Name: Voltage-gevoelige kleurstof Opnemen van axonen, dendrieten en dendritische spines van individuele neuronen in Brain Slices (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 51 s
Description: Leer voltage-gevoelige kleurstofbeeldvorming voor membraanpotentiaalmonitoring in individuele neuronen met sub-micrometer resolutie. Deze methode maakt optische registratie van elektrische signalen in axonen, dendrieten en dendritische spines mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken onze medewerkers Knut Holthoff, Arthur Konnerth en Marco Canepari die in de initiële ontwikkeling van deze techniek alsook aan Leslie M. Loew deelgenomen voor vriendelijk het verstrekken van kleurstoffen. Ondersteund door NSF subsidie ​​IOS-0817969, NIH beurzen NS068407 en M136043 en door Kavli Instituut voor Neurowetenschappen aan de Yale University.

1. Plaatsing van het apparaat Stap 1.1. Imaging setup De sleutel tot het opnemen van spanning gevoelige kleurstof signalen geschikt setup ontwerp. We maken gebruik van een rechtopstaande microscoop (BX51WI Olympus of Zeiss AxioExaminer) uitgerust met drie camera&#39;s. De setup is ontworpen voor het verlichten van individuele neuronen in de hersenen plakjes door excitatie licht in epi-fluorescentie, wide-field microscopie-modus met behulp van Nikon 60X/1.0 NA of Zeiss 63X/1.0 NA water dompelen doelstellingen. Onze microscopen zijn met bouten aan een trillingsisolatie tafel en uitgerust met gemotoriseerde beweegbare trappen. Elke microscoop is uitgerust met drie camera-poorten. Een camera-poort heeft een standaard hoge ruimtelijke resolutie CCD camera voor infrarood DIC video-microscopie (IR-1000, Dage MTI, USA). De tweede camera haven heeft een snelle data-acquisitie camera (tot 20 kHz frame rate) met een relatief lage ruimtelijke resolutie (80 x 80 pixels), maar uitstekend dynamisch bereik (14 bits) en uitzonderlijk lage gelezenruis (NeuroCCD-SM, RedShirtImaging LLC, Decatur, GA). De derde poort camera een CCD camera met hoge ruimtelijke resolutie (PixelFly, 1392x1024 pixels, PCO AG, Duitsland) op een draaiende schijf confocale scanner (CSU-10, Yokogawa, Japan) gebruikt om z-stapels confocale beelden te verzamelen voor gedetailleerde morfologische reconstructie van de gekleurde cel. Een frequentie-verdubbelde diode-gepompte Nd: YVO4 continue laser (400 mW) die uitzendt bij 532 nm (MLL-III/400 mW; CNI, Changchun, China) is de bron van excitatie licht. De 2 mm diameter laserbundel geregeld door een sluiter (LS6; Vincent Associates) is gericht op een lichtgeleider gekoppeld aan de microscoop via een enkele poort epifluorescentie condensor (TILL Photonics GmbH, Gräfelfing, Duitsland) om de rug van de opening te vol objectief zijn en in de buurt gelijkmatige verlichting van het object vliegtuig. Het laserlicht wordt gebruikt in plaats van een conventionele Xenon-lamp om de gevoeligheid van V m-imaging maximaliseren door: (1) met een monochroom excitation licht bij de rode vleugel van het absorptiespectrum aan V m gevoeligheid van de kleurstof 9, 10 en (2) de intensiteit van het excitatie licht boven het niveau dat kan worden bereikt door een boog-lamp te maximaliseren. Het excitatielicht werd gereflecteerd op het preparaat door een dichroïsche spiegel met een centrale golflengte van 560 nm en de gemeten fluorescentie werd door een 610 nm filter barrière (a Schott RG610). Het gecombineerde effect van een verhoging van de lichtintensiteit en het gebruik van vrijwel optimale monochromatische golflengten was een dramatische verbetering in de gevoeligheid van spanning beeldvorming met een factor van ongeveer 50 vergeleken met eerdere metingen 6. Stap 1.2. Stel voor gelijkmatige verlichting Gebruik een fluorescentie slide standaard (groen excitatie / rood emissie). Vermeld de betrokken grijsfilters in de laserstraal pad zodat de CCD niet verzadigd. Het doel gericht op het oppervlak vande dia. De positie van het ontvangende einde van de kwarts lichtgeleider voor de laser launcher doel en de positie van de uitgang van de lichtgeleider aan de microscoop met geschikte aandrijvingen op epi-fluorescentie condensor te bereiken gecentreerd en uniforme verlichting van het gezichtsveld. Stap 1.3. Bepaal vibrationele geluid Plaats een kleine zwarte inkt markering op het oppervlak van de fluorescentie dia. Record lichtintensiteit met NeuroCCD in de continue opnamemodus. Focus de doelstelling op een donkere rand van de zwarte inkt merk. Noteer de lichtintensiteit voor ongeveer 100 msec bij 2 kHz frame rate. Geven de ruimtelijke gemiddelde van de fractionele lichtintensiteit sporen (AF / F) van ~ 20 pixels Lichtontvangst van het gelijkmatig verlicht gebied en van ~ 20 pixels langs de rand van de inkt merk. De overmaat ruis in opnamen van pixels met een hoog contrast randen weerspiegelt de vibrationele geluid inhet systeem. Stap 1.4. Trillingsisolatie Het is verplicht om trillingen te verminderen door een Trillingsisolatie tafel tot onder het schot lawaai lichtintensiteiten vergelijkbaar experimentele opnameomstandigheden. Pas de trillingsisolatie tafel totdat de trilling geluid in de lichtintensiteit van pixels die de scherpe rand van de afbeelding is te verwaarlozen. Geen van de apparatuur met bewegende delen (mechanische sluiters, ventilatoren) worden aangebracht op de tafel. De kabels van de apparatuur op de tafel gehecht aan andere componenten die niet geïsoleerd zijn van trillingen moet los zijn, zodat ze niet mechanische trillingen doorgeven aan de microscoop. 2. Selectie van een geschikte Neuron voor V m-Imaging Stap 2.1. Selectie van neuronen Maken hersencoupes volgens standaard procedures. Gebruik een muis tot expressie EGFP in individuele zenuwcellen van iBELANG. Met een draaiende schijf confocale systeem, visualiseren EGFP gelabelde neuronen in de slice. Selecteer neuronen voor V m-beeldvorming met intact dendritische / axonale bomen en processen parallel en dicht bij het ​​oppervlak van de plak. Dit kan niet worden bereikt in wild-type muizen door axonen en dendrieten dunne, voor het grootste deel, niet zichtbaar in DIC microscopie mode. 3. Laden Neuronen met voltage-gevoelige kleurstof Stap 3.1. Het vullen van de patch pipet Vul het glas patch pipetten van de tip met kleurstof-vrije intracellulaire oplossing door negatieve druk gedurende ongeveer 15 s tot 2/3 van de electrode taper. De kleurstof vrije oplossing in de punt moet de lekkage van kleurstof te voorkomen op het segment dat de achtergrond fluorescentie verhoogt en verlaagt de signaal-ruisverhouding. Back-vul de elektrode met de oplossing die het membraan impermeant voltagegevoelige kleurstof opgelost JPW3028in intracellulaire oplossing (0,8 mM). JPW3028, de meest succesvolle voltage probe voor intracellulaire toepassing is een dubbel positief geladen analoog ANEP de reeks lipofiele styrylkleurstoffen nog voldoende water oplosbaar te worden gebruikt voor micro-injectie. De di-ethyl analoog van deze kleurstof heeft vrijwel dezelfde eigenschappen (zoals spanning-gevoeligheid) en is commercieel verkrijgbaar als JPW1114 (zie tabel 1). We bereiden 20 mM voorraad oplossing in gedestilleerd H 2 O. 50 ul aliquots van de stock oplossing worden ingevroren bij -20 ° C. Voor de uiteindelijke kleurstofconcentratie van 0,8 mM wordt 2 pi van de stock oplossing opgelost in 50 pi intracellulaire oplossing op de dag van het experiment. De voorraad kleurstofoplossing is stabiel en kan worden bewaard bij kamertemperatuur gedurende enkele maanden. Zo houden we 50 pi aliquot bij kamertemperatuur totdat het is uitgeput. Stap 3.2. Snel een giga-seal <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Patch vooraf gekozen neuron en laat vrije diffusie van de kleurstof uit een somatische patch pipet om de soma in de hele cel configuratie voor 20-45 min. Het is essentieel om een ​​afdichting zo snel mogelijk te verkrijgen zodat de hoeveelheid kleurstof in oplossing zonder de tip te klein gehouden. Beginnen oefenen snel patchen zonder kleurstof in de elektrode. Vervolgens praktijk patching en laden neuronen met de kleurstof met als doel het gebruik van een minimale hoeveelheid kleurstof-vrije oplossing in de punt zonder contaminerende het omringende weefsel. Met de praktijk is het mogelijk om een ​​afdichting vast binnen 1-2 min. Stap 3.3. Toezicht op het niveau van kleuring Tijdens kleurstofdiffusie in het whole-cell configuratie, de fysiologische toestand van de neuron door het opnemen opgewekte actiepotentialen in de stroom-modus klem. Daarnaast controleren het bedrag van vlekken door het opnemen van de rust lichtintensiteit (RLI) uit de cel soma op een frame rate van 2 k<html> Hz en een fractie van volledige lichtintensiteit aangepast met grijsfilters (we 0,04% van de laser lichtintensiteit van een 400 mW laser). Blijven de kleurstof laden totdat de actiepotentiaal begint, verbreden gewoonlijk na 20-40 minuten, afhankelijk van de grootte van de elektrode en weerstand. De verbreding van de piek is volledig omkeerbaar en waarschijnlijk door capacitieve belasting effect van de verzadigde concentratie van de kleurstof in de somatische membraan. De golfvorm van het spike volledig hersteld na de kleurstof concentratie geëquilibreerd gehele neuron. Stap 3.4. Verwijder de kleurstof electrode Aan het einde van periode kleuring voorzichtig trek de patch pipet uit de soma in spanningsklem configuratie zorgen dat de overgang van hele-cel outside-out patch configuratie wordt bereikt in het proces. Stap 3.5. Wacht kleurstofdiffusie ent &quot;&gt; Incubeer de plak tegen 1,5-2 uur bij kamertemperatuur te houden met de spanningsgevoelige kleurstof te verspreiden in neuronale processen. Na een aanzienlijke hoeveelheid kleurstof diffundeert weg van de soma naar dendritische en axonale processen, de golfvorm van het AP is volledig gerestaureerd. 4. Optical Recording Stap 4.1. Een cellulair compartiment voor imaging Zoek de soma van de vlek neuron bij weinig licht niveau fluorescentie en re-patch de neuron met een standaard (geen kleurstof) patch elektrode onder DIC. Visualiseer neuronale processen onder lage lichtniveau op een frame rate van 10-40 Hz in de continue opnamemodus van de CCD voor spanning-imaging. Verminder het lichtniveau met grijsfilters tot het vereiste minimum om het object van belang te visualiseren. We gebruiken 0,01% 400 mW laser intensiteit tijdens het plaatsen van de gekleurde neuron. Met behulp van een XY-fase, de positie van de neuronale proces van belang in thij midden van het opnamegebied. Bescherm de soma van het excitatielicht met de gedeeltelijk gesloten veldstop iris van de microscoop. Afscherming van de soma van hoge intensiteit excitatie licht zal aanzienlijk verminderen van de fotodynamische schade tijdens het opnemen. Stap 4,2 Record optische signalen met betrekking tot membraanpotentiaal transiënten Neem optische signalen met betrekking tot backpropagated AP in individuele dendritische takken. Noteer optische signalen over AP in de axon. Neem optische signalen met betrekking tot backpropagating AP in dendritische spines. Gebruik frame rates geschikt voor nauwkeurige reconstructie van signaalgolfvorm en houden de opnameperiodes en blootstelling aan hoge intensiteit excitatielicht zo kort mogelijk kleurstof bleken en fotodynamische schade te minimaliseren. Bijvoorbeeld, het onderzoek van de sequentie van initiatie en propagatie van enkelvoudige actiepotentialen in de axon heeft opnameperiodes van 5-10 msec. De excitatie licht geïntensiveerdty tijdens opname is een compromis tussen de signaal-ruisverhouding enerzijds en de mate van kleurstof bleken en fotodynamische schade anderzijds. We gebruiken 100% van de intensiteit van 400 mW laser in opname van lange stukken axonen bij een gebied van 300 urn in diameter brandt. Wanneer het excitatielicht wordt gefocusseerd 30 urn diameter gebied dendritische spine imaging gebruiken we 10-25% van de laser lichtintensiteit. De vereiste duur van de opname is een belangrijke determinant van de optimale excitatie lichtintensiteit; kortere opname periodes kunnen hogere lichtniveaus. De optimale lichtintensiteit is best empirisch bepaald voor elke bereiding en meetpunt. 5. Data-analyse Stap 5.1. Corrigeer de ruwe gegevens voor bekende fouten De analyse en weergave van gegevens werden uitgevoerd met behulp van het NeuroPlex programma (RedShirtImaging) geschreven in IDL (ITT Visual Information Solutionen, Boulder, Colorado) en aangepaste Visual Basic routines. Onder de voorwaarden van lage lichtniveaus, de achtergrond fluorescentie wordt een belangrijke determinant van de AF / F-signaal grootte. De ruwe gegevens werden eerst gecorrigeerd voor dit effect door de gemiddelde achtergrond fluorescentie-intensiteit van een bepaald gebied op de unstained slice. Vervolgens werd het signaal uitlijning software gebruikt om te corrigeren voor tijdelijke jitter in AP initiatie en voor eventuele kleine bewegingen van het preparaat tijdens gemiddeld. In het tijdsdomein werden AP signalen uitgelijnd kruiscorrelatie van het elektrisch opgenomen AP in elk onderzoek het referentiesignaal verkregen bij het ​​begin van middelen (Figuur 1B). In het ruimtelijke domein, werden beelden uitgelijnd in twee dimensies offline door image kruiscorrelatie te compenseren voor mogelijke kleine laterale bewegingen van het preparaat. De juiste focus van het beeld in de z-dimensie werd gecontroleerd voordat elke individuele proces; smal<html> l aanpassingen waren vaak noodzakelijk. De tijd en ruimte uitgelijnd signalen werden gemiddeld zie figuur 1B. Langzame veranderingen in lichtintensiteit door bleken van de kleurstof gecorrigeerd door het data met een geschikte dubbele exponentieel afgeleid van de opname trials zonder stimulatie (Figuur 1B). De golfvorm van het AP signaal gereconstrueerd uit een reeks gegevenspunten met Cubic spline-interpolatie, een stuksgewijze continue curve die door elk gegevenspunt. Te bevestigen dat de spanningsgevoelige kleurstofsignaal membraanpotentiaal nummers zonder significante vervorming in de milliseconde tijdschaal, werd het elektrische signaal van de AP soma vergeleken met de optische AP signaal van de aangrenzende axon heuvel zie figuur 3B. De twee signalen superponeren voet, waardoor het schot ruis in optical recording. les/ftp_upload/4261/4261fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1. Data-analyse (animatie). (A) Bovenste paneel: hoge resolutie confocale beeld van een gekleurd neuron met axon in de opname stand. Registratie-elektrode aan soma en extracellulaire stimulerende elektrode naast basale dendriet schematisch weergegeven. Actiepotentialen opgeroepen door extracellulaire, synaptische stimulatie. Onderpaneel: lage ruimtelijke resolutie fluorescentiebeeld van het axon verkregen CCD voor V m imaging (B) Electrode opnames van soma (zwarte sporen), optische opnamen van AIS (rode sporen), en van knooppunt van Ranvier (groen sporen). . Top sporen: ruwe data van 9 studies waaruit blijkt tijdelijke jitter in AP initiatie. Tweede rij sporen: tijdelijk uitgelijnd signalen. Derde rij van sporen: gemiddelde signaal. Vierde rij van sporen: bleekmiddel correctie. Bottom sporen: cubic spline interpolatie met een pass van tijdelijke smoothing.

<ol><li>Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+recording+from+mossy+fiber+terminals+in+hippocampal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices.</a> Nature Protocols. 1, 2075-2081 (2006).</li>
<li>Cohen, L. B., Salzberg, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of membrane potential.</a> Ann. Rev. Neurosci. 1, 171-182 (1978).</li>
<li>Cohen, L. B. Historical overview and general methods of membrane potential imaging. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCohen%2C+LB+%22Membrane+Potential+Imaging+in+the+Nervous+System%22">Membrane Potential Imaging in the Nervous System</a>. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).</li>
<li>Canepari, M., Djurisic, M., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+signals+from+rat+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons+during+coincident+pre-+and+post-synaptic+activity%3A+a+combined+voltage-+and+calcium+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Dendritic signals from rat hippocampal CA1 pyramidal neurons during coincident pre- and post-synaptic activity: a combined voltage- and calcium imaging study.</a> J. Physiol. 580, 463-484 (2007).</li>
<li>Canepari, M., Popovic, M., Vogt, K., Holthoff, K., Konnerth, A., Salzberg, B. M., Grinvald, A., Antic, S. D., Zecevic, D. Imaging submillisecond membrane potential changes from individual regions of single axons, dendrites and spines. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCanepari%2C+M+%22Membrane+Potential+Imaging+in+the+Nervous+System%22">Membrane Potential Imaging in the Nervous System</a>. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).</li>
<li>Djurisic, M., Antic, S., Chen, W. R., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+imaging+from+dendrites+of+mitral+cells%3A+EPSP+attenuation+and+spike+trigger+zones%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Voltage imaging from dendrites of mitral cells: EPSP attenuation and spike trigger zones.</a> J. Neurosci. 24, 6703-6714 (2004).</li>
<li>Holthoff, K., Zecevic, D., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+time-course+of+action+potentials+in+spines+and+remote+dendrites+of+mouse+visual+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid time-course of action potentials in spines and remote dendrites of mouse visual cortical neurons.</a> J. Physiol. 588, 1085-1096 (2010).</li>
<li>Kole, M. H. P., Letzkus, J. J., Stuart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+initial+segment+Kv1+channels+control+axonal+action+potential+waveform+and+synaptic+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axon initial segment Kv1 channels control axonal action potential waveform and synaptic efficacy.</a> Neuron. 55, 633-647 (2007).</li>
<li>Kuhn, B., Fromherz, P., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+of+Stark-shift+voltage-sensing+dyes+by+one-+or+two-photon+excitation+near+the+red+spectral+edge%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+J%22%5BJournal%5D)">High sensitivity of Stark-shift voltage-sensing dyes by one- or two-photon excitation near the red spectral edge.</a> Biophysical J. 87, 631-639 (2004).</li>
<li>Loew, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+characterization+of+electrochromic+membrane+probes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Biophys.+Method%22%5BJournal%5D)">Design and characterization of electrochromic membrane probes.</a> J. Biochem. Biophys. Method. 6, 243-260 (1982).</li>
<li>Loew, L. Design and use of organic voltage sensitive dyes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLoew%2C+L+%22Membrane+Potential+Imaging+in+the+Nervous+System%22">Membrane Potential Imaging in the Nervous System</a>. Canepari, M., Zecevic, D. , Springer Neuroscience. New York. (2010).</li>
<li>Palmer, L. M., Stuart, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site+of+action+potential+initiation+in+layer+5+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Site of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons.</a> J. Neurosci. 26, 1854-1863 (2006).</li>
<li>Popovic, M. A., Foust, A. J., McCormick, D. A., Zecevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatio-temporal+characteristics+of+action+potential+initiation+in+layer+5+pyramidal+neurons%3A+a+voltage+imaging+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The spatio-temporal characteristics of action potential initiation in layer 5 pyramidal neurons: a voltage imaging study.</a> J. Physiol. 589, 4167-4187 (2011).</li>
<li>Ross, W. N., Salzberg, B. M., Cohen, L. B., Grinvald, A., Davila, H. V., Waggoner, A. S., Wang, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+absorption%2C+fluorescence%2C+dichroism%2C+and+birefringence+in+stained+giant+axons%3A+optical+measurement+of+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Membr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in absorption, fluorescence, dichroism, and birefringence in stained giant axons: optical measurement of membrane potential.</a> J. Membr. Biol. 33, 141-183 (1977).</li>
<li>Shu, Y., Duque, A., Yu, Y., Haider, B., McCormick, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+action+potential+initiation+in+neocortical+pyramidal+cells%3A+evidence+from+whole+cell+axon+recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Properties of action potential initiation in neocortical pyramidal cells: evidence from whole cell axon recordings.</a> J Neurophysiol. 97, 746-760 (2007).</li>
<li>Wu, J. -Y., Cohen, L. B. Fast multisite optical measurement of membrane potential. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWu%2C+J-Y+%22A+practical+guide+to+technology+for+quantitative+real-time+analysis%22">A practical guide to technology for quantitative real-time analysis</a>. Mason, W. T. , Academic. New York. 389-404 (1993).</li>
<li>Yuste, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYuste%2C+R+%22Dendritic+Spines%22">Dendritic Spines</a>. , MIT Press. (2010).</li>
</ol>

Dejan Zecevic verklaart dat hij een mede-eigenaar van RedShirtImaging nuttig., Een bedrijf gespecialiseerd in high-speed, low noise CCD-camera&#39;s worden gebruikt in voltage-gevoelige kleurstof opname. Alle andere auteurs melden geen financiële belangen of mogelijke belangenconflicten met betrekking tot de huidige studie.

Dit artikel beschrijft een spanningsgevoelige kleurstof registreerwerkwijze voor Electrical activiteit van individuele neuronen met sub-micrometer en een milliseconde spatiotemporele resolutie. Laserexcitatie bij vrijwel optimale golflengte (over signaalgrootte) verbeterde de gevoeligheid van opname met een factor ~ 50 over eerdere benaderingen. De huidige gevoeligheid maakt de controle elektrische signalen uit alle delen van individuele neuronen, met inbegrip van dendrieten, axonen, axon collateralen en axon terminals ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het onderdeel </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Setup componenten </td></tr><tr><td> Upright Microscoop </td><td> Olympus Inc </td><td> BX51WI </td><td> Met drie camera-poorten </td></tr><tr><td> Gemotoriseerde verplaatsbaar podium </td><td> Siskiyou </td><td> MXOPi.2 </td><td></td></tr><tr><td> Epi-fluorescentie Condensor voor Olympus BX51 </td><td> TILL Fotonica </td><td> 0000-560-11659 </td><td></td></tr><tr><td> Upright Microscoop </td><td> Carl Zeiss, LLC </td><td> AxioExaminer D1 </td><td> Met drie camera-poorten </td></tr><tr><td> Gemotoriseerde Top Plate </td><td> Scientifica Limited </td><td> MMBP </td><td></td> &lt;/ Tr&gt; <tr><td> Epi-fluorescentie Condensor voor Zeiss AxioExaminer </td><td> TILL Fotonica </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Data Acquisition Camera </td><td> RedShirtImaging LLC </td><td> NeuroCCD-SM </td><td> Hoge snelheid, lage ruis lezen </td></tr><tr><td> CCD voor IR-DIC </td><td> Dage-MTI </td><td> IR-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Spinning-Disc Confocale Scanner </td><td> Yokogawa </td><td> CSU-10 </td><td></td></tr><tr><td> Hoge ruimtelijke resolutie CCD op Confocale Scanner </td><td> PCO AG </td><td> PixelFly </td><td> 1392x1024 pixels </td></tr><tr><td> DPSS CW laser (532 nm) </td><td> CNI Optoelectronics Tech. Co, Ltd </td><td> MLL-III-532 400mW </td><td> Excitatielichtbron </td></tr><tr><td> Multi-Mode Fiber Launcher </td><td> Siskiyou </td><td> SM-CFT </td><td></td></tr><tr><td> Light Guide </td><td> TOT Fotonics </td><td> 0000-515-11524 </td><td></td></tr><tr><td> Sluiter </td><td> Vincent Associates </td><td> LS6 </td><td></td></tr><tr><td> Vibration Isolation Tabel </td><td> Minus k Technology </td><td> MK26 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Specifieke reagentia </td></tr><tr><td> Di-2-ANEPEQ (JPW 1114) </td><td> Life Technologies </td><td> D-6923 </td><td> Voltagegevoelige kleurstof </td></tr><tr><td> Crym-EGFP Mouse Line </td><td> GENSAT (MMRRC) </td><td> STOCK Tg (Crym-EGFP) GF82Gsat/Mmcd </td><td> Dun uitdrukken EGFP in Laag 5 corticale neuronen </td></tr></tbody></table>

voltage-gevoelige kleurstof opnemen van axonen, dendrieten en dendritische spines van individuele neuronen in brain slices

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Het begrijpen van de biofysische eigenschappen en functionele organisatie van enkele neuronen en hoe ze informatie verwerken is essentieel om te begrijpen hoe de hersenen werken. De primaire functie van een zenuwcel is om elektrische signalen te verwerken, gewoonlijk uit meerdere bronnen. Elektrische eigenschappen van neuronale processen buitengewoon complex dynamisch en, in het algemene geval, onmogelijk te voorspellen in afwezigheid van gedetailleerde metingen. Om een ​​dergelijke meting zou worden verkregen, ideaal, wil graag in staat zijn om, monitoren op meerdere plaatsen, subdrempel gebeurtenissen als ze reizen van de sites van de oorsprong op de neuronale processen en summate op bepaalde locaties te actiepotentiaal initiatie beïnvloeden. Dit doel is niet bereikt in een neuron als gevolg van technische beperkingen van metingen die elektroden gebruiken. Te overwinnen dit nadeel is het zeer wenselijk om de patch-elektrode benadering vullen met beeldvormingstechnieken die uitgebreide parallel staan ​​recordings uit alle delen van een neuron. We beschrijven een dergelijke techniek - optische registratie van membraanpotentiaal transiënten met organische spanningsgevoelige kleurstoffen (V m-imaging) - gekenmerkt door een milliseconde en sub-micrometer resolutie. De methode is gebaseerd op pionierswerk op spanningsgevoelige moleculaire probes 2. Veel aspecten van de initiële technologie zijn er continu verbeteringen over meerdere decennia 3, 5, 11. Bovendien eerder werk beschreven twee essentiële kenmerken van V m-imaging. Ten eerste fluorescentiesignalen zijn recht evenredig met membraanpotentiaal over het gehele fysiologische bereik (-100 mV tot +100 mV, 10, 14, 16). Ten tweede wordt geladen neuronen met de spanningsgevoelige kleurstof hier gebruikte (JPW 3028) geen detecteerbare farmacologische effecten. De opgenomen verbreding van de piek tijdens de kleurstof laden is volledig omkeerbaar 4, 7. Bovendien experimenten is aangetoond dat het mogelijk is te verkrijgeneen groot aantal (tot honderden) opnames vóór elke detecteerbare fototoxische effecten 4, 6, 12, 13. Er profiteren van de uitstekende helderheid en stabiliteit van een laser lichtbron met nagenoeg optimale golflengte de gevoeligheid van de V-m beeldvormingstechniek maximaliseren. De huidige gevoeligheid maakt het mogelijk meerdere locaties optische opnamen van V m transiënten uit alle delen van een neuron, met inbegrip van axonen en axon collateralen, terminal dendritische takken, en individuele dendritische spines. De verkregen gegevens over interacties signaal kwantitatief worden als direct gevisualiseerd in de vorm van een film geanalyseerd.

Succesvolle confocale microscopie moet tot duidelijke identificatie van intact neuronale processen die dicht bij het oppervlak van de plak en in een vlak van focus. De selectie van zenuwcellen die geschikt zijn voor spanning beeldvorming voorafgaand aan de voltage-gevoelige kleurstof laden is van cruciaal belang. Een voorbeeld van confocale beelden van L5 piramidale neuronen die EGFP in een corticaal segment (Crym transgene muizenlijn) wordt getoond in figuur 2. Axonen van individuele neuronen duidelijk...

Een beeldvormende techniek voor de monitoring van membraanpotentiaal verandert met sub-micrometer ruimtelijke en minder dan een milliseconde tijdsresolutie wordt beschreven. De techniek is gebaseerd op laser-excitatie van voltage-sensitieve kleurstoffen, maakt metingen van signalen in de axonen en axon collateralen, terminal dendritische takken, en individuele dendritische spines.

Voltage-gevoelige kleurstof Opnemen van axonen, dendrieten en dendritische spines van individuele neuronen in Brain Slices

Het begrijpen van de biofysische eigenschappen en de functionele organisatie van individuele neuronen en de wijze waarop zij informatie verwerken, is fundamenteel voor het begrijpen van ...

Het algemene doel van de beschreven experimenten is het optisch monitoren van de integratie van membraanpotentiaalsignalen en informatieverwerking door een individuele zenuwcel met submicrometer- en submilliseconde-resolutie vanaf meerdere locaties op een neuron. Dit wordt bereikt door eerst een imaging-opstelling te bouwen met een geschikte gevoeligheid om de registratie van kleine fractionele veranderingen in lichtintensiteit mogelijk te maken die overeenkomen met de transiënten van het membraanpotentiaal. Vervolgens worden neuronen geselecteerd met een geschikte anatomie voor effectieve imaging, namelijk neuronen met lange, intacte uitlopers in één enkel brandvlak dicht bij het oppervlak van het snede preparaat.Laad vervolgens de vooraf geselecteerde neuronen met voltagesensitieve kleurstoffen om optische tracking van de veranderingen in het membraanpotentiaal mogelijk te maken. De resultaten tonen de unieke mogelijkheid van deze benadering om informatie te verkrijgen over de integratie van elektrische signalen door individuele zenuwcellen door het monitoren van membraanpotentiaalsignalen van axonen, dendrieten en dendritische stekels. In de cellulaire neurofysiologie.Nieuwe ins

voltage-sensitive-dye-recording-from-axons-dendrites-dendritic-spines

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit rapport toont een techniek voor mechanische isolatie van individuele levensvatbare neuronen te behouden bevestigd presynaptische boutons. Vibrodissociated neuronen hebben de voordelen van een snelle productie, een uitstekende farmacologische controle en een betere ruimte-clamp zonder invloed van naburige cellen. Deze methode kan gebruikt worden voor beeldvorming van synaptische elementen en patch-clamp opname.

Vibrodissociation van de neuronen van knaagdieren Brain Slices synaptische transmissie en Image presynaptische Terminals Study

This video demonstrates a technique for patch-clamp recording from the dendritic membrane surface. This helps to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels in dopaminergic neurons.

Patch-Clamp Recordings from the Dendrite of a Dopaminergic Neuron in a Brain Slice

This video demonstrates a procedure for observing changes in neuronal activity in a brain slice stained with a voltage-sensitive dye. The dye reflects changes in the neuron's membrane potential by altering its fluorescence intensity. Through the application of electrical stimuli and advanced imaging techniques, this process enables visual tracking of real-time changes in neuronal membrane potential based on VSD fluorescence.

Optical Recording of Neuronal Activity in Brain Slices Stained with a Voltage-Sensitive Dye

This video outlines a method for simultaneously imaging and recording electrical activity from transgenic brain slices that contain neuron-specific fluorescent proteins. The procedure involves maintaining the brain slice in a perfusion chamber with aerated artificial cerebrospinal fluid, using a light source to excite fluorescent-labeled cells, and recording the electrical signals with a multichannel probe and patch clamp.

Simultaneous Optical and Electrophysiological Monitoring of Neuronal Cells in Brain Slices

This video demonstrates the procedure for studying synaptic efficiency in the lateral entorhinal cortex (LEC) by optogenetically stimulating medial prefrontal cortex (mPFC) axons and recording the responses of pyramidal neurons in the LEC. This method combines patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study synaptic plasticity.

Optogenetic Stimulation and Electrophysiological Recording of Synaptic Events in Rat Brain Slices

In dit artikel beschrijven we een bruikbare methode om ligand-gated ionkanalen functie te bestuderen in neuronen van acuut geïsoleerd hersenen plakjes. Deze methode omvat het gebruik van een geneesmiddel gevulde micropipet voor lokale toepassing van geneesmiddelen voor neuronen opgenomen met standaard patch-clamp technieken.

Lokale toepassing van geneesmiddelen aan nicotine acetylcholine receptor functie in de hersenen van muizen Slices Studie

Hier wordt een procedure gepresenteerd om selectief een neuronaal eiwit te activeren met een korte lichtpuls door genetisch een foto-reactieve onnatuurlijke aminozuur te coderen in een doelneuronaal eiwit dat tot expressie wordt gebracht in neuronen in cultuur of in vivo.

Optische controle van een neuronaal proteïne met behulp van een genetisch gecodeerde Onnatuurlijke aminozuren in neuronen

Dit protocol beschrijft elementaire procedurele stappen voor het uitvoeren van whole-cell patch-clamp opnames. Deze techniek maakt het onderzoek mogelijk van het elektrisch gedrag van neuronen, en wanneer uitgevoerd in hersencoupes, kan worden nagegaan of verschillende neuronale functies van neuronen die nog geïntegreerd in goed behouden hersenen circuits.

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Presenteren we een methode geheel-cel patch-clamp opnamen en twee-foton imaging om vast te leggen van Ca2 + transiënten in neuronale dendrites in acute hersenen segmenten combineren.

Twee-foton Calcium Imaging in neuronale Dendrites in hersenen plakjes

Hier beschrijven we de essentiële stappen voor geheel-cel patch-clamp opnamen gemaakt van substantia gelatinosa (SG) neuronen in het ruggenmerg in vitro segment. Met deze methode kunt de eigenschappen van het intrinsieke membraan, synaptische transmissie en morfologische karakterisering van SG neuronen worden bestudeerd.

Voorbereiding van Acute ruggenmerg segmenten geheel-cel Patch-clamp opname in neuronen van de Substantia Gelatinosa

We introduceren een reproduceerbare en stabiele optische opnamemethode voor hersen schijfjes met spannings gevoelige kleurstof. Het artikel beschrijft spanning-gevoelige kleurstof beitsen en het opnemen van optische signalen met behulp van conventionele hippocampale slice preparaten.

Wide-veld single-foton optische opname in de hersenen schijfjes met behulp van spanning-gevoelige kleurstof

Leer voltage-gevoelige kleurstofbeeldvorming voor membraanpotentiaalmonitoring in individuele neuronen met sub-micrometer resolutie. Deze methode maakt optische registratie van elektrische signalen in axonen, dendrieten en dendritische spines mogelijk.

Voltage-gevoelige kleurstof Opnemen van axonen, dendrieten en dendritische spines van individuele neuronen in Brain Slices

Meer video's verkennen