Name: Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: Leer hoe je immuunresponsen op streptolysine O visualiseert met live-celfluorescentiemicroscopie. Deze methode onthult de kinetiek van toxine-geïnduceerde veranderingen in immuuncellen en biedt inzicht in inflammosoomactivatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen graag Richard Rest bedanken voor de gulle gift van anthrolysin O, Michael Caparon voor de gulle gift van de SLO plasmide en Jonathon Franken voor technische ondersteuning. Dit werk werd gefinancierd door NIH subsidie ​​T32CA82084 (PAK), en R01AI072083 (RDS).

1. Zuivering van streptolysine O (SLO) <ol><li> Inoculeer 20 ml overnacht kweek van cellen die BL21 GOLD pBADgIII-SLOhis plasmide 9 in 0,5 L LB bouillon en voeg 500 pi 50 mg / ml ampicilline. Schudden bij 225 rpm cultuur bij 37 ° C totdat OD600 = 0,6, gewoonlijk ~ 1,5 uur. Centrifugeer 1 ml bacteriën (als T 0) bij 10.000 xg 5 min, los pellet in 140 ul 1x SDS-monsterbuffer / 1 OD en ultrasone trillingen ten einde afschuiving DNA voor eiwitten zuiverheid analyse. </li><li> Induceren bacteriën met de toevoeging van 5 ml 20% arabinose tot cultuur schudden bij 225 rpm bij kamertemperatuur gedurende 3 uur. Verzamel 1 ml van bacteriën, centrifugeren en los op in 1x SDS-monsterbuffer als hierboven voor T 3 tijdstip voor zuiverheid analyse. </li><li> Verzamel resterende bacteriën in 500 ml centrifuge fles draaien 12.000 xg gedurende 12 min bij 4 ° C (8.500 rpm Sorvall GS-3 rotor). Schenk de supernatant, store pellet bij -80 ° C overnacht of langer indien nodig. </li><li> Resuspendeer de frozen pellet op ijs in 10 ml Lyse / wasbuffer (50 mM NaH 2PO 4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, pH 8,0) aangevuld met 400 ui 25% Triton X-100, 100 ul 100 mg / ml lysozym, 50 pi 200 mM fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF). Breng de geresuspendeerde pellet in 50 ml Oak Ridge buis. </li><li> Sonificeer lysaat 5 keren gedurende 30 sec op ijs met 30 seconde. Spin gesonificeerd lysaat in Oak Ridge buis bij 39.000 xg gedurende 20 min bij 4 ° C (18.000 rpm Sorvall SS-34 rotor). </li><li> Terwijl het lysaat draait, was 1 ml Ni-NTA agarose met 10 ml Lyse / buffer en centrifugeren op 1200 rpm spoelen 5 min bij 4 ° C. (Alle verdere wasbeurten / eluties gebruiken centrifugeren onder deze omstandigheden). Aspireren wassen. </li><li> Toevoegen bacteriële supernatant van stap 1,5 tot Ni-NTA agarose, schud gedurende 2,5 uur bij 4 ° C. Spin te verzamelen supernatant. Combineer 30 pl supernatant met 10 μ 4x SDS-monsterbuffer en opslaan voor zuiverheidsanalyse. Was de korrels 4 keer in Lyse / Wasbuffer ence in Tris / zoutbuffer (50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 8,0). </li><li> Elueren 3 maal door 1 ml elutiebuffer (250 mM imidazool in Tris / zoutbuffer) en 5 pi 1 M dithiothreitol (DTT) aan bolletjes incuberen op ijs gedurende 10 min, het spinnen en het verzamelen van het supernatant. SLO is een redox-gevoelige eiwit en worden bewaard op ijs te allen tijde. Na aftrek zal het eiwit snel verliest haar activiteit indien verwarmd tot 37 ° C, zelfs gedurende een korte tijd. </li><li> 500 ul wassen polymyxine-geconjugeerd agarose in elutiebuffer, centrifugeren op 10.000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C en resuspendeer in 500 ul. Aan endotoxine afbreken Voeg 200 ul kralen aan elk elutie en schud 4 ° C gedurende 30 minuten. Spin bij 10.000 xg gedurende 1 min bij 4 ° C en sla het supernatant. Combineer 30 pi van elke elutie met 10 pi 4x SDS-monsterbuffer voor SDS-PAGE analyse. </li><li> Test de eluties van zuiverheid door SDS-PAGE. Kook monsters opgeslagen voor gel analyse bij 95 ° C gedurende 5 minuten en 10 pl belasting op een 10% gel. Stain gel met Coomassie te visualiseren eiwit (Figuur 2A). SLO is 69 kDa. Voer een Bradford assay voor eiwitconcentratie te bepalen (typisch opbrengst is 4 mg / ml voor de eerste twee eluties, maar kan per bacteriestam en plasmide gebruikt). </li><li> Test de hemolytische activiteit van elke elutie (zie hieronder). Pool eluties waar zuiverheid, concentratie en hemolytische activiteit bevredigend. Aliquot SLO in eenmalige aliquots (gewoonlijk 5-10 ul), invriezen op droog ijs en bij -80 ° C. </li></ol> 2. Hemolytic Assay <ol><li> Wassen schapen rode bloedcellen (RBC&#39;s) in RBC Assay buffer (0,3% bovine serum albumine (BSA), 2 mM CaCl2, 10 mM Hepes, pH 7,4), centrifugeren op 1200 rpm gedurende 5 min, en resuspendeer 2,5% RBCs in 10 ml RBC Assay buffer. </li><li> Voeg 10 ul assaybuffer RBC / well in 96-well V-bodem plaat op ijs. Serieel vul telkens elutie in tweevoud. Typische verdunning bereiken zijn 1:1.000 tot 1:512,000. Omvatten 3 wells zonder toxine en 3 met 10 wellspi 2% Triton X-100 de minimum-en maximum putten respectievelijk. </li><li> Afdekplaat en incubeer bij 37 ° C 30 min. Centrifugeer bij 1200 rpm gedurende 5 minuten. Breng 70 pl supernatant met een vlakke bodem met 96 putjes plaat. Lees beoordelingen over A 405. Een eenheid is de verdunning van toxine vereist voor 50% lysis van de erytrocyten. Toxine activiteit is 1 eenheid * verdunning factor/0.01 ml. </li></ol> 3. Cel Lytische Assay <ol><li> Oogst cellen, tellen, spin. Resuspendeer op 2x10 6 / ml in buffer R / B (RPMI met 2 mM CaCl2, 0,5% BSA) en 20 ug / ml propidiumjodide. Voeg 100 ul cellen een 96-well V-bodem plaat. </li><li> Serieel verdund tot een eindconcentratie SLO 2x in buffer R / B, 100 ul toxine of 100 ul buffer R / B aan cellen. Incubeer 5 min 37 ° C Typische eindconcentraties bereik van 2.000 U / ml tot 31,25 U / ml. </li><li> Draaien cellen op stromingscytometer en verzamelen gegevens filters voor fycoerytrine (PE). Een een-log shift staat voor tijdelijk gepermeabiliseerde cells terwijl een 3 log verschuiving geeft aan dode cellen 4. Berekenen de specifieke lysis van de cellen door het aftrekken het percentage dode cellen in de controle (% PI hoge CTL) uit de experimentele (% PI hoog exp) als volgt: specifieke lysis = (% PI hoge exp -% PI hoge CTL) / (100 -% PI hoge CTL) * 100 </li></ol> 4. Micropipet Levering van toxine op cellen in cultuur gerechten <ol><li> Een dag voor experiment plaat 2x10 5 macrofagen op collageen gecoate glazen bodem 35 mm schaal. </li><li> Zet microscoop en microinjector. Toestaan ​​verwarmd fase tijd opwarmen tot 37 ° C. De keuze van de microscoop hangt meestal af van wat er lokaal beschikbaar. De microscoop heeft een omgekeerde fase, een fase kunnen verwarmen gerechten tot 37 ° C, excitatie / emissie filter blokjes passend gekozen kleurstof, en de ruimte om fysiek de verbinding microinjector. Een Bertrand lensis nuttig voor micro-injectie, maar niet vereist. De computer een de microscoop moet voldoende geheugen te verzamelen en opslaan. </li><li> Label cellen gedurende 30 min met kleurstof bij 37 ° C. Afhankelijk van de assay kan worden uitgevoerd labeling met 5 pl fura2 uur in 1 ml PBS of 2 pi calceïne AM in 1 ml volledige media. Voor fura2 wordt excitatie / emissie verzameld 340/510 nm en 380/510 nm, en de verhouding van 340/380 signalen bepaalt calciumflux. Voor calceïne, excitatie / emissie is 495/515 nm, terwijl ethidiumhomodimeer is 525/620 nm en APC is 650/660 nm. Andere labels kunnen worden gekozen ook. </li><li> Was de cellen met PBS en in 1 ml RPMI aangevuld met 2 mM CaCl2. Monteer op microscoop. </li><li> Verdun toxine en dextran in water, en centrifuge bij 20.000 xg gedurende 10 min 4 ° C. Gewoonlijk wordt 1 pi SLO en 4 pi 10 mg / ml dextran-555 verdund in 6 pl water. Dextran of andere fluorescerende vloeistof fase molecule wordt gebruikt om te controleren of de femto-tip niet verstopt en injects wens. </li><li> Laad Femto-tip van achteren met 0,07 pi van verdunde toxine met een microloader. </li><li> Laad Femto-tip op microinjector. Stel de hoek van de injector, zodat de tip zal zitten boven het midden van de cellen met ruimte om te bewegen in alle richtingen. Schakel z-limiet. Injectie instellingen moeten worden geïnjecteerd 0,5 sec bij 120 psi met 20 psi tegendruk. Laat tip totdat het in het medium. </li><li> Met de Bertrand lens, midden de tip en volg de tip als het dichter bij de cellen verlaagd. Zodra je verliest focus, terug te schakelen naar de normale optica. De naald schaduw moet duidelijk zijn in het veld. Focus boven de cellen en laat de naald totdat het in focus is. Focus terug op de cellen voorzichtig brengen de naald naast een cel. Stel de z-grens voor injectie. Begin beeldvorming, verhuizen tip in de gewenste positie, injecteren om toxine vrij op het gewenste tijdstip. Zet de naald, verhuizen naar een nieuwe regio van cellen en injecteren. Verplaats de naald naar de uitgangspositie om eventuele ongewenste voorkomentoxine lekkage van de naald. </li></ol>

<ol><li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+proteins+into+living+cells+by+reversible+membrane+permeabilization+with+streptolysin-O%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 3185-3190 (2001).</li>
<li>Walev, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potassium+regulates+IL-1+beta+processing+via+calcium-independent+phospholipase+A2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Potassium regulates IL-1 beta processing via calcium-independent phospholipase A2.</a> J. Immunol. 164, 5120-5124 (2000).</li>
<li>Scolding, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicular+removal+by+oligodendrocytes+of+membrane+attack+complexes+formed+by+activated+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vesicular removal by oligodendrocytes of membrane attack complexes formed by activated complement.</a> Nature. 339, 620-622 (1989).</li>
<li>Keyel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptolysin+O+clearance+through+sequestration+into+blebs+that+bud+passively+from+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane.</a> J. Cell. Sci. 124, 2414-2423 (2011).</li>
<li>MacKenzie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+secretion+of+interleukin-1beta+by+microvesicle+shedding%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Rapid secretion of interleukin-1beta by microvesicle shedding.</a> Immunity. 15, 825-835 (2001).</li>
<li>Qu, Y., Franchi, L., Nunez, G., Dubyak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonclassical+IL-1+beta+secretion+stimulated+by+P2X7+receptors+is+dependent+on+inflammasome+activation+and+correlated+with+exosome+release+in+murine+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Nonclassical IL-1 beta secretion stimulated by P2X7 receptors is dependent on inflammasome activation and correlated with exosome release in murine macrophages.</a> J. Immunol. 179, 1913-1925 (2007).</li>
<li>Andrei, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipases+C+and+A2+control+lysosome-mediated+IL-1+beta+secretion%3A+Implications+for+inflammatory+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Phospholipases C and A2 control lysosome-mediated IL-1 beta secretion: Implications for inflammatory processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 9745-9750 (2004).</li>
<li>Franchi, L., Eigenbrod, T., Munoz-Planillo, R., Nunez, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inflammasome%3A+a+caspase-1-activation+platform+that+regulates+immune+responses+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The inflammasome: a caspase-1-activation platform that regulates immune responses and disease pathogenesis.</a> Nat. Immunol. 10, 241-247 (2009).</li>
<li>Magassa, N., Chandrasekaran, S., Caparon, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streptococcus+pyogenes+cytolysin-mediated+translocation+does+not+require+pore+formation+by+streptolysin+O%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Streptococcus pyogenes cytolysin-mediated translocation does not require pore formation by streptolysin O.</a> EMBO Rep. 11, 400-405 (2010).</li>
<li>Pinkney, M., Beachey, E., Kehoe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+thiol-activated+toxin+streptolysin+O+does+not+require+a+thiol+group+for+cytolytic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The thiol-activated toxin streptolysin O does not require a thiol group for cytolytic activity.</a> Infect. Immun. 57, 2553-2558 (1989).</li>
<li>Watkins, S. C., Salter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+between+immune+cells+mediated+by+tunneling+nanotubules%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules.</a> Immunity. 23, 309-318 (2005).</li>
<li>McNeil, P. L., Vogel, S. S., Miyake, K., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patching+plasma+membrane+disruptions+with+cytoplasmic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Patching plasma membrane disruptions with cytoplasmic membrane.</a> J. Cell. Sci. 113, 1891-1902 (2000).</li>
<li>Shannon, J. G., Ross, C. L., Koehler, T. M., Rest, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+anthrolysin+O%2C+the+Bacillus+anthracis+cholesterol-dependent+cytolysin%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Characterization of anthrolysin O, the Bacillus anthracis cholesterol-dependent cytolysin.</a> Infect. Immun. 71, 3183-3189 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De hier beschreven technieken toe het onderzoek van de reacties van immuuncellen bacteriële toxinen. De belangrijkste stap is de behandeling en dosering van de toxine. Toxineactiviteit kunnen zeer variabel, zelfs bij verschillende hoeveelheden van hetzelfde preparaat door zijn broosheid. Dit vereist zowel het testen van elk aliquot van toxine tegen een referentie-cellijn of RBC&#39;s of met behulp van toxine hellingen. Toxine gradiënten, zoals die door micropipet, zodat het volledige spectrum van toxine-geïnduceerde act...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Ni-NTA agarose </td><td> Qiagen </td><td> 30210 </td><td></td></tr><tr><td> polymyxine-agarose </td><td> Sigma </td><td> P1411-5ML </td><td></td></tr><tr><td> Zeba ontzouten Spin col </td><td> Visser </td><td> PI-89891 </td><td></td></tr><tr><td> schapen RBC </td><td> Visser </td><td> 50-415-688 </td><td></td></tr><tr><td> pBADgIII-SLO </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> zie ref 9 </td></tr><tr><td> Cy5 monoreactive kleurstof </td><td> GE Healthcare </td><td> PA25001 </td><td></td></tr><tr><td> Fura2-AM </td><td> Life Technologies </td><td> F1221 </td><td></td></tr><tr><td> Calceïne AM / Ethidium homodimeer </td><td> Life Technologies </td><td> L3224 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD11c-APC </td><td> BD Biosciences </td><td> 550261 </td><td></td></tr><tr><td> collageen gecoate glazen bodem schaal </td><td> Mattek </td><td> P35GCol-1.5-10-C </td><td></td></tr><tr><td> Femto-tip II </td><td> Visser </td><td> E5242957000 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader </td><td> Visser </td><td> E5242956003 </td><td></td></tr><tr><td> dextran Alexa 555 </td><td> Life Technologies </td><td> D34679 </td><td></td></tr><tr><td> Injectman NI 2 </td><td> Eppendorf </td><td> 920000029 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet </td><td> Eppendorf </td><td> 5247 000.013 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 1. Lijst en de bron van specifieke reagentia en ingsment nodig. Specifieke apparatuur en reagentia die in dit protocol, samen met bedrijfs-en catalogusnummer zijn opgenomen. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td> Buffer </td><td> Samenstelling </td><td> Stap Gebruikt </td></tr><tr><td> Lyse / Wash </td><td> 50 mM NaH 2PO 4 300 mM NaCl 10 mM imidazool, pH 8,0 </td><td> 1,4 </td></tr><tr><td> Tris / zout </td><td> 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl </td><td> 1,7 </td></tr><tr><td> Elutiebuffer </td><td> 50 mM Tris, pH 8,0 300 mM NaCl 250 mM imidazool </td><td> 1,8 </td></tr><tr><td> RBC Assay buffer </td><td> 0,3% BSA 2 mM CaCl2 10 mM HEPES, pH 7,4 </td><td> 2,1 </td></tr><tr><td> buffer R / B </td><td> RPMI celkweekmedium 2 mM CaCl2 0,5% BSA </td><td&gt; 3.1 </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabel 2. Lijst van buffers die in dit protocol. De gebruikte buffers, hun samenstelling en de eerste stap waarin ze worden gebruikt in de genoemde protocol. </td></tr></tbody></table>

visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met live cell fluorescentie microscopie

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacteriële toxinen binden aan cholesterol in membranen, vorming van poriën waarmee lekkage van cellulaire inhoud en instroom van materialen uit de externe omgeving. De cel kan herstellen van deze belediging, actief membraan herstelprocessen heeft, of anders sterven, afhankelijk van de hoeveelheid toxine blootstelling en celtype 1. Bovendien induceren deze toxinen sterke ontstekingsreacties in geïnfecteerde gastheren door activering van immuuncellen, zoals macrofagen, die een array van pro-inflammatoire cytokines 2 produceren. Veel Grampositieve bacteriën produceren toxinen die cholesterol binding is aangetoond dat hun virulentie dragen door grotendeels ongekarakteriseerde mechanismen. Morfologische veranderingen in het plasmamembraan van cellen blootgesteld aan deze toxinen zijn onder opslag in cholesterol verrijkte oppervlaksuitsteeksels, die worden uitgescheiden in de extracellulaire ruimte, wat suggereert een intrinsieke cellulaire verdedigingmechanisme 3,4. Dit proces treedt op in alle cellen in afwezigheid van metabolische activiteit en kan worden gevisualiseerd met EM na chemische fixatie 4. In immune cellen zoals macrofagen die ontsteking bemiddelen als reactie op toxine blootstelling worden geïnduceerd membraanblaasjes voorgesteld cytokines van de IL-1 familie bevatten en kunnen verantwoordelijk zijn voor zowel vergieten toxine en verspreiding van deze pro-inflammatoire cytokines 5,6,7. Een koppeling tussen IL-1β afgifte en een specifiek type van celdood, is genoemd pyroptosis voorgesteld, aangezien beide caspase-1 afhankelijke processen 8. Te sorteren op de complexiteit van deze macrofagen reactie, die toxine binden, vergieten van membraan blaasjes, cytokine-afgifte, en mogelijk celdood omvat, hebben we etikettering technieken en fluorescentie microscopie methoden die het mogelijk maken voor real-time visualisatie van toxine-cel interacties, met inbegrip van metingen van disfunctie en dood (figuur 1). Gebruikenvan live cell imaging is nodig als gevolg van beperkingen in de andere technieken. Biochemische benaderingen niet kan oplossen die optreden bij de individuele cellen, terwijl flowcytometrie niet bieden een hoge resolutie, real-time visualisatie van de individuele cellen. De hier beschreven methoden kunnen worden toegepast op kinetische analyse van geïnduceerd door andere stimuli ingewikkelde fenotypische veranderingen in cellen.

Gewoonlijk 10 7 -10 8 U / ml SLO kan worden verkregen met een eiwitconcentratie van 4 mg / ml. De hoeveelheid toxine nodig cellysis verschilt per celtype, maar bedraagt ​​gewoonlijk 125 tot 500 U / ml SLO (Figuur 2B). Celtypes zoals macrofagen kunnen veel weerstand (4000 U / ml) terwijl anderen (T-cellijnen) gevoeliger. Deze gevoeligheden komen overeen met in de handel verkrijgbare SLO. Toxineactiviteit neemt ongeveer 2-voudig met elk vriesdooien, zodat hemolytische assays met iede...

Werkwijzen voor het zuiveren van cholesterol binding toxine streptolysine O van recombinant<em&gt; E. coli</em&gt; En visualisatie van toxine te binden aan eukaryote cellen leven worden beschreven. Gelokaliseerde levering van toxine veroorzaakt een snelle en complexe veranderingen in gerichte cellen onthullen nieuwe aspecten van toxine biologie.

Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie

Bacteriële toxines binden aan cholesterol in membranen, waarbij poriën worden gevormd die lekken van cellulaire inhoud en instroom van materialen vanuit de externe ...

Het doel van deze procedure is om de respons van immuuncellen op bacteriële toxines te visualiseren. Eerst wordt het toxine tot expressie gebracht in en gezuiverd uit BL 21 gold cellen. Zodra de activiteit en concentratie van het toxine zijn bevestigd, wordt het toxine toegediend aan immuuncellen.Er wordt gebruikgemaakt van een micro-injector en live-cell microscopie met hoge snelheid. Analyse van de resulterende beelden onthult de real-time kinetiek van immuuncelresponsen op de toxine. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de immunologie, zoals het mechanisme van inflammasoomactivatie.Hoewel deze methode inzicht kan geven in immuuncelresponsen gemedieerd door toxinen, kan ze ook worden toegepast op andere stimuli, waaronder chemotactische attractoren. We kregen het idee voor deze methode tijdens het bestuderen van de interactie van bacteriën met gecultiveerde immuuncellen, waarbij we zeer variabele interacties tussen de bacteriën en de immuuncellen observeerden. Begin de zuivering van strep lysin O of SLO met een cultuur van BL 21 gold-cellen die PAG three SLO bevatten.Kweek het plasmid tot een OD van ongeveer 0,6. Om de eiwitexpressie te induceren, voegt u vijf milliliter 20% OSes toe aan de cultuur en schudt u deze 3 uur lang bij 225 RPM op kamertemperatuur. Draag de bacteriën vervolgens over naar een centrifugefles van 500 milliliter.Centrifuge de kweek vervolgens 12 minuten bij 12,000 ×g en 4 °C. Decanteer na het centrifugeren het supernatant en bewaar het pellet bij -80 °C gedurende de nacht of langer indien nodig. Om het tot expressie gebrachte SLO te zuiveren, voegt u 10 mL lyse-wasbuffer toe aan het bevroren pellet, aangevuld met Triton X 100, lysozym en fenylmethylsulfonylfluoride, en pipetteert u dit ongeveer 15 minuten op en neer.Om te resuspenderen, wordt het pellet gesuspendeerd terwijl het monster op ijs wordt bewaard. Draag het geresuspendeerde pellet over naar een ronde polypropylene Oak Ridge-buis van 50 milliliter. Soniceren het lysaat met een probe-sonicator bij 40% output vijf keer gedurende 30 seconden per keer, met intervallen van 30 seconden en tussentijds 30 seconden op ijs.Centrifuge vervolgens het gesoniceerde lysaat bij 39.000 ×g gedurende 20 minuten bij 4 °C. Voeg na het centrifugeren het bacteriële supernatant toe aan één milliliter gewassen nikkel-NTA-beads. Incubeer de nikkel-NTA-beads en het lysaat samen gedurende 2,5 uur bij 4 °C onder zachte schudding na de incubatie.Pellet de kraaltjes door te centrifugeren bij 400 ×g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Let op dat alle verdere wasstappen en de elutie worden uitgevoerd met deze centrifugeringsinstellingen, tenzij anders vermeld. Na de centrifugering.Combineer 30 µL van het supernatant met 10 µL 4x SDS-monsterbuffer in een microcentrifugebuisje en bewaar dit op ijs voor zuiverheidsanalyse. Gooi vervolgens de rest van het supernatant weg en was de beads vier keer in lice wasbuffer en één keer in zoutbuffer, waarbij na elke wasbeurt wordt gecentrifugeerd. Zorg er vanaf dit punt op dat het monster te allen tijde op ijs bewaard blijft.SLO is een zeer redoxgevoelig eiwit en zal snel zijn activiteit verliezen bij een temperatuur van 37 °C, zelfs gedurende een korte periode. Voeg om het SLO-eiwit te elueren 1 mL elutiebuffer en 5 µL 1 M DTT toe aan de beads en incubeer dit 10 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens en verzamel het supernatant in een centrifugebuis die is gelabeld met het elutienummer.Herhaal dit proces drie keer en voeg vervolgens, om endotoxinen uit het SLO-eiwit te verwijderen, 200 µL gewassen poly mixing geconjugeerde agro beads, gesuspendeerd in res salt buffer, toe aan het monster en schud dit 30 minuten bij 4 °C. Centrifugeer vervolgens 1 minuut bij 10,000 ×g bij 4 °C. Verzamel na het centrifugeren het supernatant in nieuwe, gelabelde microcentrifugebuisjes.Combineer 30 µL van elk eluaat met 10 µL SDS-monsterbuffer (vier keer geconcentreerd). Bewaar de SLO-oplossingen op ijs voor SDS-PAGE-analyse. Bepaal de proteïneconcentraties en de hemolytische activiteit; indien bevredigend, verdeel de SLOE in aliquots van 5 tot 10 µL, vries deze vervolgens in op droogijs en bewaar ze bij -80 °C.Bepaal vervolgens de specifieke lysis. Reese. Suspendeer de te testen cellen in twee concentraties. Centreer de zes cellen per milliliter in buffer RB met 20 micrograms per milliliter.Propidiumjodide. Hier worden T 27 A-cellen getest. Voeg in afzonderlijke microcentrifugebuisjes 100 µL cellen toe aan elke put van een 96-wells V-bodemplaat.Verdun SLO via seriële verdunning tot twee keer de uiteindelijke concentratie in buffer rb. Voeg vervolgens ofwel 100 µL toxine of 100 µL buffer RB toe aan de cellen en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 °C. Typische uiteindelijke concentraties variëren van 2000 units per milliliter tot 31.25 units per milliliter.Analyseer de cellen met een flowcytometer en verzamel gegevens met filters voor fi, cethrin of pe. Een verschuiving van één log staat voor tijdelijk permeabele cellen, terwijl een verschuiving van drie log duidt op dode cellen. Bereken de specifieke lysis van de cellen door het percentage dode cellen in de controle af te trekken van dat in de experimentele groep met behulp van de hier getoonde vergelijking; één dag voor de experimenten worden de five macrophages in tweevoud geplaatst op met collageen gecoat glas.Schalen van 35 millimeter met een platte bodem. De microscoop die voor de toediening van het toxine wordt gebruikt, moet zijn uitgerust met een omgekeerde tafel, een verwarmde tafel, de juiste excitatie- en emissiefilterkubussen en, indien beschikbaar, een Bertrand-lens. Het moeilijkste deel van deze procedure is het intact naar de cellen brengen van de naald.Om succes te garanderen, gebruiken we een Bertrandlens, die normaal gesproken voor uitlijning wordt gebruikt, om de naald te visualiseren terwijl we deze door de brandvlakken bewegen. De microscoop moet zijn aangesloten op een micro-injector en moet worden aangestuurd door een computer met voldoende geheugen om gegevens te verzamelen en op te slaan; schakel de microscoop en de micro-injector in en geef de verwarmde tafel de tijd om op te warmen tot 37 °C terwijl u wacht tot de tafel is opgewarmd. Label de cellen gedurende 30 minuten met kleurstof bij 37 °C.Afhankelijk van de assay kan de labeling worden uitgevoerd met 5 µL, 4 of 2 µM in 1 mL HBSS of 2 µM calcium in 1 mL volledig medium; hier wordt 4 of 2 gebruikt. Verwijder het celmedium en was de cellen eenmaal met PBS. Aspireer de PBS en vervang deze door 1 mL RPMI aangevuld met 2 mM calciumchloride.Plaats de schaal op de microscoop, breng de cellen in focus met brightfield en stel de focus vervolgens iets boven de cellen in. Meng daarna één µL SLO-toxine met vier µL DEXTRA 5 55 (10 mg/mL) en zes µL water. Centrifugeer dit vervolgens 10 minuten bij 20.000 ×g en 4 °C.Dextran wordt gebruikt om te verifiëren dat de femto-tip niet verstopt is. Gebruik een micro-loader om twee microliters verdunde toxine vanaf de achterzijde in de femto-tip te laden. Plaats de femto-tip op de micro-injector.Pas vervolgens de hoek van de injector aan zodat de tip boven het centrum van de cellen staat, met voldoende ruimte om in alle richtingen te bewegen. Wis de vorige instellingen voor de Z-limiet, die bepaalt hoe ver de tip van de micro-injector naar beneden kan gaan. Stel de micro-injector in om gedurende 0,5 seconden te injecteren bij 120 PSI met een tegendruk van 20 PSI. Laat de tip vervolgens zakken tot deze het medium binnendringt.Gebruik de Bertrand-lens. Centreer de punt en volg de punt terwijl deze dichter naar de cellen wordt bewogen. Zodra de naald buiten focus raakt, schakelt u terug naar de normale optiek.De schaduw van de naald moet zichtbaar zijn in het gezichtsveld. Stel scherp boven de cellen en laat de naald zakken tot deze scherp wordt gesteld. Breng vervolgens de cellen in focus en positioneer de naald voorzichtig naast een cel.Nadat de Z-limiet voor de injectie is ingesteld, start u met de beeldvorming en injecteert u de toxine. Til vervolgens de naald op en verplaats deze naar een nieuw gebied met cellen. Injecteer extra toxine en ga na de injectie door met de beeldvorming.Verplaats de naald naar de home-positie om ongewenste lekkage van toxine uit de naald te voorkomen met de methode die in deze video wordt beschreven, 10⁷ tot 10⁸ units per milliliter. SLO wordt doorgaans verkregen met een eiwitconcentratie van 4 mg/mL. Deze SDS-PAGE-gel toont bacteriële monsters voor en na toxine-inductie, evenals na zuivering, en elk van de drie elutiefracties; Coomassie-blauwkleuring onthult dat het geïnduceerde SLO succesvol is gezuiverd.SLO is de band bij 69 kilodaltons om de hoeveelheid toxine te bepalen die nodig is voor lyse van T 27 A- of D-twee cellen. Cellen werden vijf minuten lang blootgesteld aan verschillende concentraties SLO bij 37 °C in aanwezigheid van propidiumjodide en vervolgens geanalyseerd via flowcytometrie. De specifieke lyse werd bepaald zoals hier wordt gedemonstreerd.250 units per milliliter. SLO geeft 50% lysis van zowel T 27 A- als D-twee cellen. Een sublytische dosis toxine van 10% lysis zou 62,5 units per milliliter zijn.Deze waarden zijn belangrijk als referentie voor de toxineactiviteit om celsterfte na blootstelling aan het toxine te beoordelen. Humane dermale fibroblasten werden geïncubeerd met calcium en atherium-homodimeer met behulp van een live-dead kit van Life Technologies. Na lokale blootstelling aan het bacteriële toxine, anthro lysine O. In deze afbeelding wordt calcium in het groen weergegeven en atheriumbromide in rode regio's dicht bij het microbioom, wat celsterfte aantoont gekenmerkt door calciumverlies en opname van athe-homodimeer, terwijl regio's verder van de punt verwijderd geen schade vertonen.Micro-aflevering van de toxine maakt ook het onderzoek van real-time gebeurtenissen mogelijk, zoals calciumflux. Deze menselijke dcs geladen met 4:02 AM werden blootgesteld aan SLO bij een constante stroomsnelheid met gelijktijdige live-imaging; de verschuiving van groen naar blauw is zichtbaar. Pseudokleur geeft een toename van de cytosolische calciumgehaltes aan.SLO induceert een snelle toename van cytosolisch calcium, die zich door het gebied van de schaal verspreidt als gevolg van de gelokaliseerde toediening. Echter, alleen cellen die zich dicht bij de tip van de micro-injector bevinden, komen in contact met en reageren op de toxine. Dit demonstreert zowel de cellulaire reactie op de toxine als het ruimtelijk beperkte gebied van de toxinetoediening om gebeurtenissen in de zdi-dimensie te onderscheiden.Micro-aflevering werd gecombineerd met hogesnelheids 3D-confocale microscopie. Deze reeks beelden toont dendritische cellen na injectie van toxine. Deze waren vooraf geïncubeerd met anti-CD11c gekoppeld aan een PC, weergegeven in het groen, om het plasmamembraan te labelen.Zoals hier te zien is, worden microvesikels vrijgegeven na de toediening van het toxine. Als onderdeel van het cellulaire herstelproces concentreren toxinemoleculen zich op blebs, die worden afgestoten om het toxine te elimineren. Zodra men dit beheerst, kan de microscopie in 45 minuten worden voltooid.Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de toxine koud moet blijven voordat deze met de cellen wordt gemengd en dat de hemolytische activiteit moet worden getest. Goed. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u de real-time kinetiek van immuuncelresponsen op bacteriële toxines kunt meten met behulp van live-cell microscopie.

visualization-bacterial-toxin-induced-responses-using-live-cell

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Hier laten we zien de protocollen voor het uitvoeren van single-molecule fluorescentie microscopie op levende bacteriële cellen in staat te stellen functionele moleculaire complexen worden opgespoord, gevolgd en gekwantificeerd.

Visualiseren Single moleculaire complexen In Vivo Geavanceerde fluorescentiemicroscopie

Source: Brzozowski, R. S. et al. Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates live-cell fluorescence microscopy to visualize real-time morphological changes in bacteria. It outlines the steps involved in imaging, time-lapse acquisition, and deconvolution to obtain high-resolution images in real time.

Imaging Morphological Changes in Bacteria Using Live-Cell Fluorescence Microscopy

Source: Chetrit, D., et al. Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the preparation and imaging of fluorescently labeled pathogenic bacteria. Agarose pads are first prepared and positioned within an adhesive frame. A suspension of genetically modified bacteria expressing a fluorescent protein is applied to the pad to immobilize the cells. The...

Sample Preparation and Imaging of Fluorescently Labeled Bacteria

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Effectortranslocatie naar gastcellen via een type III secretiesysteem is een veelvoorkomende virulentiestrategie bij gramnegatieve bacteriën. Een op beta-lactamase gebaseerde effectorfusie-assay voor kwantitatieve analyse van translocatie werd toegepast. In Yersinia geïnfecteerde cellen wordt de conversie van een FRET-reporter door de beta-lactamase gemonitord met behulp van laserscanemicroscopie.

Analyse van<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector Translocatie in gastheercellen met behulp van beta-lactamase Effector Fusions

Inzicht in de functie van essentiële processen bij bacteriën is uitdagend. Fluorescentie microscopie met doelgroepen gerichte kleurstoffen kan belangrijke inzicht verwerven in de cel van de microbiële groei en celcyclus progressie. Hier, wordt Agrobacterium tumefaciens gebruikt als een model bacterie Markeer methoden voor levende cellen imaging voor karakterisering van essentiële processen.

Cel fluorescentie microscopie als waarnemer van essentiële processen tijdens microbiële celgroei bij te wonen

Fluorescerende eiwit gebaseerde benaderingen te controleren effectoren uitgescheiden door bacteriën in de cellen van de gastheer zijn uitdagend. Dit is te wijten aan de incompatibiliteit tussen fluorescente proteïnen en het type III secretie systeem. Hier, wordt een geoptimaliseerde split superfolder GFP-systeem gebruikt voor visualisatie van effectoren uitgescheiden door bacteriën in de fabriek van de gastheercel.

Split groen Fluorescent proteïne systeem te visualiseren effectoren verlost van bacteriën tijdens de infectie

Hier wordt beschreven, is een methode voor het analyseren van bacteriële genexpressie in dierlijke weefsels op een cellulair niveau. Deze methode biedt een bron voor de studie van de fenotypische verscheidenheid die zich voordoen binnen een bacteriële bevolking in antwoord op het milieu weefsel tijdens een infectie.

Een fluorescentie gebaseerde methode om te studeren van bacteriële genregulatie in geïnfecteerde weefsels

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding om de eiwit subcellulaire lokalisatie dynamiek te onderzoeken en morfologische veranderingen te monitoren met behulp van hoge-resolutie fluorescentiemicroscopie in Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus.

Live-cel fluorescentiemicroscopie om Subcellulaire eiwit lokalisatie en celmorfologie veranderingen in bacteriën te onderzoeken

Fluorescerende gelabelde antibiotica zijn krachtige instrumenten die kunnen worden gebruikt om meerdere aspecten van antimicrobiële resistentie te bestuderen. Dit artikel beschrijft de voorbereiding van fluorescerende gelabelde antibiotica en hun toepassing op het bestuderen van antibioticaresistentie bij bacteriën. Sondes kunnen worden gebruikt om mechanismen van bacteriële resistentie (bijvoorbeeld efflux) te bestuderen door spectrofotometrie, stroomcytometrie en microscopie.

Visualisatie van bacteriële resistentie met behulp van fluorescerende antibiotica sondes

Dit live-bacteriële celbeeldvormingsprotocol maakt visualisatie mogelijk van interacties tussen meerdere bacteriële soorten op het eencellige niveau in de tijd. Time-lapse imaging maakt het mogelijk om elke bacteriesoort in monocultuur of cocultuur te observeren om interspecies interacties te ondervragen in bacteriële gemeenschappen met meerdere soorten, waaronder individuele celmotiliteit en levensvatbaarheid.

Kinetische visualisatie van single-cell interspecies bacteriële interacties

Leer hoe je immuunresponsen op streptolysine O visualiseert met live-celfluorescentiemicroscopie. Deze methode onthult de kinetiek van toxine-geïnduceerde veranderingen in immuuncellen en biedt inzicht in inflammosoomactivatie.

Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie

Meer video's verkennen