Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie
1 oktober 2012
Werkwijzen voor het zuiveren van cholesterol binding toxine streptolysine O van recombinant E. coli En visualisatie van toxine te binden aan eukaryote cellen leven worden beschreven. Gelokaliseerde levering van toxine veroorzaakt een snelle en complexe veranderingen in gerichte cellen onthullen nieuwe aspecten van toxine biologie.
Het doel van deze procedure is om de reacties van immuuncellen op bacteriële toxinen te visualiseren. Eerst wordt het toxine geëxpresseerd in en gezuiverd uit BL 21 goud cellen. Zodra de activiteit en concentratie van het toxine zijn bevestigd, wordt het toxine aan immuuncellen geleverd.
Met behulp van een micro-injector en hogesnelheids-live celmicroscopie wordt uitgevoerd. Analyse van de resulterende beelden onthult de realtime kinetica van immuuncelreacties op het toxine. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie, zoals het mechanisme van inflammasoomactivering.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in door toxine gemedieerde immuunreacties, kan deze ook worden toegepast op andere stimuli, inclusief chemotactische tractors. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode bij het bestuderen van de interactie van bacteriën met gekweekte immuuncellen en observeerden zeer variabele interacties tussen bacteriën en de immuuncellen. Begin met de zuivering van strep lysine O of SLO met een cultuur van BL 21 goud cellen die PAG drie SLO bevatten.
Zijn plasmide groeide tot een OD van ongeveer 0,6. Om eiwitexpressie te induceren, voeg je vijf milliliter 20% van OSes toe aan de cultuur en schud je drie uur lang bij 2 25 RPM op kamertemperatuur. Draag vervolgens de bacteriën over naar een 500 milliliter centrifugefles.
Draai vervolgens de cultuur gedurende 12 minuten bij 12.000 keer G bij vier graden Celsius en decanteer na het draaien. Bewaar de supernatant bij min 80 graden Celsius voor een nacht of langer indien nodig. Om het geëxpresseerde SLO te zuiveren, voeg je 10 milliliter ly-wasbuffer toe, aangevuld met Triton X 100 lysozym en fenylmethylsulfonylfluoride, aan de bevroren pellet. Pipetteer omhoog en omlaag gedurende ongeveer 15 minuten.
Om te resuspenderen, houdt u de pellet in beweging terwijl u het monster op ijs houdt. Breng de gesuspendeerde pellet over naar een 50 milliliter rondbodempolypropyleenbuis van Oak Ridge. Soniceer het lysate met behulp van een sonde-sonicator gedurende 30 seconden, vijf keer, met tussenpozen van 30 seconden en 30 seconden op ijs tussendoor.
Draai vervolgens het sonicate-lysaat gedurende 20 minuten bij 39.000 keer G bij vier graden Celsius. Voeg na het draaien de bacteriënsupernatant toe aan één milliliter gewassen nikkel NTA aros. Incubeer de nikkel NTA aros en het lysate gedurende 2,5 uur bij vier graden Celsius met zacht schudden Na de incubatie.
Pellet de kralen door te draaien bij 400 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Merk op dat alle verdere wasbeurten en elutie worden uitgevoerd met deze centrifugatie-instellingen en minder, tenzij anders vermeld. Na de centrifugatie.
Combineer 30 microliter van de supernatant met 10 microliter vier keer SDS-monsterbuffer in een microcentrifugebuis en bewaar het op ijs voor zuiverheidsanalyse. Gooi vervolgens de rest van het supine-agens weg en was de kralen vier keer in lice-wasbuffer. En eenmaal geïnteresseerd in het zoutbuffer centrifugeren tussen elke wasbeurt Vanaf dit punt dient u ervoor te zorgen dat het monster altijd op ijs wordt gehouden.
SLO is een zeer redoxgevoelig eiwit en het zal snel zijn activiteit verliezen als het opwarmt tot 37 graden Celsius, zelfs voor een korte periode. Om het SLO-eiwit te elueren, voeg je een milliliter elutiebuffer en vijf microliter één molair DTT toe aan de kralen, incubeer op ijs gedurende 10 minuten. Centrifugeer vervolgens en verzamel het supernatant in een fugebuis gelabeld met het eluciaannummer.
Herhaal dit proces drie keer en voeg vervolgens 200 microliter gewassen polymixconjugaat-agrokralen toe aan het monster, gesuspendeerd in res-zoutbuffer, om endotoxine uit het SLO-eiwit te verwijderen. Schud gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Draai vervolgens bij 10.000 keer G gedurende één minuut bij vier graden Celsius. Verzamel na het draaien het supernatant in nieuwe gelabelde microcentrifugebuizen.
Combineer 30 microliter van elke elutie met 10 microliter, vier keer SDS-monsterbuffer. Voor SDS-pagina-analyse, bewaar de SLO-oplossingen op ijs. Bepaal de eiwitconcentraties en hemolytische activiteit als deze bevredigend zijn, trek de SLO in vijf tot tien microliter-kwartjes, bevries dan op droog ijs en bewaar bij min 80 graden Celsius.
Bepaal vervolgens de specifieke lysis. Reese. Suspendeer de te testen cellen bij twee keer. Centreer de zes cellen per milliliter in buffer RB met 20 microgram per milliliter.
Propidiumjodide. Hier worden T 27 A-cellen getest. Voeg 100 microliter cellen toe aan elke put van een 96-wels V-bodemplaat in afzonderlijke microcentrifugebuizen.
Verdun SLO seriëel tot twee keer de uiteindelijke concentratie in buffer rb. Voeg vervolgens 100 microliter toxine of 100 microliter buffer RB toe aan de cellen en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Typische uiteindelijke concentraties variëren van 2000 eenheden per milliliter tot 31,25 eenheden per milliliter.
Voer cellen uit op een flowcytometer en verzamel gegevens met filters voor fi, cethrin of pe. Een verschuiving van één log vertegenwoordigt tijdelijk permeabele cellen, terwijl een verschuiving van drie log dode cellen aangeeft. Bereken de specifieke lysis van de cellen door het percentage dode cellen in de controle af te trekken van de experimentele met behulp van de hier getoonde vergelijking een dag voor de experimenten plaat, twee keer het centrum van de vijf macrofagen op met collageen bedekte glas.
Onderkant 35 millimeter schotels. De microscoop die wordt gebruikt voor toxinelevering moet zijn uitgerust met een omgekeerde stage, een verwarmde stage, de juiste excitatie-emissiefilterkubussen en, indien beschikbaar, een Bertrand-lens. Het moeilijkste deel van deze procedure is om de naald intact naar de cellen te brengen.
Om succes te garanderen, gebruiken we een Bertrand-
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft methoden voor het zuiveren van de cholesterolbindende toxine streptolysine O uit recombinante E. coli en het visualiseren van de binding ervan aan levende eukaryote cellen. De gelokaliseerde toediening van de toxine induceert snelle en complexe veranderingen in gerichte immuuncellen, waardoor nieuwe aspecten van de biologie van de toxine worden onthuld.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Toxinebiologie
- Cellulaire responsen
Achtergrond
- Streptolysine O is een cholesterolbindend toxine.
- Het begrijpen van immuuncelresponsen op bacteriële toxines is cruciaal.
- Live-cell microscopie biedt inzicht in cellulaire dynamiek in realtime.
- Mechanismen van inflammasoomactivatie zijn van bijzonder belang.
Doel van de studie
- Om immuuncelresponsen op streptolysine O te visualiseren.
- Om de kinetiek van toxine-geïnduceerde veranderingen in levende cellen te analyseren.
- Om de biologische implicaties van toxine-interacties te onderzoeken.
Gebruikte methoden
- Expressie en zuivering van streptolysine O uit BL 21 gold cellen.
- Bevestiging van de toxineactiviteit en -concentratie.
- Aflevering van het toxine in immuuncellen met behulp van een micro-injectiesysteem.
- High-speed live-cell microscopie voor het visualiseren van cellulaire responsen.
Belangrijkste Resultaten
- Real-time imaging onthult de kinetiek van immuuncelresponsen.
- Gelokaliseerde toediening van de toxine induceert significante cellulaire veranderingen.
- Er worden inzichten verkregen in het mechanisme van inflammasoomactivering.
- Nieuwe aspecten van de biologie van toxinen worden via deze methode ontdekt.
Conclusies
- De methode biedt een krachtig instrument voor het bestuderen van immuunresponsen.
- Inzicht in toxin interacties kan therapeutische strategieën informeren.
- Dit onderzoek draagt bij aan het bredere veld van de immunologie.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie voor Management
Het visualiseren van real-time immuuncelresponsen op bacteriële toxinen maakt het mogelijk om mechanische risico's bij targetvalidatie in infectieziekten en de ontdekking van immunomodulerende geneesmiddelen te verminderen. Live-cell fluorescentiemicroscopie levert kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste gegevens over toxine-geïnduceerde cellulaire veranderingen, wat het voorspellende vertrouwen in assays voor target-engagement in een vroeg stadium ondersteunt. Deze benadering slaat een brug tussen fenotypische screening en functionele read-outs, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in pipelines voor lead-identificatie.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt toxine-gemedieerde mechanismen van inflammasoomactivatie en immuunceldisfunctie.
- Operationele waarde: Maakt real-time kinetische analyse mogelijk van dosisafhankelijke cellulaire reacties op porievormende toxinen.
- Predictieve waarde: Ondersteunt target-derisking door toxine-blootstelling te koppelen aan calciumflux, membraanblebbing en cytokinerelays-dynamiek.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gevalideerde cellulaire systemen voor high-content screening van toxine-remmers of neutraliserende antilichamen.
- Kwantitatieve output: Meet real-time veranderingen in cytosolisch calcium en de opname van propidiumjodide als functionele read-outs.
- Schaalbaarheid: Compatibel met microinjectieplatforms voor lokale toediening van stimuli in multiwell-formaten.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Modelleert macrofaagreacties op Gram-positieve bacteriële toxines die relevant zijn voor sepsis en ontstekingsziekten.
- Translationele continuïteit: Verbindt in vitro toxine-geïnduceerde vesikelafscheiding met IL-1β-vrijgave en pyroptose-routes.
- Risicogebaseerde voortgang: Informeert de preklinische veiligheidsbeoordeling door drempelconcentraties voor cytotoxische versus sublytische effecten te kwantificeren.
Integratie van pipeline en workflow
De methode kan worden geïntegreerd in discovery-workflows, van targetvalidatie tot lead-optimalisatie, in het bijzonder voor immunomodulatoren die gericht zijn op toxine-gemedieerde ontsteking.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetesten van toxine-receptorinteracties en downstream inflammasoom-signalering.
- Screening: Levert assay-klare immuuncellen met real-time metrieken voor levensvatbaarheid en activatie.
- Analytics: Maakt vergelijking van toxinepotentie tussen varianten mogelijk met behulp van op EC50 gebaseerde lysis- en calciumfluxmetrieken.
- Translational Research: Sluit aan bij biomarkerstudies naar de afgifte van de IL-1-familie en membraanreparatiemechanismen.
- Enterprise Reuse: Vestigt een herbruikbaar platform voor het bestuderen van porievormende toxinen in immuun- en epitheliale celtypen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit in door toxines geïnduceerde celdoodpaden door middel van directe visualisatie.
- Operationele waarde: Standardiseert de toediening van toxines en live-cell imaging voor reproduceerbare kinetische profilering.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door de interactie met moleculaire targets te koppelen aan fenotypische resultaten.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gebaseerde prioritering van antitoxine-therapeutica mogelijk op basis van functionele cellulaire drempelwaarden.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in eiwitzuivering, micro-injectie en fluorescentiemicroscopie van levende cellen.
- Afhankelijk van toegang tot confocale systemen met verwarmde stages en geïntegreerde micro-injectoren.
- Maakt standaardisatie van toxine-activiteitseenheden over verschillende batches vereist voor vergelijkbaarheid tussen experimenten.
- Aanpassing aan primaire immuuncellen kan optimalisatie van labelings- en afleveringsparameters vereisen.
- Beperkt door de stabiliteit van het toxine, waardoor koudeketen-behandeling en validatie van de activiteit voorafgaand aan de beeldvorming noodzakelijk zijn.
