van de twee isomeren. De verhouding tussen IGB3 en GB3 werd berekend door vergelijking met een standaardcurve. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat glycolipiden tijdens de chromatografie volledig moeten worden teruggewonnen vóór de permethylering van de glycolipiden.Zorg ervoor dat er tijdens de zuivering ten minste 80 µg glycolipiden worden teruggewonnen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het analyseren van glycolipiden via een semi-kwantitatieve massaspectrometrie-methode. U zult de belangrijkste stappen beheersen van de extractie van glycolipiden, de scheiding in neutrale en zure fracties, de modificatie door een permethyleringsreactie en het indienen van de gemodificeerde glycolipiden bij uw massaspectrometrie-faciliteit.Vergeet niet dat werken met 1,2-dichloorethaan, chloroform, chloorazijnzuur en jodiummethaan extreem gevaarlijk en carcinogeen kan zijn; voorzorgsmaatregelen zoals het dragen van handschoenen en een laboratoriumjas moeten altijd worden genomen bij het uitvoeren van deze procedure. Houd u aan de regels en veel succes met uw ontdekking.

mass-spectrometric-analysis-of-glycosphingolipid-antigens

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Het gebruik van specifieke glycosidases om suikers te verwijderen uit glycoproteïnen, gevolgd door SDS-PAGE is een waardevolle methode om glycan wijzigingen op eiwit-samples te detecteren en is een goede keuze voor de eerste glycobiologie studies. Veranderingen na deglycosylatie kunnen worden gedetecteerd als verschuivingen in gel mobiliteit of door kleuring met glycan gevoelige reagentia.

Identificatie en karakterisering van proteïne glycosylering met behulp van specifieke endo-en exoglycosidases

Om de diversiteit van O-gekoppelde glycanen grondig te onderzoeken, wordt een nieuwe procedure voor in-gel reducerende β-eliminatie, gecombineerd met permethylering en een snelle fase-verdelingsmethode, toegepast op de analyse van O-gekoppelde glycanen die direct vrijkomen uit glycoproteïnen opgelost door SDS-PAGE en bruikbaar voor verdere glycomics-analyse door massaspectrometrie.

Verbeterde In-gel Reductive β-eliminatie voor Comprehensive O-gebonden en Sulfo-glycomics door massaspectrometrie

Dit artikel presenteert een verbeterde vorm van een nieuwe bottom-up glycomische techniek die is ontworpen om het gepoolde samenstellingsprofiel van glycanen in niet-gefractioneerde biofluiden te analyseren door de chemische afbraak van glycanen in hun samenstellende bindingsspecifieke monosacchariden voor detectie door GC-MS. Mogelijke toepassingen omvatten vroege detectie van kanker en andere glycan-beïnvloedende aandoeningen.

Glycan Node Analyse: een bottom-up benadering van Glycomics

Dit artikel beschrijft een methode cardiovasculaire weefselmonsters voor MS analyse mogelijk maakt (1) de analyse van ECM eiwitsamenstelling, (2) het identificeren van glycosyleringsplaatsen, en (3) de samenstelling karakterisering van glycan vormen moeten worden bereid. Deze methodologie kan worden toegepast, met kleine modificaties, voor de studie van de ECM in andere weefsels.

Glycoproteoomanalyses van de extracellulaire matrix: Een methode voor Intact Glycopeptide analyse met behulp van massaspectrometrie

Sialic acid is een typische monosaccharide-eenheid gevonden in glycoconjugates. Het is betrokken bij een overvloed van moleculaire en cellulaire interacties. Hier presenteren we een methode als u wilt wijzigen van cel oppervlakte sialic zuur expressie metabole glycoengineering met N- acetylmannosamine derivaten.

Metabole Glycoengineering van Sialic zuur met N-acyl-gewijzigd Mannosamines

Een sialoglycan microarray test kan gebruikt worden om anti-Neu5Gc antilichamen in humane sera te evalueren, waardoor het een potentiële diagnostische test voor kanker en andere chronische ontstekingsgemedieerde menselijke ziekten is.

Profiling Anti-Neu5Gc IgG in Human Sera met een Sialoglycan Microarray Assay

Dit protocol beschrijft de glycomics-geleide glycoproteomics-methode, een geïntegreerde omics-technologie die uitgebreide inzichten biedt in het heterogene glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen die nodig zijn om de glycobiologie van kankers beter te begrijpen.

Glycomics-geleide glycoproteomics vergemakkelijkt uitgebreide profilering van het glycoproteoom in complexe tumormicro-omgevingen 

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de afgifte van O-glycanen uit mucines en de daaropvolgende ontzouting, permethylering en analyse met behulp van MALDI-TOF-massaspectrometrie.

Profilering van gepermethyleerde mucine O-glycanen met behulp van matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie Time-of-flight massaspectrometrie

Er werd een protocol ontwikkeld voor de bereiding van gezuiverde mitochondriën uit microgliacellen, isolatie van mitochondriale eiwitten voor de afgifte van N-glycanen en snelle detectie van subcellulaire, mitochondriale glycanen met behulp van infraroodmatrix-geassisteerde laserdesorptie elektrospray-ionisatie gekoppeld aan nauwkeurige massaspectrometrie met hoge resolutie.

Mitochondriaal preparaat uit microglia voor glycaananalyse

Dit protocol beschrijft de belangrijkste stappen om rigoureuze en reproduceerbare metingen van zowel glycogeen- als N-gekoppelde glycanen mogelijk te maken met behulp van massaspectrometriebeeldvorming.

Ruimtelijke moleculaire beeldvorming van het glyaom met behulp van massaspectrometrie

Leer een gevoelige massaspectrometrie-methode voor analyse van glycosfingolipiden antigenen in immuuncellen. Deze techniek verbetert de detectie van laagfrequente glycolipiden voor immunologisch en oncologisch onderzoek.

Massaspectrometrische analyse van glycosfingolipiden antigenen

Meer video's verkennen