Name: Mechanische stimulatie van Chondrocyten-agarose Hydrogelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-27T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: Leer dynamische mechanische compressiebelasting toepassen op chondrocyten in agarose hydrogels. Deze methode evalueert collageen- en proteoglycaansynthese voor weefseltechnologisch onderzoek naar kraakbeenherstel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Isolatie van Primaire articulaire chondrocyten Oogst 10 tot 15 volledige dikte kraakbeen schijfjes van de articulaire oppervlakken van dieren gewrichten (bijvoorbeeld de metacarpale-gewricht van een volgroeid skelet koeien verkregen uit een lokale Abbatoir). <ol><li> Plaats kraakbeen segmenten in een 100 mm petrischaal en Incubate in 20 ml 0,5% protease in Ham&#39;s F-12 (w / v) gedurende 2 uur bij 37 ° C. Driemaal spoelen in Ham&#39;s F-12 kweekmedium en geïncubeerd met 20 ml 0,15% A Collagenase in Ham&#39;s F-12 kweekmedium nacht bij 37 ° C. </li><li> Filter de celsuspensie door een 200 mesh zeef filter in een schone schaal. Was het filter met 5 ml Ham&#39;s F-12 en voeg aan het gerecht. Breng de celsuspensie in een 50 ml conische buis. Was de petrischaal met 10 ml Ham&#39;s F-12 en aan de conische buis. </li><li> Centrifugeer de buis 600-800 RCF gedurende 6-8 min bij kamertemperatuur. </li><li> Zuig het supernatant, zodat niet om e storene celpellet en resuspendeer in 40 ml Ham&#39;s F-12 kweekmedium. </li><li> Centrifugeer de buis bij 6-800 RCF gedurende 6-8 minuten. </li><li> Herhaal stappen 1.4 en 1.5 tweemaal voor een totaal van 3 keer. Voorafgaand aan het centrifugeren voor de derde keer, resuspendeer de pellet via agitatie en het verkrijgen van een 500 pi aliquot voor cel tellen. </li><li> Tellen levensvatbare cellen met behulp van de trypan blauw uitsluiting werkwijze 9 met een hemacytometer en een omgekeerde lichtmicroscoop. </li><li> Zuig het supernatant en de pellet resuspendeer in een volume van Ham&#39;s F-12 media om de gewenste zaaidichtheid verdubbelen (bv. 20 x 10 6 cellen / ml voor een uiteindelijke concentratie van 10 x 10 6 cellen / ml na inkapseling). </li></ol> 2. Chondrocyte-agarose Hydrogel Encapsulation <ol><li> Heat 0,8 g geautoclaveerd Type VII agarose in 20 ml steriel 1x PBS (pH 7,4) op een hete plaat op 120 ° C worden opgelost. Na oplossen te temperen tot 60 ° C hogere temperaturen Will van invloed zijn levensvatbaarheid van de cellen. </li><li> In een 50 ml conische buis, meng gelijke hoeveelheden van de celsuspensie met dubbele gewenste concentratie van agarose (bijv. 4% agarose suspensie voor een laatste 2% agarose hydrogel). Vermijd het ontstaan ​​van grote bellen als ze kunnen levensvatbaarheid van de cellen beïnvloeden en bouwen levensduur. </li><li> Zorgvuldig aliquot van 10 ml van de chondrocyten-agarose mengsel in een diameter van 60 mm petrischaal, terwijl het vermijden van het ontstaan ​​van grote bellen. </li><li> Laat 30 min bij kamertemperatuur tot gegeleerd. </li><li> Zorg voor zo veel chondrocyten-agarose hydrogel monsters als dat nodig is (meestal 20-30) met een 4 mm biopsie punch. </li><li> Meet en noteer de afmetingen (diameter en hoogte) van representatieve monsters met een micrometer. Constructen moet ongeveer 5 mm groot, weggooien monsters verkregen uit een gebied waar het monster hoogte verschil groter was dan 2%. </li><li> Doorvoermonsters een nieuwe 60 mm petrischaaltje supplementmet 10 ml volledige media (bijv. 20% foetaal bovien serum in Ham&#39;s F-12 kweekmedium met 20 mM HEPES, 100 ug / ml ascorbinezuur en 2x antibiotica / antimycotica). </li></ol> 3. Mechanische stimulatie en radioactief merken van Chondrocyten-agarose Hydrogelen <ol><li> Autoclaaf de metalen onderdelen van de compressie rig. Steriliseer de plastic onderdelen met 70% ethanol (overnacht) en UV licht (ten minste 15 min). </li><li> Tot constructen omvalt, met forceps, plaats 12 steriele plastic borgringen (met een binnendiameter groter dan de diameter construct) (n = 6, monsters en controles) in de putjes van een 24-well kweekplaat. </li><li> Behulp van een tang voorzichtig overdragen chondrocyte-agarose hydrogels van de petrischaal op de 24-well plaat, vastzetten elk in een borgring. </li><li> Breng 400 pl volledig medium (bijv. 20% FBS in Ham&#39;s F-12 kweekmedium met 20 mM HEPES, 100 ug / ml ascorbinezuur en2x antibiotica / antimycotica) aan elk monster goed. </li><li> Monteer de gesteriliseerde compressie rig (figuur 1) en zet de platen met stelschroeven. Bevestig de compressie rig naar de 24-well cultuur plaat. </li><li> Los te laten en opnieuw te beveiligen van de stelschroeven met glasplaat-hydrogel contact (nul stam staat) vast te stellen. </li><li> Laad de gemonteerde compressie rig in een Mach-1 Micromechanische Testing System. Secure rig om de verticale fase via fixeerpen en zet ze vast met de stelschroef. Verwijder de afstand jig. </li><li> Toepassing dynamische drukbelasting op gewenste amplitude (bijv. 10% rek amplitude gebaseerd op de oorspronkelijke hoogte van de monsters), frequentie (bijv. 1 Hz) en duur of het aantal cycli (bijvoorbeeld intervallen tot 60 min). </li><li> Na de voltooiing van mechanische stimulatie, vervang dan de afstand mal, maak de paspen schroeven los en verwijder de compressie rig en cultuur plaat uit de Mach-1 Micromechanische Testing System. </li&gt; <li> Radiolabel cel hydrogel constructen door daaraan media met 5 uCi gewenste isotoop (bijv. [3H]-proline eiwit label voor chondrocyte specifieke collageensynthese en [35S]-zwavel proteoglycaan synthese). </li><li> Incubeer de radioactief gemerkte constructen gedurende 24 uur bij 37 ° C, 5% CO2 10. </li><li> Oogst de radioactief gemerkte constructen hydrogel en spoel 3 keer in 1x PBS (pH 7,4) eventuele niet opgenomen isotoop verwijderen. Digest monsters met papaïne (40 ug / ml in 20 mM ammoniumacetaat, 1 mM ethyldiaminetetraacetic zuur en 2 mM dithiothreitol bij 65 ° C gedurende 72 uur). </li><li> Assay digest voor DNA-inhoud met de PicoGreen kleurstof assay 11 en ingebouwde isotoop activiteit, genormaliseerd naar DNA-gehalte, door β-vloeistofscintillatietelling 12,13 direct na papaïnedigestie. </li></ol> Opmerking: De aankoop en verkoop van radioactieve stoffen (afval isotopen en artikelendat kan hebben in contact komen radioactieve stoffen) moet voldoen aan de relevante institutionele (en / of overheids) beleid en procedures voor de veilige behandeling en verwijdering van radioactieve stoffen. 4. Representatieve resultaten Bovine articulaire chondrocyten-agarose hydrogels constructen (2% agarose met 10 x 10 6 cellen / ml ingekapselde cellen) werden mechanisch gestimuleerd bij een amplitude van 10% drukspanning bij een frequentie van 1 Hz gedurende 20 tot 60 min (of 1.200 tot 3.600 cycli ) en geanalyseerd op DNA-gehalte en extracellulaire matrix synthese door opname van radio-isotopen. DNA en extracellulaire matrix synthese werd beïnvloed op een dosisafhankelijke wijze. DNA inhoud vertoonden een significante afname 35% als gevolg van 20 of 30 min stimulatie (p &lt;0,01), terwijl 60 min stimulatie vertoonde geen effect (Figuur 2). Kraakbeen-specifieke collageen en proteoglycanen synthese (bepaald door [3H]-proline en[35S]-opname zwavel, respectievelijk) significante toename van ongeveer 60% vertoonden in reactie op 20 of 30 min stimulatie (p &lt;0,01), met 60 min stimulatie vertonen geen waarneembaar effect (Figuur 3). <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig1.jpg" alt="Figuur 1" /> . Figuur 1 Schematische weergave van de custom-built dynamische compressie rig voor het stimuleren van chondrocyten-agarose constructies Links:. Assembled rig Rechts:. Exploded view weergeven van afzonderlijke componenten. <img src="/files/ftp_upload/4229/4229fig2.jpg" alt="Figuur 2" /> Figuur 2. Veranderingen in DNA gehalte van chondrocyte-agarose hydrogelen mechanisch gestimuleerd minder dan 10% drukbelasting amplitude bij 1 Hz gedurende 20 tot 60 minuten (gemiddelde ± SEM, n = 6/group). Figuur 3. Veranderingen in extracellulaire matrixsynthese (collageen en proteoglycanen) van chondrocyte-agarose hydrogelen mechanisch gestimuleerd tot 10% drukbelasting amplitude bij 1 Hz gedurende 20 tot 60 minuten (gemiddelde ± SEM, n = 6/group).

<ol><li>Grodzinsky, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+remodeling+in+response+to+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 691-713 (2000).</li>
<li>Kuettner, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry+of+articular+cartilage+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Biochemistry of articular cartilage in health and disease.</a> Clinical Biochemistry. 25, 155-163 (1992).</li>
<li>Neu, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interface+of+functional+biotribology+and+regenerative+medicine+in+synovial+joints%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+B%3A+Reviews%22%5BJournal%5D)">The interface of functional biotribology and regenerative medicine in synovial joints.</a> Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 235-247 (2008).</li>
<li>Demarteau, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+of+cartilage+constructs+engineered+from+expanded+human+articular+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression of cartilage constructs engineered from expanded human articular chondrocytes.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 310, 580-588 (2003).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+intermittent+compressive+stimulation+improves+the+composition+and+mechanical+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Long-term intermittent compressive stimulation improves the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage.</a> Tissue Engineering. 10, 1323-1331 (2004).</li>
<li>Hunter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+compression+of+chondrocyte-seeded+fibrin+gels%3A+effects+on+matrix+accumulation+and+mechanical+stiffness%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Dynamic compression of chondrocyte-seeded fibrin gels: effects on matrix accumulation and mechanical stiffness.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 12, 117-130 (2004).</li>
<li>Buschmann, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+compression+modulates+matrix+biosynthesis+in+chondrocyte%2Fagarose+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical compression modulates matrix biosynthesis in chondrocyte/agarose culture.</a> Journal of Cell Science. 108 (Pt 4), 1497-1508 (1995).</li>
<li>Quinn, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+compression+alters+proteoglycan+deposition+and+matrix+deformation+around+individual+cells+in+cartilage+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mechanical compression alters proteoglycan deposition and matrix deformation around individual cells in cartilage explants.</a> Journal of Cell Science. 111 (Pt 5), 573-583 (1998).</li>
<li>Kuettner, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+cartilage+matrix+by+mammalian+chondrocytes+in+vitro.+I.+Isolation%2C+culture+characteristics%2C+and+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis of cartilage matrix by mammalian chondrocytes in vitro. I. Isolation, culture characteristics, and morphology.</a> The Journal of Cell Biology. 93, 743-750 (1982).</li>
<li>Lee, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+of+chondrocytes+embedded+in+3D+constructs%3A+in+vitro+methods+for+assessment+of+morphological+and+metabolic+response+to+compressive+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading of chondrocytes embedded in 3D constructs: in vitro methods for assessment of morphological and metabolic response to compressive strain.</a> Methods in Molecular Medicine. 100, 307-324 (2004).</li>
<li>McGowan, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+quantification+of+DNA+in+human+articular+and+septal+cartilage+using+PicoGreen+and+Hoechst+33258%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Biochemical quantification of DNA in human articular and septal cartilage using PicoGreen and Hoechst 33258.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 10, 580-587 (2002).</li>
<li>Fan, J. C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intermittent+static+biaxial+tensile+strains+on+tissue+engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">The effect of intermittent static biaxial tensile strains on tissue engineered cartilage.</a> Annals of Biomedical Engineering. 38, 1672-1682 (2010).</li>
<li>Kaupp, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+vibrations+increase+the+proliferation+of+articular+chondrocytes+in+high-density+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Institution+of+Mechanical+Engineers%2C+Part+H%3A+Journal+of+Engineering+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical vibrations increase the proliferation of articular chondrocytes in high-density culture.</a> Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 222, 695-703 (2008).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+intermittent+shear+deformation+improves+the+quality+of+cartilaginous+tissue+formed+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopaedic+Research%22%5BJournal%5D)">Long-term intermittent shear deformation improves the quality of cartilaginous tissue formed in vitro.</a> Journal of Orthopaedic Research. 21, 590-596 (2003).</li>
<li>Waldman, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+application+of+cyclic+loading+can+accelerate+matrix+deposition+and+enhance+the+properties+of+tissue-engineered+cartilage%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">A single application of cyclic loading can accelerate matrix deposition and enhance the properties of tissue-engineered cartilage.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 14, 323-330 (2006).</li>
<li>Kisiday, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+dynamic+compressive+loading+on+chondrocyte+biosynthesis+in+self-assembling+peptide+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanics%22%5BJournal%5D)">Effects of dynamic compressive loading on chondrocyte biosynthesis in self-assembling peptide scaffolds.</a> Journal of Biomechanics. 37, 595-604 (2004).</li>
<li>Chowdhury, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+chondrocyte+metabolism+in+agarose+constructs+subjected+to+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of chondrocyte metabolism in agarose constructs subjected to dynamic compression.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 417, 105-111 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

<html> De beschreven werkwijze voor het aanbrengen gecontroleerde mechanische stimuli tot cel geplaatste agarose hydrogels maakt rechtstreekse onderzoek naar de effecten van dynamische drukkracht over chondrocyte metabolisme. Het gebruik van de maat testopstelling in samenhang met de borgringen ontvangen laterale beperking voor de constructen mogelijke problemen monster kantelen te voorkomen. Het gebruik van dode-gewogen laden platen beveiligd door sets bemanningen zorgt voor direct contact met constructen, ondanks mogel...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het serum of uitrusting </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Ham&#39;s F-12 </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> SH3001002 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase A </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> C0130 </td><td></td></tr><tr><td> Protease </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> P5147 </td><td></td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> F1051 </td><td></td></tr><tr><td> Ascorbaat </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A4034 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotica / antimycotica </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A5955 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Bioshop Canada Ltd </td><td> HEP001 </td><td></td></tr><tr><td> Trypaanblauw </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> 93595 </td><td></td></tr><tr><td> Reichert Bright-Line Hemacytometer </td><td> Hausser Wetenschappelijke </td><td> 1490 </td><td></td></tr><tr><td> Quant-iT PicoGreen </td><td> Invitrogen </td><td> P7589 </td><td></td></tr><tr><td> Papaïne van papaya latex </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> P3125 </td><td></td></tr><tr><td> Ammoniumacetaat </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A1542 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyldiaminetetraacetic Acid </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> E9884 </td><td></td></tr><tr><td> DL-Dithiothreitol </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> 43819 </td><td></td></tr><tr><td> Low Melting Point Agarose, Type VII </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> A9045 </td><td></td></tr> &lt;tr&gt; <td> Mesh Screen (200) Filter </td><td> Sigma Aldrich Ltd </td><td> S4145 </td><td></td></tr><tr><td> Mach-1 Micromechanische Tester </td><td> Biomomentum Inc </td><td> V500cs </td><td></td></tr><tr><td> Compressie Laden Jig </td><td> Custom-built </td><td></td><td> Vergelijkbaar product kan worden geleverd door Biomomentum Inc </td></tr><tr><td> Falcon 24 Nou Cultuur Plate </td><td> Thermo Fisher Scientific </td><td> B353047 </td><td></td></tr><tr><td> β-Liquid Scintillation Counter </td><td> Beckman Coulter </td><td> LS6500 </td><td></td></tr><tr><td> [3H] Proline </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NET323005MC </td><td></td></tr><tr><td> [35S] Zwavel </td><td> Perkin-Elmer </td><td> NEX041005MC </td><td></td></tr></tbody></table>

mechanische stimulatie van chondrocyten-agarose hydrogelen

Mechanical Stimulation of Chondrocyte-agarose Hydrogels

Gewrichtskraakbeen lijdt aan een beperkte reparatie capaciteit wanneer deze door mechanische belediging of afgebroken door ziekte, zoals artrose. Om dit tekort te verhelpen zijn verschillende medische ingrepen ontwikkeld. Een dergelijke methode is om weer de kop opsteken de beschadigde plek met tissue-engineered kraakbeen, maar de gemanipuleerde weefsel meestal niet over de biochemische eigenschappen en duurzaamheid van inheemse kraakbeen, vragen stellen op de lange termijn overlevingskansen. Dit beperkt de toepassing van kraakbeen tissue engineering aan de reparatie van kleine focale defecten, met een beroep op het omliggende weefsel aan het geïmplanteerde materiaal te beschermen. Ter verbetering van de eigenschappen van de ontwikkelde weefsel mechanische stimulatie is een populaire methode gebruikt om de synthese van kraakbeenachtige extracellulaire matrix en de resulterende mechanische eigenschappen van de gemanipuleerde weefsel verbeteren. Mechanische stimulatie toepassing krachten op het weefsel constructen analoog aan die ervaren in vivo. Dezeis gebaseerd op de vooronderstelling dat de mechanische omgeving, gedeeltelijk de ontwikkeling en instandhouding van natuurlijke weefsel 1,2 regelt. De meest gangbare vorm van mechanische stimulatie in kraakbeenweefsel engineering dynamische compressie bij fysiologische stammen van ongeveer 5-20% bij een frequentie van 1 Hz 1,3. Verschillende studies hebben de effecten van dynamische compressie en hebben aangetoond dat het een positief effect op chondrocyte metabolisme en biosynthese hebben uiteindelijk die de functionele eigenschappen van de ontwikkelde weefsel 4-8. In dit artikel illustreren we de methode om mechanisch chondrocyten-agarose hydrogel constructies te stimuleren onder dynamische compressie en analyseren veranderingen in de biosynthese door middel van biochemische en radio-isotopen analyses. Deze methode kan ook gemakkelijk worden gemodificeerd om eventueel veroorzaakte veranderingen in cellulaire respons geven als gevolg van mechanische stimuli.

De biosynthese van kraakbeenachtige extracellulaire matrix door chondrocyten kan worden beïnvloed door toepassing van mechanische stimuli. Deze methode beschrijft de technische uitvoering van dynamische druk-stammen chondrocyten ingekapseld in 3D constructen en de evaluatie van geïnduceerde veranderingen in chondrocyte metabolisme.

Mechanische stimulatie van Chondrocyten-agarose Hydrogelen

Gewrichtskraakbeen heeft een beperkt herstelvermogen bij beschadiging door mechanisch trauma of degradatie door ziekten, zoals artrose. Om dit te verhelpen ...

Het algemene doel van deze procedure is om dynamische mechanische compressiebelasting toe te passen op met cellen gezaaide hydrogels. Hiervoor worden primaire cellen verkregen via dissectie en enzymatische digestie van kraakbeenschijfjes. De geïsoleerde cellen worden ingekapseld in een 2% agros-hydrogel, en met cellen gezaaide constructen worden gemaakt met behulp van een biopsietpons.De monsters worden vervolgens in de compressielastopstelling geplaatst en geladen in een mach one micro mechanische stimulator. Dynamische compressiebelasting wordt vervolgens toegepast op de met cellen gezaaide constructen om de synthese van collageen en proteoglycanen te beoordelen. De constructen worden radioactief gelabeld na incubatie en incorporatie.Isotopen worden gekwantificeerd via scintillatietelling; de resulterende gegevens worden genormaliseerd naar DNA. De inhoud toont veranderingen in de synthese van de extracellulaire matrix na mechanische stimulatie. Deze methode kan inzicht bieden in de respons van de counter site en mechanische stimulatie.Het kan ook worden toegepast op andere systemen, zoals stamcellen, andere bindweefsels of mechanoreceptieve cellen. De metacarpofalangeale gewrichten van skeletaal volwassen koeien die hier zijn gebruikt, werden verkregen van een lokaal slachthuis in een steriele dissectieruimte. Plaats de kraakbeensnijden in een laminaire flowkast in een Petri schaal met een diameter van 100 millimeter die 20 milliliter Ham's F 12 bevatten met 0,5% protease en incubeer gedurende twee uur bij 37 °C.Zuig na de incubatie met de vacuümpomp de protease-oplossing af en spoel de coupes door voorzichtig hams. F 12 kweekmedium toe te voegen onder zacht draaien, waarna het medium wordt afgezogen. Herhaal dit proces nog twee keer; zuig na de derde wasbeurt het kweekmedium met de vacuümpomp af.Voeg 20 milliliter hams F 12 toe dat 0,15% collagenase A bevat en incubeer de schaaltjes gedurende de nacht bij 37 graden Celsius. Pipetteer de volgende dag de celsuspensie door een zeef met een maaswijdte van 200 mesh in een schone Petrischaal. Om het filter te spoelen, pipetteert u nog eens vijf milliliter hams F 12 en verzamelt u het filtraat in dezelfde schaal. Breng de celsuspensie over naar een conische buis van 50 milliliter.Was de Petrischaal met 10 milliliters hams F 12. Voeg vervolgens de wasoplossing toe aan de conische buis. Centrifugeer de buis bij 600 tot 800 RCF gedurende zes tot acht minuten bij kamertemperatuur.Zodra het centrifugeren is voltooid, wordt het supernatant afgezogen, waarbij voorzichtig wordt gewerkt om het celpellet niet te verstoren. Resuspendeer het pellet in 40 milliliters kweekmedium. Centrifugeer de buis bij 600 tot 800 RCF gedurende zes tot acht minuten.Herhaal de aspiratie, resuspensie en centrifugatie nog twee keer, voor een totaal van drie keer vóór de derde spin. Resuspendeer het palatum door agitatie en neem een aliquot van 500 µL voor het tellen van de cellen. Gebruik tijdens de derde spin een hemocytometer en een omgekeerde lichtmicroscoop om de levensvatbare cellen in de aliquot te tellen via trypan blue-exclusie.Zodra het celgetal is bepaald en de derde centrifugeerstap is voltooid, wordt het supernatant afgezogen en de pellet geresuspendeerd. Suspendeer de pellet in een volume kweekmedium dat tweemaal de gewenste zaaidichtheid bedraagt. In dit geval worden de chondrocyten geresuspendeerd op 20 × 10⁶ cellen per milliliter.De volgende stap van de procedure is het inkapselen van de geïsoleerde primaire articulaire chondrocyten in een aros-hydrogel; suspendeer 0,8 gram aros in 20 milliliter steriele PBS in een bekerglas. Plaats het bekerglas op een warmteplaat die is ingesteld op 120 °C zodra de aros is opgelost.Verlaag de temperatuur naar 60 °C in een conische buis van 50 ml. Combineer gelijke volumes van de celsuspensie met een dubbele concentratie van de verwarmde aro-oplossing. Hierbij worden 5 ml celsuspensie toegevoegd aan 5 ml 4% agro-suspensie voor een uiteindelijke 2% Agros-hydrogel; meng grondig door te pipetteren, waarbij de vorming van grote bellen die de cellevensvatbaarheid kunnen beïnvloeden, moet worden vermeden.Pipette vervolgens voorzichtig 10 milliliters van het chondrocyten-agarose mengsel in een Petri-schaal met een diameter van 60 millimeter. Vermijd hierbij opnieuw de vorming van grote bellen. Dek de schaal af met het deksel.Laat het mengsel vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur staan. Zodra het mengsel gestold is, gebruikt u een biopsietang van vier millimeter om zoveel mogelijk chondrocyten-agros hydrogelmonsters te verkrijgen. Dit komt doorgaans neer op 20 tot 30 monsters.Plaats de monsters in een schone Petrischaal met behulp van een micrometer en noteer de diameter en hoogte van elk monster. Idealiter moet het construct ongeveer vijf millimeter hoog zijn; verwerp alle monsters die afkomstig zijn uit een regio waar de monsterhoogte meer dan 2% afwijkt. Breng de monsters over naar een nieuwe Petrischaal van 60 millimeter met 10 millimeter compleet medium. In dit deel van het protocol zullen de celgebeelde constructs mechanisch worden gestimuleerd door dynamische compressie.Dit zal worden gerealiseerd met behulp van een op maat ontworpen compressie-opstelling die de construct beladende PLA's mechanisch koppelt aan een gesimuleerd micromechanisch systeem, dat de hoeveelheid compressie reguleert die op de constructen wordt uitgeoefend. Het meest uitdagende aspect van de procedure is het laden van monsters in de compressie-opstelling. Het is belangrijk om de platen in de opstelling correct af te stellen om een passende toepassing van dynamische compressiebelasting te waarborgen.Steriliseer voor gebruik de metalen componenten van de compressieopstelling in een autoclaaf. Steriliseer de plastic componenten gedurende de nacht met 70% ethanol en met UV-licht gedurende ten minste 15 minuten. Dit dient om te voorkomen dat de chondrocyten-aros hydrogelconstructen omvallen.Gebruik een pincet om 12 steriele plastic retentieringen in de wells van een 24-wells kweekplaat te plaatsen. De binnendiameters van de retentieringen moeten groter zijn dan de diameters van het construct. Doe dit voorzichtig met een pincet.Overbreng de chondro aros hydrogels van de Petrischaal naar de 24-wells plaat en zet elke hydrogel vast in een retentiering. Voeg 400 µL compleet medium toe aan elk monster. Assembleer vervolgens de gesteriliseerde compressie-opstelling en zet de PLA's vast met stelschroeven.Bevestig de compressieopstelling aan de 24-wells kweekplaat om het contact tussen de hydrogel en de release vast te stellen en draai deze vervolgens weer vast. De constructievervorming van de stelschroeven zal worden toegepast op deze onbelaste referentietoestand of nul-rektoestand. Plaats de geassembleerde compressieopstelling met de positioneerpen in een Mach one micro mechanical testing system.Bevestig de opstelling aan de verticale tafel en zet deze vervolgens vast met een stelschroef. Verwijder de afstandsmal. Gebruik de Mach one-softwareinterface om de frequentie in te stellen op 1 Hz, de amplitude op 350 µm en het aantal cycli op 1.200.Hiermee wordt een dynamische compressiebelasting toegepast met een rekamplitude van 10% op basis van de oorspronkelijke hoogte van de monsters. Om de mechanische stimulatie te starten, drukt u op de startknop van de mach one actuator. Het belastingsapparaat dat aan de kweekplaat wordt bevestigd, heeft zes inkepingen die op en neer bewegen, waardoor zes monsters gelijktijdig worden gestimuleerd.De ongestimuleerde controlemonsters bevinden zich eveneens in dezelfde kweekplaat, maar worden niet in de wells met inkepingen geplaatst. Wanneer de run is voltooid, geeft het apparaat een signaaltoon en keert de actuator terug naar de ongebelaste referentietoestand. Plaats na voltooiing van de mechanische stimulatie de afstandshulpstukken terug.Draai de stelschroef van de centreerpen los en verwijder de compressie-opstelling en de kweekplaat uit het testsysteem. Pipetteer in de cel-hydrogelconstructen naast het radiolabel vijf microcuries Tritium Prolene-eiwitlabel voor chondrocytenspecifieke collagensynthese en S 35-zwavel voor proteoglycansynthese in elke put. Incubeer de radiogemarkeerde constructen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% koolstofdioxide om de radiogemarkeerde hydrogelconstructen te oogsten. Gebruik een pincet om elk hydrogelconstruct drie keer te spoelen door onderdompeling in PBS. Plaats het gespoelde construct in een buisje van 1,5 milliliter om eventuele niet-ingebouwde isotopen te verwijderen.Voeg vervolgens 500 µL pape-oplossing toe aan de 1,5 mL buisjes. Plaats deze op een warmteblok en laat ze 72 uur lang verteren bij 65 °C. Zodra de digestie is voltooid, moet het monster er relatief helder uitzien.Neem direct na de pape-vertering aliquoten van 100 µL van elk monster om de DNA-inhoud te bepalen met de pico green D-assay. Neem vervolgens een aliquot van 100 µL van elk monster om de ingebouwde isotoopactiviteit te bepalen via beta-vloeistofscintillatietelling. De resulterende isotoopactiviteit moet vervolgens worden genormaliseerd naar de DNA-inhoud voor analyse.Boviene articulaire chondrocyten in aros-hydrogelconstructen, bestaande uit 2% aros met 10 × 10⁶ cellen per milliliter ingekapselde cellen, werden mechanisch gestimuleerd met een amplitude van 10% compressie-rek bij een frequentie van 1 Hz gedurende 20 tot 60 minuten, of 1.200 tot 3.600 cycli. Vervolgens werden ze geanalyseerd op DNA-gehalte en synthese van de extracellulaire matrix via radioisotoopincorporatie.Zoals hier kan worden gezien, werd de synthese van DNA en extracellulaire matrix beïnvloed op een dosisafhankelijke wijze. De DNA-inhoud vertoonde een significante afname van 35% als gevolg van 20 of 30 minuten stimulatie, met een p-waarde van minder dan 0,01; 60 minuten stimulatie vertoonde geen effect. De synthese van kraakbeenspecifiek collageen en proteoglycanen werd respectievelijk bepaald door incorporatie van tritium, proline en S 35 zwavel.Deze vertoonden significante stijgingen van ongeveer 60% als reactie op 20 of 30 minuten stimulatie, met een p-waarde van minder dan 0,01; 60 minuten stimulatie vertoonden geen waarneembaar effect. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe hydrogelculturen mechanisch kunnen worden gestimuleerd met behulp van dynamische impressie, en hoe u dit protocol kunt aanpassen voor gebruik in soortgelijke toepassingen.

mechanical-stimulation-of-chondrocyte-agarose-hydrogels

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een 3D-systeem van het kweken van menselijke articulaire chondrocyten in hoge mate van gewrichtsvocht wordt beschreven. Gewrichtsvocht geeft de meest natuurlijke micro-omgeving voor het kraakbeen, en kan gemakkelijk worden verkregen en opgeslagen. Dit systeem kan dus gebruikt worden voor het bestuderen van het herstel van kraakbeen en voor het screenen van geneesmiddelen voor de behandeling van artritis.

Een 3D-systeem voor het kweken van menselijke articulaire chondrocyten in gewrichtsvloeistof

We ontwierpen een nieuwe mechanische belasting bioreactor die eenassige of bi-axiale mechanische spanning voorafgaand aan de transplantatie kan toepassen op een kraakbeen biocomposite in een gewrichtskraakbeendefect.

Ontwerp van een tweeassige Mechanische belasting Bioreactor voor Tissue Engineering

Een bioprinter werd gebruikt om gevormde hydrogelen gebaseerd op een offer mal maken. De poloxamer mal werd opgevuld met een tweede hydrogel en vervolgens geëlueerd, waardoor holtes die gevuld waren met een derde hydrogel. Deze methode maakt gebruik van snelle elutie en goede bedrukbaarheid van poloxameer om complexe architecturen uit biopolymeren genereren.

Afdrukken warmteresponsieve Reverse Mallen voor de schepping van Patterned Hydrogelen Twee-component voor 3D Cell Culture

Kraakbeenherstel vormt een onopgeloste medische uitdaging en cel-gebaseerde benaderingen om menselijk articulair kraakbeen te ontwikkelen zijn een veelbelovende oplossing. Hier beschrijven we driedimensionale (3D) biomimetische hydrogels als een ideaal hulpmiddel voor de uitbreiding en rijping van menselijke articulaire kraakbeencellen.

3D Hydrogel Stellingen voor Articulaire Chondrocyte Cultuur en Kraakbeen Generation

Injecteerbare tissue engineering scaffold uit poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat (PNIPAAm-g-CS) bevattende alginaat microdeeltjes bereid. De hechtsterkte, zwelvermogen en in vitro biocompatibiliteit geanalyseerd in deze studie. De karakterisering technieken die hier ontwikkeld kan van toepassing zijn op andere thermogelling systemen.

Synthese van Thermogelling Poly (N-isopropylacrylamide) -graft-chondroïtinesulfaat Composites met Alginaatmicrodeeltjes voor Tissue Engineering

Mechanische stress kan de chondrogene differentiatie van stamcellen induceren, wat een potentiële therapeutische aanpak biedt voor de reparatie van beschadigd kraakbeen. We presenteren een protocol om de chondrogene differentiatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen (ASC's) te induceren met behulp van centrifugale zwaartekracht (CG). De door CG geïnduceerde opregulatie van SOX9 resulteert in de ontwikkeling van chondrogene fenotypes.

Chondrogene differentiatie Inductie van vetcellen afgeleide stamcellen door Centrifugaal Zwaartekracht

Chondrogenese uit stamcellen vereist fine tuning van de kweekomstandigheden. Hier presenteren we een magnetische aanpak voor het condenseren van cellen, een essentiële stap om chondrogenese te initiëren. Bovendien tonen wij aan dat dynamische rijping in een bioreactor zijn mechanische stimulatie van de cellulaire constructen en verbetert kraakbeenachtige extracellulaire matrix productie.

3D Magnetic Stem Cell Samenvoeging en Bioreactor rijping voor het herstel van kraakbeen

Dit artikel biedt gedetailleerde methoden voor het vervaardigen en karakteriseren van een pneumatisch bedienend microfluïdisch apparaat voor chondrocyten compressie.

Een Microfluïdisch platform voor het stimuleren van chondrocyten met dynamische compressie

Bottherapie via endochondrale ossificatie door het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel geproduceerd uit mesenchymale stamcellen heeft het potentieel om de nadelen van conventionele therapieën te omzeilen. Hyaluronzuurhydrogels zijn effectief bij het opschalen van uniform gedifferentieerde kraakbeentransplantaten en bij het creëren van geïntegreerd bot met vascularisatie tussen gefuseerde transplantaten in vivo.

Geïntegreerde botvorming door in vivo endochondrale ossificatie met behulp van mesenchymale stamcellen

Deze studie beschrijft een methode voor het produceren van chondrocytische sferoïden door cellen samen te voegen tot sferoïden onder omstandigheden met een lage adhesie met behulp van zwaartekracht, gevolgd door het kweken van de resulterende sferoïden in mini-bioreactoren.

Het genereren van sferoïden uit verschillende chondrocyten met behulp van weinig klevende omstandigheden onder zwaartekracht en zelfgemaakte mini-bioreactoren

Leer dynamische mechanische compressiebelasting toepassen op chondrocyten in agarose hydrogels. Deze methode evalueert collageen- en proteoglycaansynthese voor weefseltechnologisch onderzoek naar kraakbeenherstel.

Mechanische stimulatie van Chondrocyten-agarose Hydrogelen

Meer video's verkennen