Voltage-gevoelige kleurstof Opnemen van axonen, dendrieten en dendritische spines van individuele neuronen in Brain Slices

Het algemene doel van de beschreven experimenten is het monitoren van de integratie van het membraanpotentiaal signaal en informatieverwerking door een individuele zenuwcel optisch met sub micrometer en sub milliseconde resolutie vanuit meerdere locaties op een neuron. Dit wordt bereikt door eerst een beeldvormingsset-up te bouwen met geschikte gevoeligheid om het opnemen van kleine fractionele veranderingen in lichtintensiteit mogelijk te maken, die overeenkomen met de transiente membraanpotentiaal. Vervolgens selecteer de neuronen met geschikte anatomie voor effectieve beeldvorming van neuronen met lange intacte processen in een enkele focale vlak dicht bij het oppervlak van de slice.

Laad vervolgens de voorgeselecteerde neuronen met spanningsgevoelige kleurstoffen om optisch volgen van de membraanpotentiaal veranderingen mogelijk te maken. Resultaten tonen de unieke mogelijkheid van deze benadering om informatie te verkrijgen over elektrische signaalintegratie door individuele zenuwcellen door het monitoren van membraanpotentiaal signalen van axonen, dendrieten en dendritische stekels. In cellulaire neurofysiologie.

Er worden nieuwe tools ontwikkeld vanwege de twee langdurige beperkingen van conventionele elektrofysiologie, lage ruimtelijke resolutie van elektrodemetingen en onvermogen om op te nemen van kleine structuren zoals axonen collaterals of dendritische stekels. Om deze nadelen te overwinnen, kan de patch-elektrode-aanpak worden gecombineerd met optische technieken die parallelle opnames van alle delen van een neuro toestaan. Hier beschrijven we een dergelijke techniek, meervoudige zijoptische opname van membraanpotentiaal transients met enkele stekelresolutie.

In dit experiment wordt een rechtopstaande microscoop en drie camera's gebruikt om een uniforme verlichting aan te passen. Plaats eerst een geschikte neutrale dichtheidsfilter in de laserstraalpad. Focus vervolgens het objectief op het oppervlak van de standaard fluorescente dia.

Terwijl het CCD-beeld van het gezichtsveld op het beeldscherm wordt waargenomen, pas de positie van het ontvangende uiteinde van de kwarts lichtgeleider en de positie van het uitgangseinde van de lichtgeleider aan met behulp van geschikte actuatoren op de epi-fluorescentie condenser om gecentreerde en uniforme verlichting van het gezichtsveld te bereiken. Om het trillingsgeluid te bepalen, gebruik een standaard fluorescente dia met een niet-fluorescente markering op het oppervlak. Neem de lichtintensiteit op met de neuro CCD in continue modus.

Focus het objectief op een donkere rand van de zwarte markering en neem de lichtintensiteit gedurende ongeveer 100 milliseconden op met een frame rate van twee kilohertz. Toon vervolgens het ruimtelijke gemiddelde van de fractionele lichtintensiteitssporen van ongeveer 20 pixels die licht ontvangen van het uniform verlichte gebied en van ongeveer 20 pixels langs de rand van de zwarte markering. Het overtollige ruis in het ruimtelijke gemiddelde van de pixels met hoge contrast randen weerspiegelt het trillingsgeluid in het systeem.

Het is essentieel om de mechanische sluiter te monteren buiten de trillingsisolatietafel zodat het openen van de sluiter geen trillingsgeluid in de optische opname introduceert. Dit is een kritische stap. Monteer de sluiter met behulp van plastic schroeven en trillingsisolatiemateriaal om de akoestische trillingsruis die kan worden opgepikt door het optische opnamesysteem te verminderen.

Om de trillingen te isoleren, pas de trillingsisolatietafel aan totdat het trillingsgeluid van de pixels die de scherpe rand van het beeld bedekken kleiner is dan het shotsruis. De apparatuurdraden op de tafel moeten los zijn om te voorkomen dat de mechanische trillingen naar de microscoop worden overgebracht. Bereid in deze procedure de hersensneden van 300 tot 400 micron dikte volgens standaardprocedures met een muislijn die EGFP tot expressie brengt in individuele zenuwcellen van belang met een spinnende schijf confocale systeem.

Visualiseer de EGFP-gelabelde neuronen in de slice. Selecteer vervolgens de neuronen met intacte dendritische axonale bomen en met processen die parallel en dicht bij het oppervlak van de slice lopen voor membraanpotentiaalbeeldvorming. Vul vervolgens een glazen patch pipet vanaf de punt met kleurstof-vrije intracellulaire oplossing tot twee derde van de elektrodeteversmalling door negatieve druk gedurende ongeveer 15 seconden toe te passen.

Vul vervolgens de elektrode terug met de oplossing die de membraan IMP-permeabele spanningsgevoelige kleurstof bevat die is opgelost in de intracellulaire oplossing. Patch nu een eerder geselecteerde neuron binnen één minuut nadat de kleurstof in de elektrode is geladen. Breng lage positieve druk aan van ongeveer 10 millimeter kwik voordat de pipet in het bad wordt neergelaten en terwijl de elektrode in de slice wordt gepositioneerd, dit zorgt ervoor dat er geen kleurstof uit de elektrode lekt voordat de verzegeling is vastgesteld.

Verhoog naar hoge druk rond de 100 millimeter kwik net voordat de elektrode het celoppervlak raakt. Stel de verzegeling in in de gehele celconfiguratie, sta de vrije diffusie van de kleurstof toe van een somatische patch pipet naar het soma gedurende 20 tot 45 minuten. Tijdens de diffusie van de kleurstof, bewaak de fysiologische toestand van de neuron door het opnemen van de geëvokte actiepotentialen in de stroomklemmodus.

Bewaak bovendien de hoeveelheid kleuring door het opnemen van de rustlichtintensiteit van de cel soma met een frame rate van twee kilohertz en bij een fractie van volledige lichtintensiteit aangepast met neutrale dichtheidsfilters. Continueer het downloadproces totdat het actiepotentiaal begint te verbreden. Aan het einde van de kleuring, trek voorzichtig de patch pipet weg van het soma in voltage clamp configuratie om ervoor te zorgen dat de overgang van gehele cel naar buiten uit patch configuratie wordt bereikt in het proces.

Vervolgens incubeer de slice gedurende een extra 1,5 tot twee uur bij kamertemperatuur om de spanningsgevoelige kleurstof in de neuronale processen te laten verspreiden. Nadat een aanzienlijke hoeveelheid kleurstof van het soma is gediffundeerd in de dendritische en axonale processen, zou de golfvorm van het actiepotentiaal volledig moeten zijn hersteld. In de volgende stap, lokaliseer het soma van de kleuring neuron onder de lage intensiteit fluorescentie.

Verla