Visualisatie van bacteriële toxine geïnduceerde responsen met Live Cell Fluorescentie Microscopie

Het doel van deze procedure is om de reacties van immuuncellen op bacteriële toxinen te visualiseren. Eerst wordt het toxine geëxpresseerd in en gezuiverd uit BL 21 goud cellen. Zodra de activiteit en concentratie van het toxine zijn bevestigd, wordt het toxine aan immuuncellen geleverd.

Met behulp van een micro-injector en hogesnelheids-live celmicroscopie wordt uitgevoerd. Analyse van de resulterende beelden onthult de realtime kinetica van immuuncelreacties op het toxine. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunologie, zoals het mechanisme van inflammasoomactivering.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in door toxine gemedieerde immuunreacties, kan deze ook worden toegepast op andere stimuli, inclusief chemotactische tractors. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode bij het bestuderen van de interactie van bacteriën met gekweekte immuuncellen en observeerden zeer variabele interacties tussen bacteriën en de immuuncellen. Begin met de zuivering van strep lysine O of SLO met een cultuur van BL 21 goud cellen die PAG drie SLO bevatten.

Zijn plasmide groeide tot een OD van ongeveer 0,6. Om eiwitexpressie te induceren, voeg je vijf milliliter 20% van OSes toe aan de cultuur en schud je drie uur lang bij 2 25 RPM op kamertemperatuur. Draag vervolgens de bacteriën over naar een 500 milliliter centrifugefles.

Draai vervolgens de cultuur gedurende 12 minuten bij 12.000 keer G bij vier graden Celsius en decanteer na het draaien. Bewaar de supernatant bij min 80 graden Celsius voor een nacht of langer indien nodig. Om het geëxpresseerde SLO te zuiveren, voeg je 10 milliliter ly-wasbuffer toe, aangevuld met Triton X 100 lysozym en fenylmethylsulfonylfluoride, aan de bevroren pellet. Pipetteer omhoog en omlaag gedurende ongeveer 15 minuten.

Om te resuspenderen, houdt u de pellet in beweging terwijl u het monster op ijs houdt. Breng de gesuspendeerde pellet over naar een 50 milliliter rondbodempolypropyleenbuis van Oak Ridge. Soniceer het lysate met behulp van een sonde-sonicator gedurende 30 seconden, vijf keer, met tussenpozen van 30 seconden en 30 seconden op ijs tussendoor.

Draai vervolgens het sonicate-lysaat gedurende 20 minuten bij 39.000 keer G bij vier graden Celsius. Voeg na het draaien de bacteriënsupernatant toe aan één milliliter gewassen nikkel NTA aros. Incubeer de nikkel NTA aros en het lysate gedurende 2,5 uur bij vier graden Celsius met zacht schudden Na de incubatie.

Pellet de kralen door te draaien bij 400 keer G gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Merk op dat alle verdere wasbeurten en elutie worden uitgevoerd met deze centrifugatie-instellingen en minder, tenzij anders vermeld. Na de centrifugatie.

Combineer 30 microliter van de supernatant met 10 microliter vier keer SDS-monsterbuffer in een microcentrifugebuis en bewaar het op ijs voor zuiverheidsanalyse. Gooi vervolgens de rest van het supine-agens weg en was de kralen vier keer in lice-wasbuffer. En eenmaal geïnteresseerd in het zoutbuffer centrifugeren tussen elke wasbeurt Vanaf dit punt dient u ervoor te zorgen dat het monster altijd op ijs wordt gehouden.

SLO is een zeer redoxgevoelig eiwit en het zal snel zijn activiteit verliezen als het opwarmt tot 37 graden Celsius, zelfs voor een korte periode. Om het SLO-eiwit te elueren, voeg je een milliliter elutiebuffer en vijf microliter één molair DTT toe aan de kralen, incubeer op ijs gedurende 10 minuten. Centrifugeer vervolgens en verzamel het supernatant in een fugebuis gelabeld met het eluciaannummer.

Herhaal dit proces drie keer en voeg vervolgens 200 microliter gewassen polymixconjugaat-agrokralen toe aan het monster, gesuspendeerd in res-zoutbuffer, om endotoxine uit het SLO-eiwit te verwijderen. Schud gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Draai vervolgens bij 10.000 keer G gedurende één minuut bij vier graden Celsius. Verzamel na het draaien het supernatant in nieuwe gelabelde microcentrifugebuizen.

Combineer 30 microliter van elke elutie met 10 microliter, vier keer SDS-monsterbuffer. Voor SDS-pagina-analyse, bewaar de SLO-oplossingen op ijs. Bepaal de eiwitconcentraties en hemolytische activiteit als deze bevredigend zijn, trek de SLO in vijf tot tien microliter-kwartjes, bevries dan op droog ijs en bewaar bij min 80 graden Celsius.

Bepaal vervolgens de specifieke lysis. Reese. Suspendeer de te testen cellen bij twee keer. Centreer de zes cellen per milliliter in buffer RB met 20 microgram per milliliter.

Propidiumjodide. Hier worden T 27 A-cellen getest. Voeg 100 microliter cellen toe aan elke put van een 96-wels V-bodemplaat in afzonderlijke microcentrifugebuizen.

Verdun SLO seriëel tot twee keer de uiteindelijke concentratie in buffer rb. Voeg vervolgens 100 microliter toxine of 100 microliter buffer RB toe aan de cellen en incubeer gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius. Typische uiteindelijke concentraties variëren van 2000 eenheden per milliliter tot 31,25 eenheden per milliliter.

Voer cellen uit op een flowcytometer en verzamel gegevens met filters voor fi, cethrin of pe. Een verschuiving van één log vertegenwoordigt tijdelijk permeabele cellen, terwijl een verschuiving van drie log dode cellen aangeeft. Bereken de specifieke lysis van de cellen door het percentage dode cellen in de controle af te trekken van de experimentele met behulp van de hier getoonde vergelijking een dag voor de experimenten plaat, twee keer het centrum van de vijf macrofagen op met collageen bedekte glas.

Onderkant 35 millimeter schotels. De microscoop die wordt gebruikt voor toxinelevering moet zijn uitgerust met een omgekeerde stage, een verwarmde stage, de juiste excitatie-emissiefilterkubussen en, indien beschikbaar, een Bertrand-lens. Het moeilijkste deel van deze procedure is om de naald intact naar de cellen te brengen.

Om succes te garanderen, gebruiken we een Bertrand-