Twee-en drie-dimensionale live cell imaging van DNA schade respons Eiwitten
28 september 2012
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het visualiseren van een DNA dubbelstrengs breuken signaleringeiwit geactiveerd in reactie op DNA schade en de lokalisatie tijdens mitose.
Deze demonstratie gebruikt twee- en 3D live cel beeldvorming om de ruimtelijk-tijdelijke relaties van eiwitten die betrokken zijn bij de DNA-schaderespons te begrijpen. Eerst transfecteer of transduceer je cellijn van keuze met expressieconstructen die geschikte fluorescente markers bevatten. Hierbij worden M Cherry en GFP gebruikt. Vervolgens wordt een reeks controlevideo's gemaakt waarin de fluorescent gelabelde cellen onder normale omstandigheden worden getoond.
Vervolgens wordt een geschikte behandeling toegepast en worden gegevens van de behandelingseffecten op de fluorescente celprocessen vastgelegd en wordt de videogegevens geanalyseerd op ruimtelijk-tijdelijke relaties van eiwitten. Uiteindelijk kan live celfluorescentiemicroscopie cellulaire dynamica, zoals de vorming van 53 BP een foci in reactie op DNA-beschadigende agentia of het gedrag van 53 BP een tijdens mitose, in detail laten zien. We raakten geïnteresseerd in twee- en 3D lifestyle beeldvorming toen we wilden onderzoeken hoe verschillende behandelingen de mitose in bepaalde cellijnen beïnvloedden.
Deze experimentele aanpak stelt ons in staat om de DNA-schaderespons en het behoud van genomische stabiliteit gemakkelijker te bestuderen dan traditionele methoden. Bovendien kun je deze methode gebruiken om te onderzoeken hoe bepaalde eiwitten in verschillende signaalroutes en verschillende cellijnen met elkaar interageren. Het belangrijkste voordeel van lifestyle beeldvorming ten opzichte van traditionele technieken zoals cytochemie is dat het de studie van de DNA-schaderespons eiwitten in real time mogelijk maakt.
Het optimaliseren van de juiste opnamecondities kan een uitdaging zijn. Deze demonstratie kan worden gebruikt om de vele kleine stappen te zien die nodig zijn om succes te garanderen. Onthoud dat volharding lonend is als het gaat om het minimaliseren van fotobleking, het vinden van de juiste opname-intervallen en de juiste opnameduur, enzovoort.
Transfecteer of transduceer de juiste cellijnen met de plasmiden voor mCherry en GFP-fusie-eiwitexpressie. Houd de culturen onder drugsselectie en controleer periodiek de expressie van de fluorescente eiwitten de dag voor afbeeldingsverwerving. Verzamel de cellen met behulp van trypsine.
Zaai vervolgens lagedichtheidsculturen op 3,5 centimeter fluoro schaal glasbodemplaten. Dit protocol werd ontwikkeld met behulp van de Zeiss cell observer SD spinning disc confocale microscoop, uitgerust met een axio observer Z een stand. Controleer eerst of het CO2-gas naar de CO2-module van het incubatiesysteem loopt. Als de microscoop wordt ondersteund door een anti-vibratie Airtable, zet dan de luchttoevoer voor de Airtable aan.
Schakel nu de stroom voor de microscoopstand spinning disc unit camera's, incubatiemodules, HXP-verlichting, gemotoriseerde stage, argonne laser en computer in. Zet de schakelaars voor de te gebruiken laserlijnen aan. Start de Axio vision software.
De Avision software kan worden aangepast met vensters en pull-down menu's die specifiek zijn voor de microscoop en componenten die deze bestuurt. Als zodanig heeft elke gebruikersinterface een mogelijk uniek uiterlijk. Ongeveer een uur voorafgaand aan de beeldvorming. Zoek de bediening van de incubator en zet de verwarming aan voor de bovenste kamer en de stageplaat.
Stel de temperatuur in op 37 graden Celsius. Zet de CO2-regeling aan en stel het niveau in op 5%. Selecteer de objectieflens voor beeldvorming in deze studie. De objectieflens vereist het gebruik van een immersiemedium met een brekingsindex vergelijkbaar met water.
Als je meerdere posities over lange perioden wilt afbeelden, zorg er dan voor dat je voldoende immersiemedium aanbrengt zodat de scope niet uitdroogt. Plaats de kweekschaal op de stage en breng de objectieflens in contact met de bodem, met behulp van de microscoopbediening of de software. Leiding de uitgezonden lichtbundel naar de oculairen en selecteer de juiste wide field filterset voor het fluorescente signaal van belang.
Bekijk nu door de oculaire lenzen. Focus het beeld en lokaliseer een geschikt veld met cellen met behulp van de software of de microscoopbediening. Leiding de uitgezonden lichtbundel weg van de oculairen naar de poort met de confocale spinning disc unit in de software.
Schakel de juiste laser voor deze studie in. Pas voor elke kanaal de intensiteit van de laser aan door de kuo optic tunable filter control op een geschikt niveau in te stellen. Selecteer vervolgens de juiste dichroische spiegel en emissiefilters.
Open de sluiter naar de spinning disc unit. Selecteer nu het live venster om het huidige gezichtsveld weer te geven. Open nu het camerabedieningsvenster.
Selecteer de te gebruiken camera en stel de belichtingstijd in op ongeveer 100 milliseconden. Pas het percentage en EM-gain indien nodig aan. Open ook de bediening voor de confocale spinning disc unit en pas de snelheid van de draaiende schijf aan door de camera-expositietijd in te voeren die werd ingesteld om een geschikt beeld te maken.
Klik op instellen om de wijziging vast te leggen. Open nu het multidimensionale verwervingsvenster. Selecteer het kanaaltabblad en laad of selecteer geschikte kanalen gedefinieerd voor de Flora Fours.
Om beeldregistratie te garanderen, gebruik een gemeenschappelijke dichroische spiegel voor beide kanalen. Zet de software op automatisch focussen. Ga naar het MDA-venster en klik op het ZS stack-tabblad.
Selecteer ZS stack bij de huidige focuspositie. Stel het bereik in voor een 10 micron Zack en kies optimaal voor het aantal stappen om nyquist-sampling door Z te garanderen. Klik nu op starten en analyseer de resulterende Z stack-afbeelding. Selecteer het tijdtabblad.
Stel het interval tussen de beeldvormingstijdstippen en de totale duur van de sessie in. Voor multi-point beeldvorming van verschillende cellen in de schaal, open het MDA-venster. Selecteer het positietabblad en controleer of de toepassingsinstelling voor of na tijdstip per positie is aangevinkt.
Selecteer nu markeren. Zoek met behulp van de liveweergave, beweeg de schaal rond en selecteer geschikte gezichtsvelden. Klik op starten in het multidimensionale verwervingsmenu om het experiment te beginnen en een controlevideo op te nemen.
Voeg vervolgens de juiste behandeling toe en neem de experimentele video op bepaalde tijdsintervallen op voor een gedefinieerde periode. Voor deze cellijn en voor het bewaken van
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft een methode voor het visualiseren van een DNA-dubbelstrengsbreuk-signaleringseiwit dat wordt geactiveerd als reactie op DNA-schade, evenals de lokalisatie ervan tijdens mitose. De demonstratie maakt gebruik van twee en 3D live cel-beeldvorming om de ruimtelijk-tijdelijke relaties van eiwitten die betrokken zijn bij de DNA-schaderespons te onderzoeken.
Belangrijkste onderdelen van de studie
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- DNA-schaderespons
- Live cel-beeldvorming
Achtergrond
- Het begrijpen van de DNA-schaderespons is cruciaal voor celcyclusregulatie.
- Fluorescente markers helpen bij het visualiseren van eiwitdynamiek in levende cellen.
- Twee en 3D beeldvormingstechnieken verbeteren ruimtelijke en tijdelijke analyse.
- 53 BP1 is een sleutelproteïne betrokken bij de DNA-schaderespons.
Doel van de studie
- Om de activering en lokalisatie van DNA-schadesignaleringseiwitten te visualiseren.
- Om de effecten van DNA-beschadigende agentia op cellulaire dynamica te analyseren.
- Om het gedrag van eiwitten tijdens mitose te bestuderen.
Gebruikte methoden
- Transfecteer of transduceer cellijnen met fluorescente markerconstructen.
- Verkrijg controlevideo's van fluorescent gelabelde cellen onder normale omstandigheden.
- Pas behandelingen toe en verzamel gegevens over de effecten van de behandelingen.
- Analyseer videogegevens voor ruimtelijk-tijdelijke relaties van eiwitten.
Belangrijkste resultaten
- Live cel-fluorescentiemicroscopie onthult de dynamiek van 53 BP1 foci-vorming.
- Het eiwitgedrag tijdens mitose wordt beïnvloed door DNA-beschadigende agentia.
- Twee en 3D beeldvorming geeft inzicht in cellulaire reacties op behandelingen.
- Ruimtelijk-tijdelijke relaties van eiwitten kunnen effectief worden geanalyseerd.
Conclusies
- Deze methode maakt gedetailleerde observatie van DNA-schaderespons-eiwitten mogelijk.
- Live cel-beeldvorming is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van cellulaire dynamica.
- Het begrijpen van deze processen kan therapeutische strategieën tegen DNA-schade informeren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Live cell 2D and 3D imaging of DNA damage response proteins such as 53BP1 enables direct visualization of spatiotemporal protein dynamics following genotoxic stress. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early discovery, particularly for targets and pathways involved in genomic stability. Integrating these imaging approaches informs target validation and portfolio triage decisions in oncology and genome maintenance programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables real-time interrogation of DNA repair pathway activation and protein recruitment.
- Supports functional validation of DDR targets by visualizing protein localization and kinetics.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying pathway engagement and cellular context.
- Provides predictive confidence for advancing DDR modulators or synthetic lethality strategies.
Screening & Assay Development
- Establishes validated live cell systems for quantitative assessment of DDR protein dynamics.
- Enables reproducible measurement of foci formation and chromatin changes post-treatment.
- Supports assay standardization for compound screening targeting DNA repair pathways.
- Allows for scalable adaptation to multiple cell lines and genetic backgrounds.
Translational & Preclinical Research
- Aligns imaging outputs with disease-relevant models of genomic instability.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation of DDR-targeting agents.
- Enables risk-adjusted advancement by linking mechanistic readouts to translational endpoints.
- Supports biomarker development for DDR pathway engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging method integrates at the interface of early discovery and lead identification, supporting both hypothesis-driven target validation and downstream assay development for DDR-focused programs.
- Discovery Biology: Visualizes protein recruitment and chromatin remodeling in response to DNA damage, clarifying pathway function.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts of DDR protein foci for compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of spatiotemporal protein dynamics and comparison across treatments or cell lines.
- Translational Research: Connects mechanistic imaging outputs to disease-relevant models and biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for studying diverse DDR proteins and pathways across multiple projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in DDR target validation.
- Operational Value: Standardizes live cell imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and capital allocation by providing robust mechanistic data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of DDR-targeting assets and translational biomarker strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging, fluorescent protein engineering, and image analysis.
- Demands access to advanced confocal microscopy and environmental control systems.
- Necessitates cross-team standardization of imaging protocols and data analysis pipelines.
- Adaptable to various cell lines and DDR proteins with appropriate construct design.
- Imaging conditions must be optimized to minimize photobleaching and ensure data quality.
