Meting van antilichaam Effecten op cellulaire functie van geïsoleerde cardiomyocyten

Het algemene doel van het volgende experiment is om de cardiotrope antilichamen in het plasma van patiënten met dilatief cardiomyopathie of andere hartziekten met een auto-immuun achtergrond te detecteren. Dit wordt bereikt door een initiële mini immunoabsorptie van patiëntenplasma op anti IgG spheros kolommen om immunoglobulin G als tweede stap te zuiveren. Ventriculaire cardiomyocyten worden geïsoleerd uit volwassen wistar ratten die de cellulaire basis voor deze bio-assay vormen.

Vervolgens worden de cardiomyocyten toegestaan om zich te hechten aan de kamerdeksels en gekleurd met URA 2:00 AM om de observatie van intracellulair calciumtransit tijdens contracties mogelijk te maken, vervolgens wordt het IgG van de patiënt getest om de effect erop op de contractiliteit van de cardiomyocyten te observeren. De resultaten tonen aan of het IgG van een patiënt tropische antilichamen bevat op basis van de veranderingen in contractiliteit en calciumtransit in de geïsoleerde cardiomyocyten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals standaard immunoassays voor de detectie van antilichamen is dat het onafhankelijk is van een specifiek antigeen en dat het mogelijk maakt onderscheid te maken tussen stimulerende en blokkerende antilichamen.

De procedure zal worden uitgevoerd door Google en technische assistentie van ons laboratorium. Om deze procedure te beginnen, bereid de mini immunoabsorptie kolommen voor door drie milliliter anti IgG spheros per twee milliliter patiënt EDTA plasma in een lege econopak kolom te vullen. Plaats vervolgens een filter bovenop de anti IgG spheros.

Snij de onderkant van de kolom open en druk het filter in om een stroomsnelheid van ongeveer één druppel per seconde te bereiken. Was vervolgens de kolom drie keer met één plasmavolume van 0,9% natriumchloride, pipet het plasma in de kolom wanneer het plasma volledig is gedompeld in de anti IgG Spheros was met hetzelfde volume van 0,9% natriumchloride. Pipet vervolgens één plasmavolume van 0,2 molair glycinehydrochloride bij pH 2,8 in de kolom en laat het in het phos dompelen.

Voeg vervolgens nog een volume glycinehydrochloride toe aan de kolom. Verzamel de stroom in een 15 milliliter buis en pas de pH aan op 7,3 met 0,5 molair trishydrochloride bij pH 8,0 om de kolom te regenereren. Was het vervolgens met drie plasmavolumes van glycinehydrochloride na een laatste wassing met twee volumes van 0,9% natriumchloride.

De kolom kan worden gebruikt voor de volgende plasma monster voor het gebruik op cardiomyocyten. De verzamelde IgG fractie moet worden gedialyseerd tegen experimentele buffer door de IgG fractie eerst te vullen in een cellulose ester dialyse membraanbuis met een moleculair gewicht cut-off bij 100 kilodalton. Plaats vervolgens de buis in één liter EB en roer langzaam met een magnetische roerder bij vier graden Celsius. Na acht uur, breng de dialysebuis over in drie liter vers EB en dialyseer gedurende nog eens 20 uur bij vier graden Celsius volgens dialyse.

Kook het monster gedurende 30 minuten bij 57 graden Celsius in een waterbad. Om de complement factoren te inactiveren, bepaal de totale IgG concentratie en bereid aliquots voor met elk 330 microgram IgG. Bereid in deze procedure calcium vrij isolatie buffer volgens het bijbehorende manuscript.

Vul vervolgens 80 milliliter IB in het bovenste reservoir van een thermostat lanor perfusie systeem en houd het buffer bij 37 graden Celsius en beadem het gedurende 30 minuten met 95% zuurstof, 5% kooldioxide. Los ongeveer 7.000 tot 10.000 eenheden collageenase type twee en 174 milligram vetzuurvrij BSA op in 20 milliliter. IB bevattend 112,5 micromolair calciumchloride en pas de pH van de isolatie buffer in het bovenste reservoir aan indien vereist.

Anesthetiseer vervolgens een wistar rat van 175 tot 200 gram met thiopental bij 375 microgram per kilogram met 2.500 IE heparine toegevoegd aan de thiopental oplossing. Na thoracotomie, verwijder het hart voorzichtig met een intacte aortaboog en breng het over in ijskoud, nulpunt procent natriumchloride in ijskoud natriumchloride. Verwijder het bloed en het omliggende weefsel van het hart.

Breng het vervolgens over naar vers 0,9% natriumchloride en leg de aorta bloot. Zet de flow reducer van het langor systeem aan om een druppelsnelheid van twee tot drie per seconde te verkrijgen. Bevestig vervolgens het hart aan de canule.

Perfuseer het gedurende maximaal drie minuten met een stroomsnelheid van één druppel per seconde om het resterende bloed weg te spoelen. Circuleer vervolgens de IB in het LOR systeem. Verwijder nu 20 milliliter buffer uit het bovenste reservoir.

Vul het reservoir met de collageenase oplossing en vul zoveel buffer bij als nodig is om 80 milliliter te bereiken. Circuleer vervolgens de verteringsoplossing gedurende nog eens 27 minuten. Vervolgens los je het hart van de canule.

Verwijder de atria en aorta, snijd vervolgens de ventrikels in kleine stukken. Laat de verteringsbuffer naar de onderste reservoir lopen. Verminder het volume tot maximaal 40 milliliter om de gehakte ventrikels gedurende 10 tot 15 minuten verder te verteren onder continue beademing met 95% zuurstof, 5% kooldioxide.

Filter vervolgens de celsuspensie door een 200 micron maasgrootte gaas in een 50 milliliter buis. Herstel ten slotte het calciumgehalte van de cellen door de celsuspensie te centrifugeren bij 40 3G gedurende twee minuten. Breng de cellen bij kamertemperatuur opnieuw op in 10 milliliter.

IB bevattend 200 micromolair calciumchloride centrifugeer opnieuw en breng de cellen opnieuw op in 10 milliliter. IB met 500 micromolair calciumchloride. Na een laatste centrifugatie, breng de cardiomyocyten opnieuw op in steriel gefilterd EB tot een dichtheid van 50.000 cellen per milliliter.

Bedek de dekglazen in een vier wel kamer met 10 microgram laminine per wel, en wacht tot het volledig is gedroogd. Vul vervolgens één milliliter van de cardiomyocytensuspensie in elke wel. Gebruik een micropipet met een afgesneden punt en laat de cellen gedurende één uur bij kamertemperatuur aanhechten, verdun 10 microliter van de één milligram per milliliter fira 2:00 AM stamoploss