Meting van antilichaam Effecten op cellulaire functie van geïsoleerde cardiomyocyten

Het algemene doel van het volgende experiment is het detecteren van cardiotrope antilichamen in het plasma van patiënten met dilatatiecardiomyopathie of andere hartaandoeningen met een auto-immuunachtergrond. Dit wordt bereikt door middel van een initiële mini-immunoabsorptie van patiëntenplasma op anti-IgG-spheroskolommen om immunoglobuline G in een tweede stap te zuiveren. Ventrikelcardiomyocyten worden geïsoleerd uit volwassen Wistar-ratten om de cellulaire basis voor deze bioassay te bieden.

Vervolgens krijgen de cardiomyocyten de tijd om zich te hechten aan de dekglasjes van de kamer en worden ze gekleurd met URA 2:00 AM om de observatie van intracellulaire calciumtransiënten tijdens contracties mogelijk te maken, waarna het IgG van de patiënt wordt getest om het effect ervan op de contractiliteit van de cardiomyocyten te observeren. De resultaten laten zien of het IgG van een patiënt tropische antilichamen bevat op basis van de veranderingen in contractiliteit en calciumtransiënten in de geïsoleerde cardiomyocyten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals standaard immunoassays voor de detectie van antilichamen, is dat deze onafhankelijk is van een specifiek antigeen en dat het mogelijk maakt om onderscheid te maken tussen stimulerende en blokerende antilichamen.

De procedure wordt gedemonstreerd door Google en technische ondersteuning wordt geboden door ons laboratorium. Om deze procedure te starten, bereid je de mini-immuno-adsorptiekolommen voor door drie milliliter anti-IgG-sferen per twee milliliter EDTA-plasmapatiënt in een lege econopak-kolom te vullen. Plaats vervolgens een filter bovenop de anti-IgG-sferen.

Snijd de onderste punt van de kolom open en druk op het filter om een stroomsnelheid van ongeveer één druppel per seconde te bereiken. Was vervolgens de kolom drie keer met één plasmavolume 0,9% natriumchloride. Pipetteer het plasma in de kolom; wanneer het plasma volledig in de anti-IgG Spheros is gedrenkt, wordt er gewassen met hetzelfde volume 0,9% natriumchloride. Pipetteer daarna één plasmavolume 0,2 molair glycinehydrochloride bij pH 2,8 in de kolom en laat het in de phos trekken.

Voeg vervolgens nog een volume glycinehydrochloride toe aan de kolom. Verzamel de doorstroom in een buisje van 15 milliliter en stel de pH bij naar 7,3 met 0,5 molaire trishydrochloride bij pH 8,0 om de kolom te regenereren. Was de kolom met drie plasmavolumes glycinehydrochloride na een laatste wasbeurt met twee volumes 0,9% natriumchloride.

De kolom kan worden gebruikt voor het volgende plasmamonster voor gebruik op cardiomyocyten. De verzamelde IgG-fractie moet worden gedialyseerd tegen experimentele buffer door de IgG-fractie eerst over te brengen naar een cellulose-ester dialysemembraanbuis met een molecuulgewicht-cutoff van 100 kilodaltons. Plaats de buis vervolgens in één liter EB en roer langzaam met een magnetische roerder bij vier graden Celsius. Na acht uur wordt de dialysebuis overgezet naar drie liter verse EB en gedurende nog eens 20 uur gedialyseerd bij vier graden Celsius.

Kook het monster gedurende 30 minuten bij 57 °C in een waterbad. Bepaal de totale IgG-concentratie en bereid aliquots waarbij elke aliquot 330 µg IgG bevat om de complementfactoren te inactiveren. Bereid bij deze procedure een calciumvrije isolatiebuffer volgens het bijbehorende manuscript.

Vul vervolgens 80 milliliter IB in het bovenste reservoir van een thermostat lanor perfusiesysteem en houd de buffer op 37 °C en belucht deze gedurende 30 minuten met 95% zuurstof en 5% kooldioxide. Los ongeveer 7.000 tot 10.000 units collagenase type twee en 174 milligram vetzuurvrij BSA op in 20 milliliter IB bevattend 112,5 micromol calciumchloride en pas indien nodig de pH van de isolatiebuffer in het bovenste reservoir aan.

Anestheseer vervolgens een Wistar-rat van 175 tot 200 gram met thiopental in een dosis van 375 µg/kg, waarbij 2.500 IU heparine aan de thiopentaloplossing is toegevoegd. Na de thoracotomie wordt het hart voorzichtig uitgesneden met een intacte aortaboog en overgebracht naar ijskoud 0% natriumchloride. Verwijder het bloed en het omliggende weefsel van het hart.

Breng het vervolgens over naar vers 0,9% natriumchloride en leg de aorta vrij. Zet de stroomregelaar van het langor-systeem aan om een druppelsnelheid van twee tot drie per seconde te verkrijgen. Bevestig daarna het hart aan de canule.

Perfuse dit gedurende maximaal drie minuten met een stroomsnelheid van één druppel per seconde om het resterende bloed uit te spoelen. Laat vervolgens de IB circuleren in het LOR-systeem. Verwijder nu 20 milliliters buffer uit het bovenste reservoir.

Vul het reservoir met de collagenase-oplossing en vul indien nodig buffer aan tot een totaal volume van 80 milliliters. Laat de digestie-oplossing vervolgens nog 27 minuten circuleren. Koppel daarna het hart los van de canule.

Verwijder de atria en de aorta en snijd vervolgens de ventrikels in kleine stukjes. Laat de digestiebuffer in het onderste reservoir lopen. Verminder het volume tot maximaal 40 milliliters om de gesneden ventrikels verder te verteren gedurende 10 tot 15 minuten onder continue beluchting met 95%oxygen, 5%carbon dioxide.

Filter daarna de celssuspensie door een gaas met een maaswijdte van 200 micron in een buis van 50 milliliter. Herstel tot slot het calciumgehalte van de cellen door de celsuspensie twee minuten lang te centrifugeren bij 40 3G. Resuspendeer de cellen bij kamertemperatuur in 10 milliliter.

Centrifugeer de IB die 200 micromolar calciumchloride bevat opnieuw en resuspendeer de cellen in 10 milliliters. IB met 500 micromolar calciumchloride. Na een laatste centrifugatie worden de cardiomyocyten geresuspendeerd in steriel gefilterde EB tot een dichtheid van 50 000 cellen per milliliter.

Coat de dekglasjes in een kamer met vier putjes met 10 micrograms laminine per putje en wacht tot dit volledig is opgedroogd. Vul vervolgens elke put met één milliliter van de cardiomyocytensuspensie. Gebruik hiervoor een micropipet met een afgesneden tip en laat de cellen één uur hechten bij kamertemperatuur. Verdun 10 microliters van de één milligram per milliliter fira 2:00 AM-stockoplossing in vijf milliliters eb en bewaar de kleuringsoplossing in het donker.

Verwijder vervolgens de buffer en de niet-gehechte cellen van de dekglasjes en pipetteer 0,5 milliliters van de kleuringsoplossing in elke put. Incubeer de cellen gedurende 10 minuten onder matige schudding. Verwijder daarna de kleuringsoplossing en was de cellen één keer met één milliliter eb.

Voeg vervolgens 0,5 milliliters EB toe aan elke put in deze procedure en plaats het dekglas onder een inverted fluorescentiemicroscoop die is verbonden met een registratiesysteem voor calcium en contractiliteit van myocyten. Positioneer een op maat gemaakte elektrode met een instroom- en uitstroombuis in de eerste put en spoel de cardiomyocyten met één milliliter per minuut eb.

Begin de elektrische stimulatie bij 20 volt, één hertz en een duur van vijf milliseconden per puls, en laat de cellen ongeveer twee minuten wennen aan de stimulatie. Kies een intact staafvormig cardiomyocyt met duidelijke striatie en een constante contractie en positioneer deze in het midden van het gezichtsveld. Open vervolgens het camerakanaal en oriënteer de cel horizontaal binnen het videogebied door de adapter voor de celkadering te draaien en de microscooptafel te verschuiven.

Pas de begrenzing van de detectiecontrole-elementen van het video-oppervlak aan. Schakel het fluorescentiekanaal in en registreer 10 tot 15 contracties om de initiële celverkorting en de calciumtransiënt te bepalen. Schakel daarna het lichtkanaal van de microscoop uit om bleken van de fluorescerende kleuring te voorkomen.

Schakel de doorstroming met een driewegkraan om van EB naar de monsterbypass en superfuseer de cardiomyocyten met 1 mL patiënt-IgG. Stop de pomp net voordat de lucht het putje bereikt, schakel vervolgens het lichtkanaal in en registreer nog eens 10 tot 15 contracties om de acute celrespons vast te leggen. Pauzeer daarna de opname en schakel het lichtkanaal opnieuw uit, herhaal de registraties na twee en vijf minuten en verwijder de elektrode uit het putje wanneer deze zijn voltooid; analyseer aan het einde de celverkorting en de calciumtransiënt met de IonWizard-software, gebruikmakend van respectievelijk het 'edge length/length'-venster en het 'URA two numeric subtracted/ratio'-venster.

Bereken vervolgens de procentuele veranderingen voor de acute respons, de respons na twee minuten en de respons na vijf minuten ten opzichte van de initiële celverkorting en de piekhoogte van de calciumtransiënt. Hier is een representatief voorbeeld van de controlemeting. De celverkorting en de calciumtransiënt werden online gemonitord vóór de superfusie met IgG en onmiddellijk twee minuten en vijf minuten na de superfusie met IgG.

En hier is een voorbeeld van de meting van een IgG-monster dat cardiodepressieve antilichamen bevat. Celverkorting en calciumtransiënten werden online gemeten vóór de superfusie met IgG en direct twee en vijf minuten na de superfusie met IgG. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe cardiotoxische antilichamen in patiëntenplasma kunnen worden gedetecteerd door het effect van geïsoleerd IgG op de celverkorting en calciumtransiënt van geïsoleerde volwassen rode cardiomyocyten te meten.