Name: Extractie van Tissue Antigens voor functionele testen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Leer een veilige methode voor het prepareren van weefselextracten voor functionele T-celassays. Deze techniek gebruikt BAW-homogenisatie en lyofilisatie zonder giftige oplosmiddelen, waardoor T-celproliferatie en cytokinesecretie nauwkeurig gemeten kunnen worden.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van de Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC # 559007) en de Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF 4-2006-1025) en de operationele infrastructuur Regeling van de Victoriaanse regering. Wij danken de leden van de Tom Mandel Islet Transplantation Programma Islet Isolatie Team voor het verstrekken van de menselijke weefsels. Menselijke weefsels werden verzameld en gebruikt met de lokale ethische goedkeuring (St. Vincent&#39;s Hospital HREC-A 011/04 en St. Vincent&#39;s Health HREC-A 135/08).

1. Voorbereiden miltweefsel <ol><li> Opmerking-alle menselijke materiaal moet worden behandeld als mogelijk infectieus en alle procedures moeten worden uitgevoerd in een klasse II Laminar Flow kabinet. Met steriele schaar en forceps, verwijder vet en bindweefsel van miltsecties (~ 1-2 cm in grootte) en afsnijden zoveel van de buitenste capsule mogelijk materiaal. </li><li> Snij een klein stukje (1-2 cm 3) van de milt weefsel en plaats elk stuk in een steriele 50 ml Falcon buis. </li><li> De stukjes weefsel snap invriezen door onderdompeling in vloeibare N2. </li><li> Bewaren bij -80 ° C. Een soortgelijk protocol geschikt voor andere weefsel (s). </li></ol> 2. Voorbereiding Human Islet voor opslag <ol><li> Cultuur eilandjes in CMRL media. Verzamel eilandjes in een 10 ml conische bodem buis en wassen in PBS tweemaal door centrifugeren bij 1500 rpm gedurende 5 minuten. Giet de PBS-en afvoer van de resterende buffer door het plaatsen van de omgekeerde buis kort op een papieren handdoek. Zorg dat er geende eilandjes verwijderen. </li><li> Zodra afgevoerd, re-cap de buis en snap-vries in vloeibare stikstof en bij -80 ° C. </li></ol> 3. Voorbereiden Extract <ol><li> Bereid BAW mix (10:30:60% v / v) en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Haal de buis uit -80 ° C. Ontdooien bij kamertemperatuur. </li><li> Voeg voldoende ijskoude BAW het stuk van weefsel te dekken. Voor gebruik eilandjes 3-5 ml. Voor miltweefsel gebruiken 10-20 ml afhankelijk van de grootte van het stuk weefsel. </li><li> Monteer het weefsel homogenisator. Clean van &#39;homogeniseren&#39; 10-20 ml 70% ethanol / water. </li><li> Homogeniseer het weefsel in verschillende bursts, na plaatsing van de homogenisator probe in de buis met het weefsel en BAW oplossing. Houd de buis in een ijs-emmer daarna. </li><li> Reinig de homogenisator tussen de monsters, door het homogeniseren van 10-20 ml 70% ethanol / water en dan BAW buffer. Dit voorkomt kruisbesmetting van weefsel tussen samples.Dismantleand schoon met 70% ethanol / water na onse. </li><li> Als een extract dat alleen oplosbaar materiaal nodig, gehomogeniseerd weefsel extract centrifuge bij 4.000 rpm bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Als een ruwe extract nodig, draaien bij 1000 rpm bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. De meest geschikte techniek voor de extractie BAW onoplosbare eiwitten afhankelijk van de stroomafwaarts analyse van de eiwitten. Voor functionele immunologische assays we stel probeert de onoplosbare fractie te lossen in 8 M ureum zoals we eerder vonden dit goed verdragen 6. </li><li> Breng supernatant naar een schone buis en zet hem op ijs. </li><li> De concentratie van proteïne in het extract met een BCA assay of dergelijke. </li></ol> 4. Freeze Drying Extracten <ol><li> Afhankelijk van de hoeveelheid benodigde eiwit (dat wil zeggen 100 ug per buis) dienovereenkomstig verdunnen homogenaat en breng aliquots in gelabelde 5,0 ml steriele Falcon (12x75 mm) buizen. We gebruiken vaak 100 ug / buis. </li><li> Gebruik een 18 tot 20 gauge steriele naald van de spuit tot 3 gaten in de dop van elke buis. </li><li> Hetzij bevriezen buizen door ze op droog ijs ~ 10 min of in een -80 ° C vriezer&gt; 1 uur. Bewaren bij -80 ° C tot klaar te zetten op de vriesdroger. </li><li> Schakel vriesdroger om de temperatuur (-100 ° C). Dit duurt ongeveer 30 minuten. </li><li> Afhankelijk van het volume, kan vriesdrogen worden voltooid binnen 3 uur, maar we regelmatig &#39;s nachts laten onze monsters. </li><li> Na afloop van de droogcyclus, schakel vacuümpomp en langzaam de druk toe in de kamer. Verwijder rek. </li><li> In een steriele kap, verwijder dan de geperforeerde doppen van de tubes en vervangen door nieuwe (Falcon 352.032). </li><li> Store buizen bij -20 ° C. Monsters kunnen worden gereconstitueerd in kweekmedia of andere buffers, en gebruikt in functie of biochemische assays. </li></ol> 5. Representatieve resultaten Figuur 1 toont de kleuring van een eiwitgel geladen met extract van de milt en de eilandjes uitgeput alvleesklierweefsel (gelabeld acinaire) en gezuiverd humaan eilandjes (met het label eilandjes). De resultaten tonen een goede representatie van eiwitten van verschillende molecuulgewicht voor elk weefseltype. De capaciteit van weefselextracten menselijke T-celproliferatie te stimuleren werd getest met een CFSE-gebaseerde proliferatie assay 7 (figuur 2). De PBMC die in deze assay werden geïsoleerd uit een individu met type 1 diabetes. De omvang van de respons wordt uitgedrukt als een verhouding van het aantal cellen per CFSE dim 5000 CD4 +, CFSE heldere cellen zonder antigen: of CFSE dim cellen per 5000 CD4 +, CFSE heldere cellen met antigeen uit drievoudige monsters 7. De resultaten laten een zwakke, maar detecteerbare, proliferatie in reactie op acinar (CD1 = 3.5) en een sterkere reactie op islet extract (6,8). Geïnactiveerd influenza virus (CDI = 142,6) is als eenpositieve controle. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig1.jpg" /> Figuur 1. Protein gel. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4230/4230fig2.jpg" /> Figuur 2. Resultaten van een CFSE-gebaseerde proliferatietest tegen acinaire en eilandje extract. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4230/4230fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> .

<ol><li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+approaches+to+measuring+human+islet-antigen+specific+T+cell+function+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Current approaches to measuring human islet-antigen specific T cell function in type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 162, 197-209 (2010).</li>
<li>Beckhove, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+T+cell-based+identification+of+human+tumor+tissue+antigens+by+automated+two-dimensional+protein+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Rapid T cell-based identification of human tumor tissue antigens by automated two-dimensional protein fractionation.</a> J. Clin. Invest. 120, 2230-2242 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I., Brodnicki, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+insights+into+CD4%2B+T-cell+specificity+and+function+in+Type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Recent insights into CD4+ T-cell specificity and function in Type 1 diabetes.</a> Expert Review of Clinical Immunology. 3, 557-564 (2007).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+A-chain+of+insulin+is+a+hot-spot+for+CD4%2B+T+cell+epitopes+in+human+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The A-chain of insulin is a hot-spot for CD4+ T cell epitopes in human type 1 diabetes.</a> Clin. Exp. Immunol. 156, 226-231 (2009).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+insulin+A-chain+epitope+recognized+by+human+T+cells+is+posttranslationally+modified%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The insulin A-chain epitope recognized by human T cells is posttranslationally modified.</a> J. Exp. Med. 202, 1191-1197 (2005).</li>
<li>Moon, H. C., Joffe, M., Thomas, H. E., Kay, T. W. H., Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+extracting+tissue+proteins+for+use+in+lymphocyte+function+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A method for extracting tissue proteins for use in lymphocyte function assays.</a> Journal of Immunological Methods. 359, 56-60 (2010).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+detecting+proliferation+of+rare+autoantigen-specific+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for detecting proliferation of rare autoantigen-specific human T cells.</a> J. Immunol. Methods. 283, 173-183 (2003).</li>
<li>Mannering, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2B+T+Cell+Proliferation+in+Response+to+GAD+and+Proinsulin+in+Healthy%2C+Pre-diabetic%2C+and+Diabetic+Donors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">CD4+ T Cell Proliferation in Response to GAD and Proinsulin in Healthy, Pre-diabetic, and Diabetic Donors.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1037, 16-21 (2004).</li>
<li>Mannering, S. I., Purcell, A. W., Honeyman, M. C., McCluskey, J., Harrison, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+T-cells+recognise+N-terminally+Fmoc-modified+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Human T-cells recognise N-terminally Fmoc-modified peptide.</a> Vaccine. 21, 3638-3646 (2003).</li>
<li>Peakman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+preparations+of+GAD65%2C+proinsulin%2C+and+the+islet+tyrosine+phosphatase+IA-2+for+use+in+detection+of+autoreactive+T-cells+in+type+1+diabetes%3A+report+of+phase+II+of+the+Second+International+Immunology+of+Diabetes+Society+Workshop+for+Standardization+of+T-cell+assays+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Characterization of preparations of GAD65, proinsulin, and the islet tyrosine phosphatase IA-2 for use in detection of autoreactive T-cells in type 1 diabetes: report of phase II of the Second International Immunology of Diabetes Society Workshop for Standardization of T-cell assays in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 50, 1749-1754 (2001).</li>
<li>Honey, K., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+cysteine+proteases+regulate+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lysosomal cysteine proteases regulate antigen presentation.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 472-482 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Dit protocol is ontwikkeld, omdat we wilden een uittreksel uit menselijk weefsel dat was vrij van giftige chemicaliën zoals wasmiddelen te genereren. Specifiek hebben we gebruikt om extracten van humane weefsels die kunnen worden gebruikt in assays van menselijke immuunsysteem in vitro bereiden. Extracten bereid met dit protocol kan ook worden opgelost in een buffer en voor vele biochemische analyses, zoals Western blotting of vloeistofchromatografie. Dit maakt deze techniek voor vele verdere toepassingen. ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 5 ml 12 x 75 mm polystyreen buizen steriele </td><td> BD Falcon </td><td> 352054 </td><td></td></tr><tr><td> Caps voor buizen polystyreenbuizen (boven) </td><td> BD Falcon </td><td> 352032 </td><td></td></tr><tr><td> 50ml steriele buizen </td><td> Becton Dickinson </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitril </td><td> Mallinckradt Chemicals </td><td> 2,856-10 </td><td></td></tr><tr><td> Butaan-1-ol </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 537993-IL </td><td></td></tr><tr><td> Homogenisator: PRO200 </td><td> Bio-strategie </td><td> 01-01200 </td><td> 10 x 115 mm zaagtandgenerator </td></tr><tr><td> Vriesdroger </td><td></td><td></td><td> Virtis, Benchtop 4K </td></tr><tr><td> Steriele naald 18 tot 20 gauge </td><td> Becton Dickinson </td><td> REF 302032 </td><td></td></tr><tr><td> CMRL-1066 Medium </td><td> Sigma </td><td> C0422 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabel 1. Specifieke reagentia en apparatuur.

extractie van tissue antigens voor functionele testen

Extraction of Tissue Antigens for Functional Assays

Veel antigen doelstellingen van adaptieve immuunrespons, die door B en T cellen, niet gedefinieerd 1. Dit geldt met name voor auto-immuunziekten en kanker 2. Ons doel is het onderzoeken van de antigenen herkend door menselijke T-cellen in de autoimmuunziekte type 1 diabetes 1,3,4,5. De menselijke T-cel responsen te analyseren tegen weefsel waar de antigenen herkend door T cellen worden geïdentificeerd we een methode ontwikkeld om eiwitantigenen onttrekken menselijk weefsel in een formaat dat compatibel is met functionele assays 6. Voorheen T-cel responsen op ongezuiverde weefselextracten kon niet gemeten worden omdat de extractiemethoden opleveren lysaat vervat detergentia die toxisch voor menselijke perifere mononucleaire bloedcellen. Hier beschrijven we een protocol voor het extraheren van eiwitten uit menselijk weefsel in een formaat dat niet toxisch is voor humane T-cellen. Het weefsel wordt gehomogeniseerd in een mengsel van butaan-1-ol, acetonitril en water (BAW). De eiwitconcentratie in het weefsel extract wordt gemeten en een bekende massa eiwit verdeeld in buizen. Na extractie wordt de organische oplosmiddelen verwijderd door lyofilisatie. Gevriesdroogd weefselextracten kan worden opgeslagen tot zij nodig zijn. Voor gebruik in assays van de immuunfunctie, een suspensie van immuuncellen, in geschikte kweekmedia, direct kan worden toegevoegd om het gevriesdroogde extract. Cytokineproductie en proliferatie van PBMC als reactie op extracten bereid met deze methode, werden gemakkelijk gemeten. Vandaar onze werkwijze maakt de snelle bereiding van menselijk weefsel lysaten die kunnen worden gebruikt als bron van antigenen in de analyse van T-cel responsen. We suggereren dat deze methode de analyse van adaptieve immuunrespons vergemakkelijken weefsel bij transplantatie, kanker en auto-immuniteit.

Een eenvoudige protocol voor het bereiden van extracten van menselijke weefsels worden gebruikt als bron van antigenen in functionele T-cel-assays beschreven. Deze methode laat T-cel responsen op weefsel afgeleide antigenen te meten<em&gt; In vitro</em&gt;.

Extractie van Tissue Antigens voor functionele testen

Veel van de antigeentargets van de adaptieve immuunrespons, die worden herkend door B- en T-cellen, zijn nog niet gedefinieerd 1. Dit geldt in het bijzonder voor auto-immuun...

Het algemene doel van deze procedure is het bereiden van een weefselextract dat geschikt is voor functionele immunologische assays. Dit wordt bereikt door eerst een monster van het betreffende weefsel te verzamelen. Homogeniseer vervolgens het weefselmonster in een mengsel van butanol, acetonitrile en water, oftewel BAW.Na het bepalen van de proteïneconcentratie wordt het extract verdeeld en gelyofilliseerd om oplosmiddelen te verwijderen. Uiteindelijk wordt het gereconstitueerde extract gebruikt als bron van antigeen in assays voor menselijke T-celproliferatie of cytokinesecretie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals detergentlyse, is dat het verkregen extract vrij is van toxische oplosmiddelen en detergenten.In dit protocol moeten alle menselijke materialen als potentieel infectieus worden behandeld en moeten alle procedures worden uitgevoerd in een laminaire flowkast klasse twee. Verwijder met steriele scharen en pincetten vet- en fibreus weefsel uit miltsecties van ongeveer één tot twee centimeter groot. Trim zoveel mogelijk van het materiaal van het buitenste kapsel weg.Snijd kleine stukjes miltweefsel en plaats elk stukje in

extraction-of-tissue-antigens-for-functional-assays

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Een protocol voor de voorbereiding van robuuste, kleinschalige HeLa nucleaire extracten wordt beschreven. Dit protocol is waardevol voor testen die het gebruik van kleine populaties van cellen, zoals cellen behandeld met medicijnen of RNAi vereisen. De methode moet voor diverse genexpressie assays en andere celtypes, die onder andere cellen.

Kleinschalige nucleaire extracten voor functionele testen van gen-expressie Machines

This video demonstrates the use of the ELISpot assay to assess the function of antibody-secreting B cells, ASCs. The antibodies secreted by the ASCs interact with the membrane-bound polyclonal antibody fragments, which are detected by the enzyme-conjugated IgG or IgM antibodies. The colored spot produced in each well indicates the presence of the specific antibody's isotype, which correlates with the B cells' secretory activity.

Functional Assessment of Antibody-Secreting B Cells Using ELISpot Assay

Wij presenteren hier een geoptimaliseerd, gedetailleerd protocol voor dubbele immunokleuring in formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselsecties van het centrale zenuwstelsel (CZS) en perifere lymfeklieren (LK) van ratten.

Immunohistochemische analyse in het Rat centrale zenuwstelsel en van perifere lymfeknopen Tissue Secties

Translationeel kankeronderzoek is afhankelijk van de extractie van menselijk weefsel. Er is veel werk verzet om extractiemethoden voor ex vivo analyse te optimaliseren. Hier beschrijven we weefselverwerkingsmethoden die een maximale data-output toestaan van beperkte monsters.

Werken met menselijke weefsels for Translational Cancer Research

Een eenvoudige maar effectieve methode die magnetische nanodeeltjes in dienst aan antigeen-reactieve B-cellen voor functionele en fenotypische analyse op te sporen en te verrijken wordt beschreven.

Detectie en Verrijking van zeldzame antigeen-specifieke B-cellen voor analyse van fenotype en functie

Hier beschrijven we een methode die in situ MHC-tetrameer kleuring combineert met immunohistochemistry lokalisatie, fenotype, en hoeveelheid van antigeen-specifieke T-cellen in weefsels te bepalen. Dit protocol wordt gebruikt om te bepalen van de ruimtelijke en fenotypische kenmerken van antigeen-specifieke CD8 T-cellen ten opzichte van andere celtype en structuren in de weefsels.

In Situ MHC-tetrameer kleuring en kwantitatieve analyse om te bepalen van de locatie, overvloed en fenotype van CD8 Antigen-specifieke T-cellen in weefsels

Incongruenties in menselijke leukocyten antigeen (HLA) sequenties tussen organ donor en ontvanger paren zijn de belangrijkste oorzaak van antilichaam-gemedieerde afwijzing in orgaantransplantatie. Hier presenteren we het gebruik van aangepaste antigeen arrays die zijn gebaseerd op individuele donoren HLA sequenties sonde anti-donor HLA alloantibodies orgel geadresseerden.

Gepersonaliseerd Peptide Arrays voor detectie van HLA Alloantibodies in orgaantransplantatie

We beschrijven een snelle kleuringsmethode om multispectrale beeldvorming op bevroren weefsels uit te voeren.

Een snelle methode voor multispectrale fluorescentiebeeldvorming van bevroren weefselsecties

Op volbloed gebaseerde immunoassays bieden een gemakkelijk en hulpbronnenefficiënt hulpmiddel om antigeenspecifieke immuniteit te analyseren voor diagnostische en onderzoeksdoeleinden. Dit artikel biedt een geoptimaliseerd volbloedprotocol met dubbele co-stimulatie voor uitgebreide analyse van de immuniteit van de gastheer tegen schimmel- en virale pathogenen, inclusief een versie met een laag volume voor pediatrische patiënten en kleine dieren.

Volbloedtest met dubbele co-stimulatie voor antigeenspecifieke analyse van de immuniteit van de gastheer tegen schimmel- en virale pathogenen

We bieden een gedetailleerd protocol voor het isoleren en identificeren van zeldzame antigeenspecifieke T-celpopulaties in muizenlongen door middel van T-celverrijking op basis van magnetische kralen en peptide:major histocompatibility complex (MHC)-tetrameren.

Identificatie van zeldzame antigeenspecifieke T-cellen uit muizenlongen met peptide: belangrijke histocompatibiliteitscomplextetrameren

Leer een veilige methode voor het prepareren van weefselextracten voor functionele T-celassays. Deze techniek gebruikt BAW-homogenisatie en lyofilisatie zonder giftige oplosmiddelen, waardoor T-celproliferatie en cytokinesecretie nauwkeurig gemeten kunnen worden.

Extractie van Tissue Antigens voor functionele testen

Meer video's verkennen