Voltage-gevoelige kleurstof Opnemen van axonen, dendrieten en dendritische spines van individuele neuronen in Brain Slices

Het algemene doel van de beschreven experimenten is het optisch monitoren van de integratie van membraanpotentiaalsignalen en de informatieverwerking door een individuele zenuwcel, met submicrometer- en submilliseconde-resolutie vanaf meerdere locaties op een neuron. Dit wordt bereikt door eerst een imaging-opstelling te bouwen met een geschikte gevoeligheid om de registratie van kleine fractionele veranderingen in lichtintensiteit mogelijk te maken, die corresponderen met de transiënten van het membraanpotentiaal. Vervolgens worden neuronen geselecteerd met een geschikte anatomie voor effectieve imaging, waarbij neuronen met lange, intacte uitlopers in een enkel brandvlak dicht bij het oppervlak van het coupesectie worden gekozen.

Laad vervolgens de vooraf geselecteerde neuronen met spanningsgevoelige kleurstoffen om optische tracking van de veranderingen in het membraanpotentiaal mogelijk te maken. De resultaten tonen de unieke capaciteit van deze benadering om informatie te verkrijgen over de integratie van elektrische signalen door individuele zenuwcellen door het monitoren van membraanpotentiaalsignalen van axonen, dendrieten en dendritische spines. In de cellulaire neurofysiologie.

Er worden nieuwe instrumenten ontwikkeld vanwege de twee langdurige beperkingen van conventionele elektrofysiologie: de lage ruimtelijke resolutie van elektrode-metingen en het onvermogen om opnames te maken van kleine structuren zoals axonale collateralen of dendritische spines. Om deze nadelen te overwinnen, kan de patch-elektrodebenadering worden gecombineerd met optische technieken die parallelle opnames mogelijk maken van alle delen van een neuron. Hier beschrijven we zo'n techniek: meerdere zijdelingse optische registratie van membraanpotentiaaltransiënten met resolutie op enkelvoudige spine-niveau.

In dit experiment worden een rechtopstaande microscoop en drie camera's gebruikt om een uniforme verlichting in te stellen. Plaats eerst een geschikt neutraal dichtheidsfilter in het pad van de laserstraal. Focus vervolgens het objectief op het oppervlak van de standaard fluorescentiepreparaat.

Pas, terwijl u het CCD-beeld van het gezichtsveld op het monitorscherm observeert, de positie van het ontvangende uiteinde van de kwartslichtgeleider en de positie van het uitgaande uiteinde van de lichtgeleider aan met behulp van de geschikte actuatoren op de epifluorescentiecondensor, om een gecentreerde en uniforme verlichting van het gezichtsveld te bereiken. Gebruik ter bepaling van de vibratieruis een standaard fluorescentiepreparaat met een niet-fluorescerende markering op het oppervlak. Registreer de lichtintensiteit met de neuro CCD in continue modus.

Focus het objectief op een donkere rand van de zwarte markering en registreer de lichtintensiteit gedurende ongeveer 100 milliseconden met een framerate van twee kilohertz. Toon vervolgens het ruimtelijk gemiddelde van de fractionele lichtintensiteitssporen van ongeveer 20 pixels die licht ontvangen uit het uniform verlichte gebied en van ongeveer 20 pixels langs de rand van de zwarte markering. De excessieve ruis in het ruimtelijk gemiddelde van de pixels met contrastrijke randen weerspiegelt de vibratieruis in het systeem.

Het is essentieel om de mechanische sluiter buiten de trillingsisolatietafel te monteren, zodat het openen van de sluiter geen trillingsruis in de optische registratie introduceert. Dit is een kritische stap. Monteer de sluiter met plastic schroeven en trillingsisolerend materiaal om de akoestische trillingsruis te verminderen die door het optische registratiesysteem kan worden opgepikt.

Om trillingen te isoleren, stelt u de trillingsisolatietafel zo in dat de trillingsruis van de pixels die de scherpe rand van het beeld beslaan, kleiner is dan de shotruis. De bekabeling van de apparatuur op de tafel moet los liggen om te voorkomen dat mechanische trillingen worden overgebracht op het microscoopobjectief. Bereid in deze procedure hersensecties met een dikte van 300 tot 400 micron voor volgens standaardprocedures, gebruikmakend van een muizenlijn die EGFP tot expressie brengt in de individuele zenuwcellen van belang, met een spinning disc confocaal systeem.

Visualiseer de met EGFP gelabelde neuronen in de slice. Selecteer vervolgens de neuronen met intacte dendritische axonale bomen en met uitlopers die parallel aan en dicht bij het oppervlak van de slice lopen voor membraanpotentiaal-imaging. Vul daarna een glazen patchpipet vanaf de tip met dye-vrije intracellulaire oplossing tot twee derde van de taper van de elektrode door gedurende ongeveer 15 seconden negatieve druk uit te oefenen.

Vul de elektrode daarna opnieuw aan met de oplossing waarin de membraan IMP permeaat spanningsgevoelige kleurstof is opgelost in de intracellulaire oplossing. Patch nu een eerder geselecteerd neuron binnen één minuut nadat de kleurstof in de elektrode is geladen. Breng een lage positieve druk van ongeveer 10 millimeter kwik aan voordat de pipet in het bad wordt gelaten; dit zorgt er tijdens het positioneren van de elektrode in het coupesectie voor dat er geen kleurstof uit de elektrode lekt voordat de seal is gevormd.

Verhoog de druk naar een hoge waarde van ongeveer 100 millimeter kwik vlak voordat de elektrode het celoppervlak raakt. Zodra de afsluiting in de whole-cell configuratie is gevestigd, laat u de kleurstof gedurende 20 tot 45 minuten vrij diffunderen vanuit een somatische patchpipet naar het soma. Bewaak tijdens deze diffusie van de kleurstof de fysiologische toestand van het neuron door de opgewekte actiepotentialen te registreren in de current-clamp modus.

Monitor daarnaast de hoeveelheid kleuring door de rustlichtintensiteit van het cellichaam te registreren met een framerate van twee kilohertz en bij een fractie van de volledige lichtintensiteit, aangepast met neutrale dichtheidsfilters. Zet het downloadproces voort totdat de actiepotentiaal begint te verbreden. Trek aan het einde van de kleuring de patchpipet voorzichtig weg van het cellichaam in voltage-clampconfiguratie om ervoor te zorgen dat de overgang van whole-cell naar outside-out patchconfiguratie tijdens dit proces wordt bereikt.

Incubeer de slice vervolgens nog 1,5 tot twee uur bij kamertemperatuur om de voltagesensitieve kleurstof de neuronale uitlopers in te laten dringen. Nadat een aanzienlijke hoeveelheid kleurstof vanuit het soma naar de dendritische en axonale uitlopers is gediffundeerd, zou de golfvorm van de actiepotentiaal volledig hersteld moeten zijn. Lokaliseer in de volgende stap het soma van het gekleurde neuron onder fluorescentie met lage intensiteit.

Verminder de lichtintensiteit met neutrale dichtheidsfilters tot het minimum dat nodig is om het object van belang te visualiseren met behulp van een XY-tafel. Scan het gebied van de slice met het fluorescerende neuron totdat het fluorescerende soma is geïdentificeerd. Positioneer het soma van de gekleurde cel in het centrum van het gezichtsveld van de microscoop. Patch het neuron met een standaard patchelektrode zonder kleurstof onder DIC. Visualiseer vervolgens de neuronale uitlopers onder fluorescentie met lage intensiteit met een framerate van 10 tot 40 hertz in de continue opnamemodus van de CCD voor voltage-imaging.

Positioneer met behulp van de XY-tafel het neurale uitlopers van belang in het midden van het beeldveld. Bescherm daarnaast het soma tegen het excitatielicht door de gedeeltelijk gesloten veldstop-iris van de microscoop te gebruiken om fotodynamische schade te beperken. Registreer vervolgens de optische signalen die verband houden met terugpropagerende actiepotentialen in de individuele dendritische vertakkingen.

Registreer vervolgens de optische signalen die gerelateerd zijn aan actiepotentialen in het axon. Registreer daarna de optische signalen die gerelateerd zijn aan terugpropagerende actiepotentialen in de dendritische spines. Gebruik de juiste framerate voor een nauwkeurige reconstructie van de signaalgolfvorm.

Houd tegelijkertijd de opnameperioden en de blootstelling aan hoog-intensief excitatielicht zo kort mogelijk om dye-bleaching en fotodynamische schade te minimaliseren. De registratie van optische signalen wordt hier getoond. Het bovenste paneel toont de hoge-resolutie confocale afbeelding van een gekleurd neuron met zijn axon in de opnamepositie.

Terwijl het middelste paneel het fluorescentiebeeld van het axon met een lage ruimtelijke resolutie toont, verkregen met de CCD die werd gebruikt voor membraanpotentiaal-imaging, presenteert het onderste paneel de elektrodeopnamen van het soma en de optische opnamen van de A IS en de node of rvi. Zowel de ruwe gegevens als de bewerkte signalen worden weergegeven. Deze figuur toont de actiepotentiaalsignalen van het axon van een L vijf corticale neuron geladen met de spanningsgevoelige kleurstof action.

Potentiële gerelateerde signalen werden geregistreerd met een beeldsnelheid van 10 kilohertz. Deze sporen geven de actiepotentiaaltransiënt weer vanaf drie locaties. Ten eerste, de elektrode die registreert vanuit het soma.

Ten tweede, de optische opnames van de axonheuvel, en ten derde, de optische opname van de eerste knoop van Vie, en hier zijn de supergeponeerde signalen van dezelfde drie locaties. Deze figuur toont een burst van vier terugpropagerende actiepotentiaalsignalen vanaf meerdere locaties op de dendritische boom van een L5 corticaal neuron, geïnitieerd door korte depolariserende stroompulsen bij 100 hertz. Hier worden de actiepotentiaalsignalen van een individuele dendritische spine getoond.

Hier is de anatomische reconstructie verkregen uit een stapel spinning disc confocale beelden, en hier is het fluorescentiebeeld van dezelfde regio verkregen met de CCD-camera. Voor membraanpotentiaal-imaging worden in het rechterpaneel de fluorescentie-intensiteitssporen getoond die overeenkomen met terugpropagerende actiepotentialen vanaf locaties één tot en met drie, zoals aangegeven op het CCD-beeld. Het onderste spoor geeft de elektrodeopname van het soma aan.

De voorbereiding voorafgaand aan de registratie duurt ongeveer drie uur, inclusief de wachttijd tot de dice zich verspreiden naar de distale processen. De registratietijd wordt beperkt door de normale degradatie van het preparaat en door fotodynamische schade door PO. De mate van fotodynamische schade is proportioneel aan de intensiteit van het excitatielicht, en aan de duur en het aantal individuele registratiepogingen.

In sommige experimenten is het mogelijk om meer dan 50 opnamemetingen uit te voeren over een periode van één of twee uur. Andere metingen vereisen een hoge excitatie, lichtintensiteiten en langere opnames, en zijn beperkt tot slechts enkele opnamemetingen vanwege fotodynamische schade. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in het uitvoeren van spanningsimaging van de gehele axonale en endrale structuur van individuele neuronen in hersensecties.