Name: Granulocyt-afhankelijke auto-antilichaam-geïnduceerde blaarvorming (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 23 s
Description: Leer hoe huidblaarvorming wordt geïnduceerd bij muizen door passieve overdracht van antilichamen tegen collageen VII. Deze methode repliceert de fenotypische en histopathologische kenmerken van humane epidermolysis bullosa acquisita.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs erkennen ondersteuning door subsidies van de Deutsche Forschungsgemeinschaft SI-1281/4-1 en BIOSS van de Medische Faculteit van de universiteit van Freiburg (CS).

1. Voorbereiding van Pathogene Antilichaam Opmerking: zuivering en concentratie van de antilichamen worden uitgevoerd op dezelfde dag als antilichamen niet worden opgeslagen in 0,1 M glycine pH van 2,5-3 (elutiebuffer) gedurende de nacht (ON). Affiniteitszuivering van IgG: gebruik 25 ml immune konijnenserum: <ol><li> Ontdooi de konijnenserum ON bij 4 ° C, mengen 1:1 met 1xPBS (loopbuffer) en Centrifugeer bij 1260 g gedurende 10 min bij 20 ° C. Eventueel kan een filtratiestap met filtreerpapier worden opgenomen na centrifugeren bij het serum vet is. </li><li> Ondertussen was de proteïne G matrix kolom gevuld met 10 bed volumes (bedvolume = matrix volume) van 1XPBS (lopende buffer). </li><li> Breng de verdund en gefiltreerd serum aan de kolom en incubeer 1 uur op de schommelende platform bij kamertemperatuur (RT). </li><li> Verzamel de doorstroom (FT) in een 50 ml tube Flacon. Gooi het tot de concentratieen titer van de gezuiverde IgG bekend. </li><li> Was de matrix met 5 bedvolumes 1XPBS en in de tussentijd 50 ml Falcon buizen voor te bereiden voor het verzamelen van de geëlueerde IgG-fractie. Pipetteer 1 ml pH neutraliserende buffer: 1 M TRIS pH 10 in elke buis (anders de verhouding van 1:20 TRIS buffer opzichte van de hoeveelheid eluaat te verzamelen). </li><li> Toepassing 100-150 ml elutiebuffer: 0,1 M glycine pH van 2,5-3 de kolom en verzamel 50 ml fractie (s). Draai de buis 2-3x, het meten van de pH-waarde en voeg neutraliserende buffergeheugen totdat u hebt bereikt de pH 7,2-7,4. </li><li> Verzamel enkele druppels IgG eluaat en met de elutiebuffer als etalon de OD te meten bij 280 nm. Als de OD is &lt;0,1 stop verzamelen. </li><li> Regenereren proteïne G matrix en bewaar de instructies van de fabrikant. </li></ol> Concentratie door ultrafiltratie met Amicon tubes: <ol><li> Was de Amicon Ultra (15 ml / 30 kDa) ultrafiltratie buizen met 1XPBS door centrifugeren 15-20 minbij 3.220 xg bij 4 ° C. Gooi de FT van de Amicon. </li><li> Vul de Amicons met 15 ml geëlueerde IgG fractie en centrifugeer gedurende 25-30 min bij 3.220 xg en 4 ° C; centrifugeertijd altijd afhankelijk van het eiwitgehalte van het eluaat. </li><li> Gooi FT en herhaal ultrafiltratie tot je hebt geen geëlueerde fractie verlaten. </li><li> Was de geconcentreerde IgG uitgebreid, tweemaal, met 1XPBS 25-30 min. door centrifugeren. </li><li> Verzamel de &quot;sticky&quot; gelige antilichaamoplossing uit de Amicon filter in een eindvolume van 1500-2000 ui 1XPBS. </li><li> Meet de concentratie van IgG preparaat met behulp van een spectrofotometer of NanoDrop: Conc. (Mg / ml) = A (280 nm) x verdunningsfactor / 1,4 </li><li> Wassen en opslaan Amicons de instructies van de fabrikant. </li></ol> 2. Injectie van collageen VII-specifieke IgG in Mice Voor het eigenlijke experimentele procedure, zorg ervoor dat de experimentele proprotocol is geschreven en alle materialen worden voorbereid voor het experiment. <ol><li> Bereid de data sheets voor de ziekte scoren, ELISA, immunofluorescentie (IF) analyse en myeloperoxidase (MPO) test 4. </li><li> Label de buizen voor bloed en organen, cryomolds en histologie verwerking en inbedding cassettes. </li><li> Het antilichaam oplossingen worden bereid vers of ontdooid uit voorraden en gekarakteriseerd met betrekking tot hun reactiviteit (titer door IF microscopie en / of ELISA). De steriele gefilterde antilichaam oplossing worden verdund in PBS zodanig dat de vereiste dosis voor injectie varieert tussen 250-1000 ui. Zorg ervoor dat u voldoende IgG aan het hele experiment uit te voeren. </li><li> Bereid anticoagulant: heparine 20 U / ml en 8,7 mg / ml ketamine / 1,3 mg / ml xylazine mengsel anesthesie. Wanneer het opofferen van de muizen buizen gelabeld met 3,7% formaldehyde bereid. </li><li> Steriliseer chirurgische instrumenten (scalpel, schaar, fijne punt en Curved forcipes) en de voorbereiding van spuiten (insuline spuiten, 1 en 2 ml spuiten), naalden, digitale camera en extra geheugenkaart. </li></ol> Let op: Voer alle procedures op ketamine / xylazine of isofluraan verdoofd muizen Isofluraan de voorkeur verdoving optie voor de dagelijkse verzorging controles, zoals muizen snel te herstellen.. Echter, bij het ​​nemen van foto&#39;s, 87 mg / kg ketamine en 13 mg / kg xylazine gewoonlijk subcutaan geïnjecteerd. Voor euthanasie de ketamine / xylazine dosering verhoogd tot 130 mg / kg ketamine en 20 mg / kg xylazine. <ol><li> Controleer de reeds gemarkeerde dieren voor hun algemene gezondheidstoestand, de huid en de vacht voorkomen, wegen en meten hun oor dikte (altijd vasthouden aan hetzelfde oor). </li><li> Registreer waargenomen waarden en veranderingen in de klinische evaluatie sheet. </li><li> Verzamel 20-30 pl (2-3 druppels) bloed uit de staartader in een spuit met hetzelfde volume van antistollingsmiddel. </li><li> Desinfecteer de vacht enhuid met 80% ethanol. </li><li> Injecteer het antilichaam oplossing subcutaan in de rug met behulp van een insulinespuit. (Voor bepaalde plekken (zoals de oren) slechts kleine hoeveelheden (10-50 pi) die haalbaar zijn om te worden geïnjecteerd.) </li></ol> Injecties moeten worden herhaald om de tweede dag, 4 keer. Balb / c en C57BL6 muizen van een lichaamsgewicht van ongeveer 20 g begint de ziekte ontwikkelen 3-4 dagen na de eerste toediening van 400-500 tot 750 ug / g lichaamsgewicht / injectie autoantilichamen. Bij het afwerken van het experiment: <ol><li> Zet de muizen onder diepe narcose door injectie 130 mg / kg en 20 mg / kg ketamine / xylazine subcutaan, exsanguinate ze de posterior vena cava en knip het hart uit. </li><li> Verzamel organen / weefsels monsters, zoals de huid: staart, oren, bloed en slokdarm en zet ze in eerder gelabeld en PBS of 3,7% formaldehyde gevulde buisjes. </li></ol> Bij terugkeer naar delaboratorium: <ol><li> Centrifugeer het bloed op 1.200 xg, 10 min bij RT om afzonderlijke plasma, de overdracht van de plasma correct geëtiketteerd buizen en dienovereenkomstig te slaan. </li><li> Embedden de huid biopsie in optimale cut Temperatuur medium met behulp van cryomolds, goed label en bewaar ze bij -80 ° C. </li><li> Plaats de weefselmonsters bestemd voor histologie in het gelabelde inbedding mallen en bewaar ze op 3,7% formaldehyde tot paraffine inbedding. </li></ol> 3. Klinische evaluatie van ernst van de ziekte Muizen moet dagelijks worden onderzocht op beschadigingen van huid en slijmvliezen en de bevindingen moeten worden geregistreerd met behulp van passende vormen. De criteria voor vroege euthanasie huidletsels bij meer dan 20% van het lichaamsoppervlak en een gewichtsverlies van 5-10% van het totale lichaamsgewicht in drie opeenvolgende dagen gerekend voor een ziekte score van 5 (tabel 1). <ol><li> Plaats de muis op zijn buik. Begin met het hoofd gebied, namelijk met de juisteoor en controleer blaren, erosie, korst aan de binnenzijde als aan de buitenzijde. Ga op dezelfde manier met het linker oor. </li><li> Rechts en links de ogen worden gecontroleerd op tekenen van erytheem, alopecia, erosies en / of korst. </li><li> Voorhoofd en snuit gebied worden geborsteld door volgende, verder te gaan met het ventrale deel van de snuit, lippen en het slijmvlies van de mond. </li><li> Onderzoek de rechter voorpoot vanaf de poot, het verplaatsen naar boven, naar het linker voorpoot. Dezelfde procedure met de rechter en linker achterpoten. </li><li> Borstel door de vacht op de hals en rug met een gebogen fijne punt tang. </li><li> Draai de muis op de rug en controleer de ventrale deel en de ventrale kanten van de benen op dezelfde manier als eerder. </li><li> Controleer de staart. </li><li> Neem foto&#39;s van de relevante delen van het lichaam waar de muizen ontwikkelen ziekte. Er moet aandacht worden besteed aan de kwaliteit en kwantiteit van de foto&#39;s. </li><li> Bereken de klinische ziekte scores. </li></ol> 4. Analyse van de Huid en plasmamonsters <ol><li> Bereid, opslaan en / of verwerken van alle verzamelde weefsels volgens het plan. </li><li> Snijd bevroren weefsel secties voor IF detectie van konijn antilichamen en muis complement systeem componenten. </li><li> Analyse van de verschillende eiwitten en enzymgehalte (MPO assay) van bevroren weefsel en / of orgaan extracten. </li><li> Gedeelte paraffine ingebed weefsel en kleuren met H &amp; E de mate van weefselbeschadiging te visualiseren. </li><li> Analyseren plasma door ELISA, immunoblot. </li></ol>

<ol><li>Sitaru, C., Mihai, S., Otto, C., Chiriac, M. T., Hausser, I., Dotterweich, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+dermal-epidermal+separation+in+mice+by+passive+transfer+of+antibodies+specific+to+type+VII+collagen%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Induction of dermal-epidermal separation in mice by passive transfer of antibodies specific to type VII collagen.</a> J. Clin. Invest. 115, 870-878 (2005).</li>
<li>Kopecki, Z., Arkell, R. M., Strudwick, X. L., Hirose, M., Ludwig, R. J., Kern, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+Flii+gene+increases+dermal-epidermal+blistering+in+an+autoimmune+ColVII+mouse+model+of+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the Flii gene increases dermal-epidermal blistering in an autoimmune ColVII mouse model of epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 225, 401-413 (2011).</li>
<li>Kulkarni, S., Sitaru, C., Jakus, Z., Anderson, K. E., Damoulakis, G., Davidson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K%CE%B2+plays+a+critical+role+in+neutrophil+activation+by+immune+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Signal%22%5BJournal%5D)">PI3Kβ plays a critical role in neutrophil activation by immune complexes.</a> Sci. Signal. 4, 23-23 (2011).</li>
<li>Chiriac, M. T., Roesler, J., Sindrilaru, A., Scharffetter-Kochanek, K., Zillikens, D., Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+is+required+for+neutrophil-dependent+autoantibody-induced+tissue+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent autoantibody-induced tissue damage.</a> J. Pathol. 212, 56-65 (2007).</li>
<li>Mihai, S., Chiriac, M. T., Takahashi, K., Thurman, J. M., Holers, V. M., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+alternative+pathway+of+complement+activation+is+critical+for+blister+induction+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The alternative pathway of complement activation is critical for blister induction in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Immunol. 178, 6514-6521 (2007).</li>
<li>Sesarman, A., Sitaru, A. G., Olaru, F., Zillikens, D., Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+Fc+receptor+deficiency+protects+from+tissue+injury+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Neonatal Fc receptor deficiency protects from tissue injury in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Mol. Med. 86, 951-959 (2008).</li>
<li>Huang, X. R., Holdsworth, S. R., Tipping, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th2+responses+induce+humorally+mediated+injury+in+experimental+anti-glomerular+basement+membrane+glomerulonephritis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Th2 responses induce humorally mediated injury in experimental anti-glomerular basement membrane glomerulonephritis.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 8, 1101-1108 (1997).</li>
<li>Matsumoto, I., Staub, A., Benoist, C., Mathis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arthritis+provoked+by+linked+T+and+B+cell+recognition+of+a+glycolytic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Arthritis provoked by linked T and B cell recognition of a glycolytic enzyme.</a> Science. 286, 1732-1735 (1999).</li>
<li>Oswald, E., Sesarman, A., Franzke, C., Wölfle, U., Bruckner-Tuderman, L., Jakob, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+flavonoid+luteolin+inhibits+Fc%CE%B3-dependent+respiratory+burst+in+granulocytes%2C+but+not+skin+blistering+in+a+new+model+of+pemphigoid+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The flavonoid luteolin inhibits Fcγ-dependent respiratory burst in granulocytes, but not skin blistering in a new model of pemphigoid in adult mice.</a> PLoS One. 7, e31066(2012).</li>
<li>Liu, Z., Diaz, L. A., Troy, J. L., Taylor, A. F., Emery, D. J., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+passive+transfer+model+of+the+organ-specific+autoimmune+disease%2C+bullous+pemphigoid%2C+using+antibodies+generated+against+the+hemidesmosomal+antigen%2C+BP180%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">A passive transfer model of the organ-specific autoimmune disease, bullous pemphigoid, using antibodies generated against the hemidesmosomal antigen, BP180.</a> J. Clin. Invest. 92, 2480-2488 (1993).</li>
<li>Anhalt, G. J., Labib, R. S., Voorhees, J. J., Beals, T. F., Diaz, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pemphigus+in+neonatal+mice+by+passive+transfer+of+IgG+from+patients+with+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Induction of pemphigus in neonatal mice by passive transfer of IgG from patients with the disease.</a> N. Engl. J. Med. 306, 1189-1196 (1982).</li>
<li>Toyka, K. V., Brachman, D. B., Pestronk, A., Kao, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myasthenia+gravis%3A+passive+transfer+from+man+to+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myasthenia gravis: passive transfer from man to mouse.</a> Science. 190, 397-399 (1975).</li>
<li>Rose, N. R., Bona, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+criteria+for+autoimmune+diseases+%28Witebsky%27s+postulates+revisited%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Today%22%5BJournal%5D)">Defining criteria for autoimmune diseases (Witebsky's postulates revisited.</a> Immunol. Today. 14, 426-430 (1993).</li>
<li>Sitaru, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Experimental models of epidermolysis bullosa acquisita.</a> Exp. Dermatol. 16, 520-531 (2007).</li>
<li>Sitaru, C., Kromminga, A., Hashimoto, T., Bröcker, E. B., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+to+type+VII+collagen+mediate+Fcgamma-dependent+neutrophil+activation+and+induce+dermal-epidermal+separation+in+cryosections+of+human+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies to type VII collagen mediate Fcgamma-dependent neutrophil activation and induce dermal-epidermal separation in cryosections of human skin.</a> Am. J. Pathol. 161, 301-311 (2002).</li>
<li>Sesarman, A., Oswald, E., Chiriac, M. T., Csorba, K., Vuta, V., Feldrihan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+human+pemphigoid+autoantibodies+do+not+trigger+disease+by+the+passive+transfer+into+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Why human pemphigoid autoantibodies do not trigger disease by the passive transfer into mice.</a> Immunol. Lett. , (2012).</li>
<li>Ishii, N., Recke, A., Mihai, S., Hirose, M., Hashimoto, T., Zillikens, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibody-induced+intestinal+inflammation+and+weight+loss+in+experimental+epidermolysis+bullosa+acquisita%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autoantibody-induced intestinal inflammation and weight loss in experimental epidermolysis bullosa acquisita.</a> J. Pathol. 224, 234-244 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De passieve overdracht van antistoffen in proefdieren is een belangrijke benadering voor het demonstreren van hun pathogeniciteit 7, -12. Diermodellen verkregen door deze methode, naast het feit dat het indirect bewijs voor autoimmuniteit 13, zodat het onderzoek van de efferente fase van de pathogenese. De passieve transfer model van antilichaam-geïnduceerde granulocyt-afhankelijke blaarvorming van epidermolysis bullosa acquisita (EBA) werd gebruikt om de mechanismen van weefselschade in autoimmune...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> recombinant antigen </td><td></td><td></td><td> De plasmiden coderen voor de recombinante vormen van murine collageen VII zijn bij de desbetreffende auteur. </td></tr><tr><td> immuun konijnenserum </td><td> <a href="http://www.eurogentec.com/" target="_blank">www.eurogentec.com</a> </td><td></td><td> We hadden New Zealand White konijnen geïmmuniseerd met 200 ug antigeen, 3 keer op 2 weken. Hiervoor hebben we gebruik gemaakt van de diensten van Eurogentec SA, België. </td></tr><tr><td> Proteïne G agarose </td><td> Roche Applied Science </td><td> 11243233001 </td><td></td></tr><tr><td> Balb / c muizen </td><td> Charles River Laboratories </td><td></td><td></td&gt; </tr><tr><td> Oktober verbinding, Tissue-Tek </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4583 </td><td> LGO, optimale snijtemperatuur </td></tr><tr><td> Cryomold standaard </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4557 </td><td> 25 mm x 20 mm x 5 mm </td></tr><tr><td> Cryomold intermediaire </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4566 </td><td> 15 mm x 15 mm x 5 mm </td></tr><tr><td> Uni-Link-Einbettkassette </td><td> R. Langenbrinck </td><td> 09 tot 0503 </td><td> Histologie verwerking en inbedcassettes </td></tr><tr><td> Spezial-Tatowierfarbe Schwarz </td><td> H. Hauptnerund &amp; Richard Herberholz GmbH &amp; Co KG </td><td> 71492000 </td><td> tatoeëren pasta </td></tr><tr><td> Tatowierzange TZ1 </td><td> Ebeco E. Becker &amp; Co GmbH </td><td></td><td> tatoeëren apparaat </td></tr><tr><td> Heparine </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> 7692,1 </td><td></td></tr><tr><td> Formaldehyde 37% </td><td> Carl Roth GmbH &amp; Co </td><td> 7386 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamine hydrochloride </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> K2753-1G </td><td></td></tr><tr><td> Xylazinehydrochloride </td><td> Sigma-Aldrich Chemie GmbH </td><td> X1251-1G </td><td></td></tr><tr><td> steriele PBS </td><td> Biochrom </td><td> L182-50 </td><td></td></tr><tr><td> digitale camera </td><td> Nikon </td><td> Coolpix 5400 </td><td></td></tr><tr><td> Injectiespuit aangedreven filtereenheid 0,45 urn </td><td> Millipore </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Caliper </td><td> Mitutoyo 7309 </td><td> 1667338 </td><td> Farnell (distributeur) </td></tr><tr><td> ziekte scoreblad </td><td></td><td></td><td> Bijvoorbeeld kastsed </td></tr></tbody></table>

granulocyt-afhankelijke auto-antilichaam-geïnduceerde blaarvorming

Granulocyte-dependent Autoantibody-induced Skin Blistering

Auto-immune verschijnselen optreden bij gezonde personen, maar als zelf-tolerantie mislukt, de auto-immune reactie kan resulteren in specifieke pathologie. Volgens Witebsky postulaten, een van de criteria in de diagnose van auto-immuun ziekte als de reproductie van de ziekte bij proefdieren door passieve overdracht van autoantilichamen. Voor epidermolysis bullosa acquisita (EBA), een prototype orgaanspecifieke auto-immuunziekte van huid en slijmvliezen werden verschillende experimentele modellen onlangs. In het diermodel beschreven in onze huidige werk gezuiverde IgG antilichamen tegen een stuk van 200 aminozuren (aa 757-967) van collageen VII herhaaldelijk geïnjecteerd in muizen reproduceren blaarvorming fenotype en de histo-en immunopathologische kenmerken vertonen de menselijke EBA 1. Volwaardige wijdverspreide ziekte wordt meestal 5-6 dagen na de eerste injectie en de omvang van de ziekte correleert met de dosis van de toegediende collagen VII-specifieke IgG. De weefselbeschadiging (blaarvorming) in de experimentele EBA is afhankelijk van de rekrutering en activering van granulocyten door weefsel-gebonden antistoffen 2, -4. Daarom dit model het mogelijk om de ontleding van de granulocyt-afhankelijke inflammatoire pathway betrokken bij de auto weefselbeschadiging als model reproduceert alleen de T-cel-onafhankelijke efferente fase van de auto-immuunreactie. Verder wordt de waarde onderstreept door een aantal studies waaruit de blister-inducerende vermogen van autoantilichamen in vivo onderzoeken en het mechanisme van de blaarvorming in EBA 1,3, -6. Tenslotte zal dit model sterk de ontwikkeling van nieuwe anti-inflammatoire therapieën in autoantilichaam-geïnduceerde ziekten. Over het geheel genomen de passieve overdracht diermodel van EBA is een toegankelijke en leerzaam ziekte model en zal onderzoekers helpen om niet alleen EBA pathogenese te analyseren, maar om te antwoorden fundamenteel biologisch en klinischessentiële auto-immuniteit vragen.

De passieve overdracht van antigeen specifieke antilichamen resulteert in een full blown ziekte in muizen, die lijkt op de klinische, histologische en immunopathologische niveaus van de menselijke EBA. Blaren, korsten, erosies en alopecia ontwikkelen op de oren, snuit, poten, benen, rug en rond de ogen van de muizen. De eerste klinische tekenen van de ziekte zal waarschijnlijk op de oren en / of hoofdgebied. Depositie van specifieke konijn IgG, en de muis complement C3 wordt gedetecteerd door directe IF op de huid epide...

In het diermodel beschreven in onze huidige werk gezuiverde IgG antilichamen tegen een stuk van 200 aminozuren (aa 757-967) van collageen VII herhaaldelijk geïnjecteerd in muizen reproduceren blaarvorming fenotype en de histo-en immunopathologische kenmerken vertonen de menselijke epidermolysis bullosa acquisita (EBA)<sup&gt; 1</sup&gt;.

Granulocyt-afhankelijke auto-antilichaam-geïnduceerde blaarvorming

Auto-immuunfenomenen komen voor bij gezonde personen, maar wanneer de zelf-tolerantie faalt, kan de auto-immuunrespons leiden tot specifieke pathologie. Volgens ...

Ik ben Cassian RO van de afdeling Dermatologie aan de Universiteit van Fryberg, Duitsland. Het onderzoek van ons laboratorium is gericht op de pathogenese van auto-immuunhuidaandoeningen. Een van de auto-immuunziekten waarin wij geïnteresseerd zijn, is Epidermolysis QUISTA of EBAA; dit is een organspecifieke auto-immuunziekte met een goed gedefinieerd antigeen-auto-antilichaamsysteem, waarvoor wederzijds complementaire ex-vivo en diermodellen beschikbaar zijn.De blaarvorming bij EBA kan worden gereproduceerd door middel van passieve overdracht van antilichamen tegen collageen type zeven naar muizen. In dit videoartikel presenteren we daarom de inductie en analyse van huidblaarvorming bij muizen door passieve overdracht van collageen zeven-specifieke antilichamen. Hallo, ik ben King OBA van de CAS Group van de afdeling Dermatologie aan het University Hospital van Freiburg.In deze video demonstreeren wij hoe het experimentele muismodel voor EBA wordt geïnduceerd door de passieve overdracht van pathogene auto-antilichamen. We maken gebruik van deze procedure bij het onderzoeken van mogelijke pathomechanismen bij auto-immune huidaandoeningen of bij het zoeken naar pathogene epitopen. Bij het opzetten van het passieve overdrachtsmodel voor EBA moeten enkele aanvullende stappen worden uitgevoerd voorafgaand aan de injectie van auto-antilichamen in wild-type BALB/c-muizen.Als eerste stap worden witte konijnen subcutaan geïmmuniseerd met het gezuiverde recombinante antigeen. Totaal IgG uit konijnenserum wordt geïsoleerd via affiniteitskolomchromatografie en vervolgens in wild-type muizen geïnjecteerd. De injecties worden om de dag vier keer subcutaan toegediend, en er wordt om de twee dagen bloed afgenomen.De muizen worden dagelijks onderzocht op hun algemene conditie en op tekenen van cutane laesies. Tijdens het experiment worden voor elk individu klinische scores berekend die de ziekteactiviteit weerspiegelen; twee weken na de eerste injectie worden de dieren geofferd, waarna serummonsters en huidbiopsieën worden afgenomen en verder geanalyseerd. Na de incubatietijd wordt een kolom in een verticaal steunrek geplaatst, wordt de onderkant geopend, en wordt er op getikt om de doorstroom op te vangen.Bewaar in 50 ml Falcon-buisjes het doorstroomvolume totdat de immunofluorescentie-analyse bevestigt dat het een specifiek antilichaam-vrij concentraat betreft; verdun IgG door ultrafiltratie in speciale Amicon-buisjes bij 3.220 ×g gedurende 30 minuten bij 4 °C. De concentratie wordt bereikt door het eluaat door een filter te laten lopen, het doorstroomvolume weg te gooien, de buis opnieuw te vullen en dit te herhalen totdat er geen eluaat meer over is. Was als laatste stap met 1× PBS, verzamel het geelachtige, stroperige geconcentreerde IgG, meet de concentratie en bewaar dit in correct gelabelde buisjes.Voordat u begint met de eigenlijke injectie van de autoantilichamen, bepaalt u hun specificiteit en hun titer via indirecte immunofluorescentie. Incubeer cryosneden van normale mild-huid met seriële verdunningen van de geconcentreerde IGT-preparatie en visualiseer de depositie hiervan met een passend gelabeld secundair antilichaam door foto's te maken voordat u naar de dierfaciliteit gaat. Zorg ervoor dat het dierprotocol is opgesteld en dat alle materialen zijn voorbereid.Databladen voor de klinische score van de ziekteactiviteit, gelabelde buizen voor bloed- en weefselmonsters. Antilichaamoplossing verdund zodat het juiste volume kan worden geïnjecteerd. Verse antistollingsmiddelen en anesthetica, gesteriliseerde chirurgische instrumenten en spuiten.Een schuifmaat en een digitale camera moeten ook op de checklist worden opgenomen. Na het reinigen van het werkoppervlak en het voorbereiden van de isofluoraaninstallatie, dient de spuit voor de bloedafname te worden hepariniseren en een insulinespuit te worden gevuld met de antilichaamoplossing. Haal de muis uit de kooi, controleer het identificatienummer en weeg deze.Schrijf alle gemeten en geobserveerde gegevens in het persoonlijke datablad en klinische scoringsblad van de muizen. Wanneer de muis zich al in een staat van ssis bevindt, meet dan de oordikte en controleer vervolgens het uiterlijk van de huid en vacht van het dier. Besteed speciale aandacht aan het hoofdgebied, de rug, de buik en de ledematen.Neem bloed uit de staartvene via een kleine incisie in het bovenste derde deel; desinfecteer de vacht en injecteer de IgG-oplossing voorzichtig subcutaan door de huid op de rug op te tillen. Centrifugeer het bloed na terugkeer in het laboratorium gedurende 10 minuten bij 1.200 ×g bij kamertemperatuur om het serum te verkrijgen. Draag het monster over naar correct gelabelde buizen en bewaar deze volgens het plan.Controleer de muizen dagelijks op tekenen van ziekte zodra ze erytheem, alopecia en huidlaesies beginnen te ontwikkelen. Evalueer naast het meten van het gewicht ook de ziekteactiviteit. Injecteer subcutaan een mengsel van ketamine en xylazine om de muis onder narcose te brengen.Meet de oordikte en begin vervolgens met de algemene lichaamscontrole. Gebruik gebogen pincetten met fijne punten om door de vacht te strijken in de tegenovergestelde richting van de haargroei om eventuele aangedane plekken bloot te leggen. Werk zo rondom het gezicht.Beweeg de snuit bij het oog richting het buitenste en binnenste gedeelte van het oor, en controleer vervolgens ook de andere kant van de kop. Ga verder met het slijmvlies van de mondholte, het ventrale gedeelte van de snuit en het buikgebied. Controleer daarna het dorsolaterale, dorsale en nekgebied, evenals de voor- en handledematen.Kwantificeer de omvang van de laesies in het verslag; noteer de bevindingen in het formulier op basis van het bedekte huidareaal, het percentage van specifieke lichaamsdelen en regio's in vergelijking met het totale huidoppervlak van de muis. Er wordt een klinische ziekte-score berekend op basis van het totale aangetaste oppervlak van de huid en het slijmvlies. Maak tot slot foto's van relevante lichaamsdelen en zieke gebieden.Aan het einde van het experiment worden de dieren geofferd onder diepe narcose en worden bloed- en weefselmonsters verzameld. In deze experimentele setting worden het meest frequent de oren, de staart en de slokdarm afgenomen. Snijd de huidbiopten van de laesies in kleinere reepjes.Plaats ze in cassettejes voor histologische verwerking en insluiting en bewaar ze in 3,7% formaldehyde tot aan de insluiting in paraffine. Verwerk de monsters vervolgens voor h&amp;e-kleuring voor immunofluorescentieanalyse. Sluit de stroken perale huid in Optimal Cutting Temperature-medium in en gebruik een cryostaat om coupes van zes micrometer te snijden.Voer een directe immunofluorescentieanalyse uit om de weefselgebonden specifieke konijnenantilichamen en muizencomplementcomponenten te visualiseren; voer daarnaast een ELISA-assay uit met microtitratieplaten gecoat met recombinant antigeen en seriële verdunningen van het muisenserum om de spiegels van circulerende autoantilichamen te meten. De passieve overdracht van collageen zeven-specifieke antilichamen resulteert in een volledig ontwikkelde ziekte bij muizen die op klinisch, histologisch en immunopathologisch niveau overeenkomt. De menselijke EBA-blaren, korsten, erosies en alopecia ontwikkelen zich op het oor, rond de ogen, de snuit, de poten, de poten en de rug van de muizen.De ziekteactiviteit, die gedurende het experiment een stijgende tendens vertoont, wordt berekend op basis van het aangetaste oppervlak van de huid en het slijmvlies. Representatieve resultaten die de depositie van specifiek konijn-IgG en muiscomplement C3 weergeven, gedetecteerd door indirecte immunofluorescentie bij de dermale-epidermale junctie. Hier worden cryosneden van periale huid getoond.Er werd geen IgG of complement C3 gedetecteerd in de controles. De daaropvolgende histologische analyse van de laesionele huid onthult subepidermale blaren en inflammatoir infiltraat. Echter, bij de uitgevoerde controles is geen vorming van subepidermale blaren waargenomen.Zoals hier wordt aangetoond, zal het model van autoantilichamen die subepidermale blaarvorming veroorzaken, de dissectie van de ROS-afhankelijke inflammatoire pathways die door autoantilichamen worden getriggerd en leiden tot weefselschade, aanzienlijk vergemakkelijken. Het robuuste ontwerp en het eenvoudige protocol maken het model daarnaast geschikt voor de ontwikkeling en het testen van nieuwe anti-inflammatoire therapieën bij auto-antilichaam-geïnduceerde ziekten.

granulocyte-dependent-autoantibody-induced-skin-blistering

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Dermatitis herpetiformis (DH) is een chronische inflammatoire aandoening die wordt gekenmerkt door een auto-immune reactie tussen IgA en epidermale transglutaminase (ETG). DH ontwikkelt zich in een heel klein deel van gluten-gevoelige en / of patiënten met coeliakie. De resultaten van deze studie geven aan dat DH ook kunnen ontwikkelen in een resusaap gastheer met symptomen van idiopatic dermatitis.

Erkenning van Epidermale Transglutaminase door IgA en tissue transglutaminase 2 antilichamen in een zeldzaam geval van Rhesus Dermatitis

Indirecte immunofluorescentie (IIF) assays traditioneel gebruikt voor de detectie van antinucleaire antilichamen (ANA) in menselijk serum. De aanwezigheid van deze antilichamen kunnen helpen bij de diagnose van systemische auto reumatische aandoeningen (SARD). Dit protocol laat zien hoe effectief uit te voeren de IIF techniek om deze autoantilichamen nauwkeurig te detecteren.

Anti-nucleaire antilichaam screening met HEp-2 cellen

De overdracht van bm12-lymfocyten naar een C57BL/6-ontvanger is een gevestigd model van systemische lupus erythematosus. Hier beschrijven we hoe de ziekte kan worden geïnitieerd met behulp van dit model en hoe T-folliculaire helpercellen, germinale centrum B-cellen en plasmacellen kunnen worden gekenmerkt door middel van flowcytometrie.

De bm12 Induceerbare model van systemische lupus erythematosus (SLE) in C57BL / 6 muizen

Hier bieden we een demonstratie van het model van de cutane terugroepen zuig blister. Het model biedt een eenvoudige toegang tot het bestuderen van de menselijke in vivo adaptieve immuunresponsen, bijvoorbeeld in het kader van de ontwikkeling van een vaccin.

Een zuig Blister-Protocol om menselijke T-cel Recall reacties In Vivo te studeren

Dit protocol beschrijft de generatie van gemengde lymfkliertest beenmerg chimaeren met spontane auto-immune germinal centra, in welke autoreactieve lymfocyten een photoactivatable groen fluorescent proteïne (PA-GFP) verslaggever dragen. Dit biedt de mogelijkheid om de cellulaire verbindingsplaats in weefsels met stroomafwaartse moleculaire en functionele analyses.

Individuele autoreactieve Germinal Centers door Photoactivation in een gemengd chimeer Model van Autoimmunity ondervragen

De basofiele activeringstest is een aanvullende in vitro diagnostische test voor de evaluatie van IgE-gemedieerde allergische reacties op basis van de detectie van basofiele activering in aanwezigheid van een specifieke stimulus door de meting van activeringsmarkers door flowcytometrie.

Basofiele activeringstest voor allergiediagnose

De studie toont de rol van de huid aan bij het moduleren van immuunresponsen bij muizen door middel van epicutane (EC) immunisatie. EC-immunisatie met een eiwitantigeen kan immuunresponsen bij contactovergevoeligheid onderdrukken of door de huid geïnduceerde onderdrukking omkeren in combinatie met pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen. EC-immunisatie is veelbelovend als een effectieve, naaldvrije benadering van immunotherapie.

Muizenmodel van epicutaan geïnduceerde immunomodulatie

Huidlaesies zijn veel voorkomende en belangrijke kenmerken bij veel reumatische aandoeningen, en biopsie met pathologische analyse speelt een cruciale rol bij de diagnose. Dit artikel geeft een gedetailleerd overzicht van de gestandaardiseerde huidbiopsieprocedure en, met discoïde lupus erythematosus als voorbeeld, belicht de essentiële rol van dermatopathologie bij het diagnosticeren van reumatische aandoeningen.

Huidbiopsie voor het diagnosticeren van discoïde lupus erythematosus

Optimalisatie van de experimentele hamster model voor cutane leishmaniasis door intradermale injectie...

Cutane leishmaniasis in het dorsale huid van Hamsters: een bruikbaar model voor de screening van antileishmaniale Drugs

Dit artikel beschrijft een methode om de vorming van een HIV-1 envelop geïnduceerde virologische synaps op glas ondersteund vlakke dubbellagen door totale interne reflectie fluorescentie (TIRF) microscopie visualiseren. De werkwijze kan ook worden gecombineerd met immunofluorescentiekleuring tot activering en herverdeling van signaalmoleculen die tijdens HIV-1-geïnduceerde envelop virologische synapsvorming detecteren.

Imaging van HIV-1 Envelope-geïnduceerde Virologische Synapse en signalering op synthetische lipidendubbellagen

Leer hoe huidblaarvorming wordt geïnduceerd bij muizen door passieve overdracht van antilichamen tegen collageen VII. Deze methode repliceert de fenotypische en histopathologische kenmerken van humane epidermolysis bullosa acquisita.

Granulocyt-afhankelijke auto-antilichaam-geïnduceerde blaarvorming

Meer video's verkennen