Name: Twee-en drie-dimensionale live cell imaging van DNA schade respons Eiwitten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Leer twee- en driedimensionale live cell imaging om DNA-schade-respons-eiwitten zoals 53BP1 te visualiseren in levende cellen. Deze methode onthult ruimtelijk-temporele dynamiek tijdens mitose en na schade-inductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mede ondersteund door R01NS064593 en R21ES016636 (KV). Microscopie werd uitgevoerd bij de VCU - Departement Neurobiologie en Anatomie Microscopie Facility, ondersteund, voor een deel, met financiering van NIH-NINDS Center kern subsidie ​​5P30NS047463. De draaiende schijf confocale microscoop werd aangeschaft met een NIH-NCRR award (1S10RR027957).

A. Bereiding Cell <ol><li> Normale humane primaire fibroblasten (GM02270) werden verkregen van Coriell Cell Repository, Camden, New Jersey, en geïmmortaliseerd met hTERT 6. Cellen werden gekweekt en uitgebreid CellStar 6 cm schalen in media (4 ml) bestaande uit MEM aangevuld met 20% foetaal runderserum (GIBCO), non-essential/essential aminozuren, vitaminen, natriumpyruvaat, en penicilline / streptomycine (HyClone ). </li><li> Humane embryonale nier 293 (HEK293) cellen werden verkregen van American Type Culture Collection en gekweekt en uitgebreid in CellStar 6 cm schalen. De cellen werden in media (4 ml) bestaande uit DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, niet-essentiële aminozuren, L-glutamine en penicilline / streptomycine. </li><li> 53BP1-mCherry (N-Myc-53BP1 WT PLPC-Puro; Addgene plasmide 19836) en H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene plasmide 17735) fusiegen constructen ook expressie puromycine of G418 resistentie genen, respectievelijk, werden getransduceerd (fibroblast) of getransfecteerde (HEK293) met behulp van SuperFect (Qiagene) in cellen en onderhouden onder drug selectie. Onderhoud van fluorescentie werd regelmatig worden gecontroleerd. </li><li> 24 tot 48 uur voor beeldacquisitie, werden de cellen met trypsine behandeld in een single-celsuspensie en uitgezet met een lage dichtheid op 3,5-cm FluroDish glazen bodem platen. </li></ol> B. Microscoop Setup en Image Acquisition Dit protocol is ontwikkeld met behulp van de Zeiss Cell Observer SD draaiende schijf confocale microscoop uitgerust met een AxioObserver Z1 stand, een dual-channel Yokagawa CSU-X1A 5000 draaiende schijf-eenheid, 2 Photometrics QuantEM 512SC EMCCD camera&#39;s, een HXP 120C vezel-gebaseerde verlichting, 4 lasers (een Lasos 100mW multi-line Argon [458, 488, 514 nm], 50 mW 405 nm diode, 40 mW 561 nm diode, en 30 mW 635 nm diode), AOTF, een Pecon XL multiS1 stadium incubatie-systeem, Zeiss incubatie modules (O 2-module S, CO 2 Module S, TempModule S, Verwarming Unit XL S) en een Prior motorized XY podium met een NanoScanZ piëzo Z insert. Sferische aberraties te minimaliseren terwijl imaging levende cellen ondersteund in een waterig medium, een C-Apochromat 63x/1.20 Water / Corr objectieflens en Zeiss Immersol W onderdompeling vloeistof (met een brekingsindex n = 1,334) gebruikt. Voor 2-kanaals confocale beeldvorming, een RQFT 405/488/568/647 dichroïsche spiegel en BP525/50 (groen) en BP629/62 (rood) emissie filters werden gebruikt. Het gebruikte systeem software was Zeiss AxioVision (versie 4.8.2.0) met AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Fysiologie, MosaiX, Mark &amp; ​​Find, Dual Camera, Inside 4D, Autofocus en 3-D Deconvolutie modules. <ol><li> Zorg ervoor dat de CO 2-gas draait om de CO 2-module van de incubatie-systeem. Als de microscoop wordt ondersteund door een anti-vibratie lucht tafel, zet de luchttoevoer (of N 2 gas) voor de lucht tafel. </li><li> Schakel de stroom in voor de microscoop stand, draaiende schijf-eenheid, camera&#39;s, incubatie modules, HXP verlichting, gemotoriseerde podium, Argonlaser, en de computer. </li><li> Na 1 min van warm-up tijd, draai de contactsleutel voor de Argon laser op &quot;Aan&quot;. </li><li> Op Zeiss laser bedieningspaneel zet de schakelaars voor de laserlijnen worden gebruikt. </li><li> Zet de tuimelschakelaar voor de Lasos Argon laser controller van &quot;stand-by&quot; op &quot;laser run&quot; en stel het licht controller om het optimale niveau (dwz net onder het punt waar de groene indicator wordt rood). </li><li> Start de AxioVision software. Opmerking: de gebruikersinterface voor AxioVision kunnen worden aangepast met ramen en pull-down menu&#39;s die specifiek zijn voor de betreffende microscoop en componenten die ze controleert. Als zodanig elk systeem een ​​potentieel unieke interface. Daarom zijn algemene instructies voor software manipulatie die in de volgende stappen, in plaats van aanwijzingen voor specifieke software vensters, tabs en / of pull-down menu&#39;s. </li><li> Ongeveer 1 uur voorafgaand aan de beeldvorming, in de software, zoekt u de controles voor de incubator enSchakel de verwarming van de bovenste kamer en de objectplaat. Stel de temperatuur tot 37 ° C. Zet de CO 2-regelaar en stel het niveau van 5%. </li><li> Selecteer de objectieflens voor beeldvorming. In deze studie werd een C-NA 63x/1.20 Apochromat Water / Corr objectieflens gebruikt. Opmerking: Voor deze lens, een onderdompeling medium met een brekingsindex gelijk aan water (Zeiss Immersol W onderdompeling vloeistof) nodig. </li><li> Als meerdere afzonderlijke posities worden bemonsterd gedurende een lange periode, bepaald om een ​​voldoende hoeveelheid medium onderdompeling toepassing opdat zij vervoerd van de ene positie naar de andere. </li><li> Zet de schaal op het podium en breng de objectieflens omhoog in contact met de bodem. </li><li> Met behulp van de microscoop controles of de software, direct het uitgestraalde licht van de oculairs en selecteer de juiste groothoek filter instellen voor het fluorescerende signaal van belang (voor deze studie, &quot;Red&quot; filter instellen voor 53BP1 en een &quot;GFP&quot; filter instellen voor H2B ). &lt;/ Li&gt; <li> Bekijk via de oculaire lenzen, de focus van de afbeelding, en zoek een geschikte gebied van de cellen. </li><li> Met behulp van de software of de microscoop controles, richt het uitgestraalde licht weg van de oculairs naar de haven met de confocale draaiende schijf unit. </li><li> In de software, het inschakelen van de juiste laser (voor deze studie, de 561 nm laser voor 53BP1 en de 488 nm lijn van de Argon laser voor H2B). </li><li> Voor elk kanaal de intensiteit van de laser door aanpassing van de acousto-optische afstembaar filter (AOTF) control naar een geschikt niveau. </li><li> Selecteer de juiste dichroïsche spiegel (RQFT 405/488/568/647) en emissie filters (BP 629/62 voor 53BP1 en BP 525/50 voor H2B). Open het schuifje van de draaiende schijf unit. </li><li> Selecteer de &quot;Live&quot; venster om de huidige gezichtsveld weer te geven. </li><li> In de software, opent u het &quot;Camera&quot; controle, selecteert u de camera moet worden gebruikt (als een dubbele camera-systeem) en stel de belichtingstijd van ongeveer 100 ms. Stel de% en EM systeem krijgen als neg. essary Opmerking: De 53BP1-mCherry constructie lijkt wat afm. We vonden het nuttig om de EM winst te verhogen. </li><li> In de software, opent u de controle voor de confocale draaiende schijf-eenheid en pas de draaiende schijf snelheid door het invoeren van de juiste belichting tijd die is ingesteld op een geschikt beeld (bijvoorbeeld ~ 100 ms) vast te leggen. Klik op &quot;Set&quot; te vergrendelen in de verandering. </li><li> Open &quot;multi-dimensionale overname&quot;. Selecteer het kanaal tab en laadt / selecteer de juiste kanalen. Voor dit onderzoek gebruiken we kanalen gedefinieerd voor DsRed (561 nm laser excitatie en BP 629/62 filter voor emissie) en GFP (488 nm laser lijn voor excitatie en BP525/50 filter voor emissie). </li><li> Om beeldregistratie te verzekeren, werd een gemeenschappelijke dichroïsche spiegel (RQFT 405/488/568/647) gebruikt voor beide kanalen. Stel de software om &quot;Autofocus&quot;. Opmerking: Ga naar Extra → Instellingen editor om de MDA instellingen aan te passen. Zorg ervoor dat er voldoende laservermogen is ingesteld (&quot;Adequate laservermogen&quot; verwezen naar een instelling die u in staat steltde passende fluorofoor wekken met minimale foto-bleking). </li><li> In het MDA-venster, selecteer de z-stack tabblad. Selecteer &quot;Z-stack op de actieve focus positie&quot;. Stel het bereik voor ~ 10 pm z-stack en kies &quot;optimale&quot; voor het aantal stappen om Nyquist bemonstering te garanderen door middel van Z. Opmerking: De exacte omvang van de z-stack is afhankelijk van de hoogte van uw cellen. Dienovereenkomstig aan te passen. </li><li> 23. Klik op &quot;Start&quot; en analyseren de resulterende z-stack beeld om ervoor te zorgen de instellingen geschikt zijn voor wat je aan het onderzoeken (bijvoorbeeld in deze studie, was het belangrijk om het imago van de hele kern). </li><li> Selecteer de &quot;T&quot; (tijd) aan. Voor onze experimenteren met camptothecine, zetten we het interval tussen beeldvorming tijdstippen tot 5 minuten en de totale duur van de sessie gedurende 1 uur voor een controle (niet-behandelde cellen) video. Let op: het minimaliseren van foto-bleken van de cellen, het experiment worden geconfigureerd dat de AOTF spaties tussen de laser imaging tijdstippen. </li><li> Fof multi-point imaging van meerdere cellen in de schaal, in het MDA-venster, selecteer het tabblad Positie. Zorg ervoor dat &quot;Apply&quot;-instelling voor / na tijdstip &#39;per positie &quot;is aangevinkt. Selecteer &quot;Mark_Find&quot;. Het gebruik van de &quot;Live&quot; uitzicht, bewegen de schotel en selecteer de juiste gezichtsveld. </li><li> Klik op &quot;Start&quot; in de multi-dimensionale-overname menu om het experiment te starten en een controle video op te nemen (van onbehandelde cellen). </li><li> Na de controle video, voeg de geschikte behandeling (in dit geval 10 uM camptothecine). We namen de experimentele (drug-behandelde cellen) video op een 5-10 minuten intervallen gedurende 2-4 uur. Let op: Een belangrijk punt om te overwegen is de snelheid waarmee een bepaalde effect treedt op na de behandeling. Zoals te zien in de video, 53BP1 foci gaan van ~ 5 min na toevoeging van CPT. Hoewel een relatief eenvoudig proces, het toevoegen van medicijnen om de schotel handmatig en opnieuw kalibreren van de microscoop vergt wel tijd. Aandacht dient te worden besteed aan dit bij het ontwerpen van experimenten. </li><li> Voor het monitoren van mitosis, we het interval op 7,5 min en opgeslagen gedurende 4-5 uur (de specifieke instellingen afhankelijk van de gebruikte cellijn en de lengte van de celcyclus). Aanpassingen moeten mogelijk worden gemaakt om foto-bleken te voorkomen tijdens langere opnames. </li></ol> C. Image Processing and Analysis Dit protocol is ontwikkeld met behulp van Volocity software (PerkinElmer). De software gebruikt om deze gegevens (AxioVision) verwerven heeft ook de mogelijkheid te verwerken en analyseren beelden. Gebruikers worden aangemoedigd om de beschikbare software om ze te gebruiken, en passende literatuur betreffende de toepassing ervan te raadplegen. <ol><li> Open Volocity software. Maken en een naam van een nieuwe bibliotheek, en importeer uw video-bestanden. </li><li> Voor het bekijken van de bestanden, hebben we meestal vinden het zeer nuttig om de &quot;Extended Focus&quot;-instelling te gebruiken. Dit superponeert de z-stack plakjes en, voor dit protocol, kunnen we 53BP1 foci te visualiseren in verschillende gebieden van de kern. </li><li> Pas video&#39;s als dat nodig is. Volocity is uitgerust met een scala aan tools om de kwaliteit van verkregen beelden te verbeteren. Door te zorgen voor de instellingen op de microscoop adequaat waren, kan veel tijd worden bespaard in het bewerken van later. Vaak is het nuttig om uw foto&#39;s Deconvolutie, en de helderheid / contrast aan te passen. Uw specifieke bewerking behoeften zal variëren op basis van het experiment. </li><li> Voeg een relatieve tijdstempel en schaal bar. </li><li> Om cellen te bekijken in 3-D, schakelen naar de &quot;3-D Dekking&quot; instelling. Dit maakt rotatie van de 3-D teruggegeven cellen in de ruimte, waardoor meerdere perspectieven van structuren plaats binnen de cellen. Opmerking: Het is nuttig om cellen te visualiseren in verschillende vlakken bepalen waar structuren plaats reizen. Bijvoorbeeld, in de &quot;Extended Focus&quot; moeilijk te onderscheiden dat de 53BP1 is in feite van DNA dissociëren tijdens mitose. Dit is echter duidelijk zichtbaar in 3-D. </li><li> Films en stilstaande beelden kunnen worden geëxporteerd naar een groot aantal bestandstypen op basis van voorkeur van de gebruiker. </l<html> i&gt; </ol> D. Representatieve resultaten Een voorbeeld van 53BP1 foci vorming in respons op CPT is weergegeven in figuur 1. Cellen blootgesteld aan CPT vorm foci binnen 5-10 min en handhaven deze foci gehele duur van opname. Zoals getoond in figuur 2, 53BP1 dissocieert van chromatine bij het ​​begin van mitose, vormen van een dunne waas rond de condenserende chromosomen. Als telofase optreedt en mitose tot een einde komt, 53BP1 opnieuw aggregaten in verschillende brandpunten. Terwijl de HEK293 cellen werden niet blootgesteld aan CPT, niettemin gevormd overvloedig spontane 53BP1 reparatie foci geproduceerd door endogene DNA schade. Deze observatie konden we concluderen dat 53BP1 niet foci te vormen tijdens de vroege mitose, in lijn met een eerder rapport met een vergelijkbaar effect na de blootstelling van cellen aan ioniserende straling en radiomimetische drugs 5. ure 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Camptothecine (10 uM) veroorzaakt DSB en 53BP1 foci vorming in fietsen fibroblasten binnen 30 min van toevoeging van het geneesmiddel aan het medium. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Figuur 2. 53BP1 geen foci te vormen tijdens mitose tot telophase/G1 in HEK293 cellen.

<ol><li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li>
<li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li>
<li>Feuerhahn, S., Egly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+study+DNA+repair%3A+what%27s+in+the+box%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Tools to study DNA repair: what's in the box.</a> Trends Genet. 24, 467-474 (2008).</li>
<li>Giunta, S., Belotserkovskaya, R., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+signaling+in+response+to+double-strand+breaks+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage signaling in response to double-strand breaks during mitosis.</a> J. Cell Biol. 190, 197-207 (2010).</li>
<li>Giunta, S., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Give+me+a+break%2C+but+not+in+mitosis%3A+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li>
<li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li>
<li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li>
<li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li>
<li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr. Biol. 8, 377-385 (1998).</li>
<li>Massignani, M., Canton, I., Sun, T., Hearnden, V., Macneil, S., Blanazs, A., Armes, S. P., Lewis, A., Battaglia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+fluorescence+imaging+of+live+cells+by+effective+cytosolic+delivery+of+probes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Enhanced fluorescence imaging of live cells by effective cytosolic delivery of probes.</a> PLoS One. 5, e10459(2010).</li>
<li>Nakamura, K., Sakai, W., Kawamoto, T., Bree, R. T., Lowndes, N. F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1%3A+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li>
<li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+binding+protein+1+%2853BP1%29+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li>
<li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li>
<li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((53BP1%2C+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li>
<li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Onderhoud van genomische integriteit is cruciaal voor overleving van de cel. Als de genoom resultaten te bewaren in vroegtijdige veroudering, kanker, of de dood 8. Er is grote belangstelling in het onderscheiden van de manier waarop de DDR functies, als gevolg van het belang ervan voor zowel fundamenteel als klinisch onderzoek. Vele technieken zijn ontwikkeld de afgelopen jaren om te helpen bij het bestuderen van cellen te detecteren en repareren DNA schade. Traditionele methoden zoals immunocytochemie en wes...

<table border="1"><tbody><tr><td> Product </td><td> Vennootschap </td></tr><tr><td> CellStar cultuur gerechten </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish glazen bodem gerechten </td><td> Wereld Precision Instruments, Inc </td></tr><tr><td> MEM media </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Niet-essentiële aminozuren </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Aminozuren </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitaminen </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Natriumpyruvaat </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 WT PLPC-Puro; plasmide 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; plasmide 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss Cell Observer SD imaging systeem </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (release 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Olie </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity software (versie 6.0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

twee-en drie-dimensionale live cell imaging van dna schade respons eiwitten

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Dubbel-breuken (DSB&#39;s) zijn de meest schadelijke DNA laesies een cel tegenkomt kan. Als gerepareerd wordt aan DSB haven een groot potentieel genereren mutaties en chromosomale afwijkingen 1. Om dit trauma te voorkomen katalyseren genomische instabiliteit, is het cruciaal voor de cellen om DSB&#39;s te detecteren, activeert u de DNA schade respons (DDR), en herstellen het DNA. Wanneer gestimuleerd, de DDR werkt om genomische integriteit te bewaren door het triggeren van de celcyclus te laten voor reparatie te laten plaatsvinden of dwingen de cel om apoptose te ondergaan. De overheersende mechanismen van DSB reparatie plaatsvinden via niet-homologe end-joining (NHEJ) en homologe recombinatie reparatie (HRR) (beoordeeld in 2). Er zijn veel eiwitten waarvan de activiteiten moet nauwkeurig worden georkestreerd voor de DDR om goed te functioneren. Hierin beschrijven we een werkwijze voor 2 - en 3-dimensionale (D) visualisatie van een van deze eiwitten, 53BP1. De p53-binding protein 1 (53BP1) gelokaliseerd op gebieden vanDSB&#39;s door te binden aan gemodificeerde histonen 3,4, die foci binnen 5-15 minuten 5. De histon modificaties en werving van 53BP1 en andere DDR eiwitten aan DSB sites worden verondersteld om de structurele herschikking van chromatine te vergemakkelijken rond gebieden van schade en om DNA herstel 6 bijdragen. Naast directe participatie in reparatie zijn aanvullende rollen zijn beschreven voor 53BP1 in de DDR, zoals de regeling van een intra-S checkpoint, een G2 / M checkpoint, en het activeren van stroomafwaarts DDR eiwitten 7-9. Onlangs werd ontdekt dat 53BP1 geen foci in reactie op DNA schade geïnduceerd tijdens mitose, maar wachten cellen G1 voeren voordat lokaliseren naar de omgeving van DSB 6. DDR eiwitten zoals 53BP1 zijn gevonden met mitotische structuren (zoals kinetochoren) betrekken bij het ​​doorlopen van mitose 10. In dit protocol beschrijven we het gebruik van 2 - en 3-D beeldvorming van levende cellen te visualiserende vorming van 53BP1 foci in reactie op de DNA beschadigende middel camptothecine (CPT), alsmede 53BP1 gedrag tijdens mitose. Camptothecine is een topoisomerase-I-remmer die voornamelijk DSB veroorzaakt tijdens DNA replicatie. Hiervoor hebben we een eerder beschreven 53BP1-mCherry fluorescent eiwit constructie bestaande uit een 53BP1 eiwitdomein kunnen DSB 11 binden. Daarnaast gebruikten we een histon H2B-GFP fusie-eiwit construct fluorescent kunnen chromatine dynamiek tijdens de gehele celcyclus maar vooral tijdens mitose 12. Live cell imaging in meerdere dimensies is een uitstekend hulpmiddel om ons begrip van de functie van DDR eiwitten in eukaryotische cellen te verdiepen.

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het visualiseren van een DNA dubbelstrengs breuken signaleringeiwit geactiveerd in reactie op DNA schade en de lokalisatie tijdens mitose.

Twee-en drie-dimensionale live cell imaging van DNA schade respons Eiwitten

Dubbelstrengsbreuken (DSB's) zijn de meest schadelijke DNA-laesies die een cel kan tegenkomen. Indien ze niet worden gerepareerd, hebben DSB's een groot potentieel om ... te genereren

Deze demonstratie maakt gebruik van 2D- en 3D-live cell imaging om de spatiotemporele relaties van eiwitten die betrokken zijn bij de DNA-schaderespons te begrijpen. Transfecteer of transduceer eerst de door u gekozen cellijn met expressieconstructen die de juiste fluorescente markers bevatten; in dit geval M Cherry en GFP. Neem vervolgens een reeks controlevideo's op van de fluorescentie-gelabelde cellen onder normale omstandigheden.Pas vervolgens een passende behandeling toe en verzamel gegevens over de effecten van de behandeling op het proces in de fluorescente cellen, en analyseer de videogegevens op ruimtelijk-temporele relaties tussen eiwitten. Uiteindelijk kan live-cell fluorescentiemicroscopie cellulaire dynamiek in detail blootleggen, zoals de vorming van 53 BP one-foci als reactie op DNA-beschadigende agentia of het gedrag van 53 BP one tijdens de mitose. Wij raakten aanvankelijk geïnteresseerd in 2D- en 3D-live-cell imaging toen we wilden bestuderen hoe verschillende behandelingen de mitose in bepaalde cellijnen beïnvloedden.Deze experimentele aanpak stelt ons in staat om de DNA-schaderespons en het behoud van genomische stabiliteit gemakkelijker te bestuderen dan met traditionele methoden. Daarnaast kunt u deze methode gebruiken om te bestuderen hoe bepaalde eiwitten interageren in diverse signaleringspaden en verschillende cellijnen. Het belangrijkste voordeel van live-cell imaging ten opzichte van traditionele technieken zoals cytochemie is dat het de studie van DNA-schaderespons-eiwitten in realtime mogelijk maakt.Het optimaliseren van de juiste opnamecondities kan uitdagend zijn. Deze demonstratie kan worden gebruikt om de vele kleine stappen te zien die nodig zijn om succes te garanderen. Onthoud dat volharding loont wanneer het gaat om het minimaliseren van fotobleken, het vinden van de juiste opname-intervallen en de juiste opnameduur, enzovoort.Transfecteer of transduceer de geschikte cellijnen met de plasmiden voor de expressie van mCherry- en GFP-fusie-eiwitten. Houd de culturen in stand onder medicijnselectie en controleer periodiek op de expressie van de fluorescerende eiwitten op de dag vóór de beeldacquisitie. Oogst de cellen met behulp van trypsine.Zaai vervolgens laag-densiteitsculturen uit op fluoro dish glazen bodemplaten van 3,5 centimeter. Dit protocol is ontwikkeld met gebruik van de Zeiss cell observer SD spinning disc confocale microscoop, uitgerust met een axio observer Z one statief. Controleer eerst of het CO2-gas naar de CO2-module van het incubatiesysteem stroomt. Indien de microscoop wordt ondersteund door een trillingsvrije Airtable, schakel dan de luchttoevoer voor de Airtable in.Zet nu de stroom aan voor de microscoopstand, de spinning disc-eenheid, de camera's, de incubatiemodules, de HXP-illuminator, de gemotoriseerde tafel, de argonlaser en de computer. Zet de schakelaars in voor de laserlijnen die worden gebruikt. Start de Axio vision-software op.De Avision-software kan worden aangepast met vensters en uitklapmenu's die specifiek zijn voor de microscoop en de componenten die deze aanstuurt. Hierdoor heeft elke gebruikersinterface een potentieel unieke weergave. Ongeveer één uur vóór het maken van beelden: zoek de bedieningselementen van de incubator en schakel de verwarming voor de bovenkamer en de objecttafelplaat in.Stel de temperatuur in op 37 °C. Schakel de CO2-regeling in en stel het niveau in op 5%. Selecteer het objectief voor de beeldvorming in deze studie. Voor het objectief is een immersiemedium nodig met een brekingsindex die vergelijkbaar is met die van water.Als u meerdere posities over langere tijd wilt afbeelden, zorg er dan voor dat u voldoende immersievloeistof aanbrengt, zodat de scoop niet uitdroogt. Plaats de kweekschaal op de tafel en breng de objectieflens in contact met de bodem, gebruikmakend van zowel de microscoopbediening als de software. Richt het uitgezonden licht naar de oculairs en selecteer de juiste breedveldfilterset voor het fluorescerende signaal waarin u geïnteresseerd bent.Kijk nu door de oculaire lenzen. Stel het beeld scherp en zoek een geschikt celveld met behulp van de software of de bedieningselementen van de microscoop. Leid het uitgezonden licht via de software van de oculairs weg naar de poort met de confocale spinning disc unit.Zet de juiste laser voor deze studie aan. Pas voor elk kanaal de intensiteit van de laser aan door de bediening van het kuo-optische instelbare filter naar een passend niveau te brengen. Selecteer vervolgens de juiste dichroïsche spiegel en emissiefilters.Open de sluiter van de spinning disc-unit. Selecteer nu het live-venster om het huidige gezichtsveld weer te geven. Open nu het venster voor camerabediening.Selecteer de te gebruiken camera en stel de belichtingstijd in op ongeveer 100 milliseconden. Pas het percentage en de EM-gain naar behoefte aan. Open daarnaast de bediening van de confocale spinning-disc-unit en stel de snelheid van de spinning-disc in door de ingestelde belichtingstijd van de camera in te voeren om een geschikt beeld vast te leggen.Klik op 'set' om de wijziging te bevestigen. Open nu het venster voor multidimensionale acquisitie. Selecteer het tabblad 'channel' en laad of selecteer de passende kanalen die zijn gedefinieerd voor de Flora Fours.Gebruik voor een correcte beeldregistratie een gemeenschappelijke dichroïsche spiegel voor beide kanalen. Stel de software in op autofocus. Ga naar het MDA-venster en klik op het tabblad ZS-stack.Selecteer de ZS-stack op de huidige focuspositie. Stel het bereik in voor een Zack van 10 micron en kies de optimale waarde voor het aantal stappen om Nyquist-sampling door de Z-as te waarborgen. Klik nu op start en analyseer de resulterende Z-stack afbeelding. Selecteer het tabblad tijd.Stel het interval tussen de beeldmaakmomenten en de totale duur van de sessie in. Voor multi-point imaging van meerdere cellen in de schaal opent u het MDA-venster. Selecteer het tabblad 'Position' en controleer of de optie 'apply setting before or after time point per position' is aangevinkt.Selecteer nu 'mark'. Zoek via de liveweergave, verplaats de schaal en selecteer de juiste gezichtsvelden. Klik op 'start' in het menu voor multidimensionale acquisitie om het experiment te beginnen en een controlevideo op te nemen.Voeg vervolgens de juiste behandeling toe en neem de experimentele video op met bepaalde tijdsintervallen gedurende een gedefinieerde periode. Voor deze cellijn en om het volledige proces van mitose te monitoren, gebruikten we een interval van zeven en een halve minuut gedurende vier tot vijf uur. U zult de specifieke instellingen voor uw eigen cellijn en voor datgene wat u wilt bestuderen moeten bepalen.Open de Velocity-software, maak een nieuwe bibliotheek aan, geef deze een naam en importeer de experimentele videobestanden om deze te kunnen bekijken. Probeer de instelling voor uitgebreide focus (extended focus) en pas de video's naar behoefte aan. Velocity is uitgerust met diverse hulpmiddelen om de kwaliteit van de verkregen beelden te verbeteren.Wanneer de instellingen van de microscoop correct zijn, bespaart dit later veel tijd bij het bewerken. Het is vaak nuttig om uw beelden te ontwikkelen en de helderheid en het contrast aan te passen; uw specifieke behoeften zullen variëren afhankelijk van uw experiment. Schakel over naar de instelling voor 3D-opaciteit om de cellen in 3D te bekijken.Dit maakt het mogelijk om de in 3D gerenderde cellen in de ruimte te roteren, waardoor meerdere perspectieven van interessante structuren binnen de cellen kunnen worden verkregen. Films. Stilstaande beelden kunnen worden geëxporteerd naar diverse bestandstypen, afhankelijk van de voorkeur van de gebruiker. In vergelijking met de controles vormden fibroblastcellen die waren blootgesteld aan CPT binnen vijf tot 10 minuten foci, en behielden zij deze foci gedurende de gehele opnameperiode.Interessant is dat 53 BP1 in menselijke embryonale niercellen bij het begin van de mitose loskomt van het chromatine, waardoor een dunne waas rond de condenserende chromosomen ontstaat. Wanneer telofase optreedt en de mitose ten einde loopt, aggregeert 53 BP1 opnieuw in duidelijke foci. We hopen dat deze video u in staat stelt om de spatiotemporele relaties van eiwitten die betrokken zijn bij de DNA-schaderespons en andere pathways te bestuderen.Bijvoorbeeld, op het gebied van chromatinedynamiek is deze techniek gebruikt om te bestuderen hoe de binding van 53 BP1 de beweging van telomere uiteinden van DNA beïnvloedt. Na het creëren van genetisch gemodificeerde cellen kan er gedurende ongeveer vier tot acht uur 2D- en 3D-live cell imaging worden uitgevoerd. Zorg ervoor dat de instellingen van de microscoop correct zijn aangepast voor een optimale beeldvorming.

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In this video, we describe the immunofluorescence method to visualize the localization of the DNA repair proteins γH2AX and 53BP1 at the sites of double-strand DNA breaks in irradiated cell nuclei.

Immunofluorescence-Based Visualization of DNA Repair Protein Interactions

Lasers worden vaak gebruikt in studies van de cellulaire respons op DNA-schade. Echter, ze genereren lesies waarvan de afstand, frequentie en botsingen met replicatievorken worden zelden gekenmerkt. We beschrijven een benadering die de bepaling van deze parameters laser gelokaliseerde crosslinks tussen de strengen mogelijk maakt.

Single Molecule Analyse van de Laser Gelokaliseerde Psoralen Adducten

Hier wordt aangetoond hoe de in situ Proximity Ligation Assay (PLA) kan worden gebruikt om de directe eiwit-eiwit interacties tussen ATM en p53 te detecteren en visualiseren in suspensiecellen die blootgesteld zijn aan genotoxische stress.

Detectie en visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde eiwitcomplexen in suspensiecellenculturen met behulp van de proximity-liggingsassay

Laser microirradiation is een nuttig instrument voor onderzoek naar DNA-herstel in levende cellen. Een methodologische aanpak voor het gebruik van UVA lasers voor het opwekken van verschillende DNA laesies wordt weergegeven. We hebben een methode voor het lokale microirradiation die de normale celcyclus; onderhoudt geoptimaliseerd zo doorloop bestraalde cellen mitose.

Geavanceerde confocale microscopie technieken om te studeren van eiwit-eiwitinteractie en kinetiek op DNA laesies

Het doel van dit protocol is te beschrijven hoe laser microirradiation voor het opwekken van verschillende soorten DNA-beschadiging, met inbegrip van relatief eenvoudige strand einden en complexe schade, aan de studie van DNA schade signalering en reparatie factor montage op schade sites in vivo .

Laser Microirradiation om te studeren In Vivo cellulaire reacties op eenvoudige en complexe DNA-schade

Confocale fluorescentie microscopie en laser micro-bestraling aanbod tools voor inducerende DNA-beschadiging en het toezicht op de reactie van DNA reparatie eiwitten in geselecteerde sub nucleaire gebieden. Deze techniek is onze kennis van schade detectie, signalering en werving aanzienlijk vooruitgegaan. Dit manuscript toont deze technologieën te onderzoeken van een- en tweepersoonskamers strand break repair.

Toepassing van Laser-Micro-bestraling voor onderzoek van enkele en dubbele Strand Break Repair in zoogdiercellen

Een systeem voor het opwekken van laesies op de gedefinieerde regio sub nucleaire's vereist studeren DNA schade reparatie kinetiek. Beschrijven we een methode om gelokaliseerde double-stranded einden met behulp van een laser-scanner confocal microscoop uitgerust met een 405 nm laser maken en leveren van geautomatiseerde procedures om te kwantificeren van de dynamiek van reparatie factoren bij deze letsels.

Onderzoek van eiwit werving aan DNA laesies met behulp van 405 Nm Laser-Micro-bestraling

Reparatie van dubbele streng DNA pauzes is een dynamisch proces, waarbij niet alleen de vorming van reparatie complexen in de pauzes, maar ook hun resolutie na de laesie is gericht. Hier, gebruiken we immunofluorescentie microscopie voor voorbijgaande en langdurige double-stranded pauzes als een instrument om te ontleden dit genoom onderhoud mechanisme.

Karakterisering van de DNA-herstelsynthese op Transiënten- en Long-lasting Double-streng DNA-einden door immunofluorescentie microscopie

Na DNA-schade activeren menselijke cellen essentiële hersteltrajecten om de integriteit van hun genoom te herstellen. Hier beschrijven we de methode van indirecte immunofluorescentie als een middel om DNA-hersteleiwitten te detecteren, hun ruimtelijke en temporele rekrutering te analyseren en de eiwitinteractie op de sites van DNA-schade te helpen ondervragen.

Visualisatie van DNA Repair Proteins Interaction door Immunofluorescentie

Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.

Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

Dit protocol presenteert een nieuw reporter-gensysteem en de experimentele opstelling om transcriptie te detecteren bij DNA-dubbelstrengsbreuken met gevoeligheid van één molecuul.

Live-Cell Imaging van transcriptionele activiteit bij DNA Double-Strand Breaks

Leer twee- en driedimensionale live cell imaging om DNA-schade-respons-eiwitten zoals 53BP1 te visualiseren in levende cellen. Deze methode onthult ruimtelijk-temporele dynamiek tijdens mitose en na schade-inductie.

Twee-en drie-dimensionale live cell imaging van DNA schade respons Eiwitten

Meer video's verkennen