Het verkennen van arteriële gladde spier KV7 Kalium Kanaal Functie met Patch Clamp Elektrofysiologie en druk myografie

Het algemene doel van deze procedure is om de activiteit van KV zeven kaliumkanalen te meten in vers gedissocieerde gladde spiercellen van de mesenteriale slagader, en dit te relateren aan de metingen van arteriële diameter die onder fysiologische omstandigheden zijn opgenomen. Dit wordt bereikt door eerst chirurgisch de mesenteriale vaarboog van een rat te verwijderen. De tweede stap is het dissekeren en schoonmaken van de segmenten van de mesenteriale slagaders.

Vervolgens worden sommige segmenten gebruikt om individuele gladde spiercellen te isoleren voor patch clamp elektrofysiologische metingen van KV zeven kaliumstromen. De laatste stap is het canuleren van intacte arteriële segmenten voor druk myo metingen van arteriële constricție of dilatatie als reactie op de farmacologische modulatoren van KV zeven kaliumkanalen. Uiteindelijk wordt de combinatie van patch clamp elektrofysiologie en druk myografie gebruikt om te laten zien hoe een toename of afname van de activiteit van KV zeven kaliumkanalen de mesenteriale arteriële constricție beïnvloedt.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden zoals het gebruik van gekloonde kanalen die worden uitgedrukt in cellijnen, is dat de stromen worden opgenomen van niet gekweekte cellen die de kanalen nativer expresseren en dat de KV stromen kunnen worden geïsoleerd van andere klassen kaliumkanalen die in dezelfde cellen kunnen worden geactiveerd. De druk myografie maakt het mogelijk om de functionele reacties op te nemen van hetzelfde weefsel waaruit de geïsoleerde cellen zijn afgeleid, en de methode is zowel gevoeliger als meer fysiologisch dan andere preparaten zoals arteriële ringen of arteriële stroken. Dr.Bareth Mani, een postdoctoraal onderzoeker uit mijn laboratorium, zal de arteriële canulerings- en druk myografietechnieken demonstreren en Dr.Luba Brueggeman, een onderzoeksassistent-professor in mijn laboratorium, zal de celisolatie en patch plan procedures demonstreren.

Om deze procedure te beginnen, gebruik een paar chirurgische schaar om een segment van 10 tot 12 centimeter te snijden aan beide uiteinden van de dunne darm van een rat. Isoleer vervolgens de darm samen met de aangehechte vaatbundel. Speld vervolgens het segment van de dunne darm vast.

Spreid het mesenterium over de nabijgelegen kant van de kamer zodat de primaire tak van de superieure mesenteriale slagader in het midden staat en de volgende takken in volgorde vanaf het midden uitstralen. Plaats vervolgens de spelden alleen op de intestinale segmenten die zichtbaar zijn door een verlicht dissectiemicroscoop. Verwijder voorzichtig het vetweefsel en het bindweefsel rond de tweede tot vierde orde slagaders dicht bij de darmen met behulp van microtangen en schaar.

Houd de aangrenzende aderen vast om het verwijderen van het vetweefsel en bindweefsel te vergemakkelijken en vermijd onnodig rekken van de slagaders. Breng nu twee tot drie segmenten van de mesenteriale slagader over in een 35 millimeter weefselkweekschaaltje met twee milliliters ijskoude isolatieoplossing. Plaats de schaal daarna op ijs, snijd de segmenten van de mesenteriale slagader in stukken van drie tot vier millimeter lang met behulp van een PEs-pipet met een gebrand tipje.

Breng de arteriële segmenten over in een glazen schepje met twee milliliters voorverwarmde isolatieoplossing van 37 graden Celsius. Incubeer het vervolgens gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius. Na 30 minuten zuigt u voorzichtig de isolatieoplossing van 37 graden Celsius op met een posterior pipet.

Voeg twee milliliters warme enzymoplossing toe en incubeer het gedurende 35 minuten bij 37 graden Celsius. Plaats het schepje onmiddellijk na de 35 minuten incubatie in de enzymoplossing op ijs, zuig de enzymoplossing op en voeg twee milliliters ijskoude isolatieoplossing toe. Herhaal deze procedure vier keer.

Breng vervolgens de arteriële segmenten in één milliliter ijskoude isolatieoplossing voorzichtig aan met de gepolijste posterior pipet. 10 tot 20 keer om individuele gladde spiercellen van de mesenteriale slagader los te maken. Controleer periodiek het uiterlijk van de myocyten door een druppel van de celsuspensie op een 35 millimeter schaaltje te plaatsen en ze onder de microscoop te bekijken.

Gezonde MA SMC's moeten een gladde langwerpige uitstraling hebben. Breng vervolgens ongeveer 100 tot 200 microliters celsuspensie over naar de opnamekamer met een gepolijste pastier pipet en laat de cellen 15 minuten hechten. Vul in deze stap de tip van de patch pipet met amfotericine B, vrije interne oplossing door de tip van de pipet erin te kantelen.

Breng vervolgens zuiging aan op de andere kant met behulp van een 10 milliliter spuit die is bevestigd via een stuk buis met terin B bevattende pipetoplossing vanaf de bovenkant. Gebruik een einor micro loader pipet tip totdat de pipet ongeveer half gevuld is met oplossing. Verwijder eventuele luchtbellen door zachtjes op de pipet te tikken.

Plaats de pipet vervolgens in de elektrodehouder. Gebruik een micro manipulator om de pipet naar het oppervlak van een langwerpige myocyt te laten zakken. Wanneer de weerstand van de pipet toeneemt tot zes tot 10 mega ohm, breng zuiging aan om een giga seal te bereiken.

Stel tegelijkertijd de houdspanning in op nul millivolt terwijl u wacht op membraanperforatie. Breng vervolgens 100 milliseconde voltagestappen aan naar plus 10 millivolt en vervolgens naar minus 10 millivolt. Gebruik de versterker om te compenseren voor de snelle pipet capaciteit transitie die gelijktijdig met het verschijnen van de gehele celcapaciteit optreedt.

Kleine, aanhoudende positieve stromen van twee tot 10 PICO amp, zuiver en amplitude duiden op de aanwezigheid van functionele KV zeven kanalen. De succesvolle perforatie met amfotericine B zal de toegangsweerstand verminderen tot 35 mega ohm of minder. Om de KV zeven stroomspanningsrelatie op te nemen, breng vijf seconden voltagestappen aan op spanningen variërend van minus 84 millivolt, waarbij de open kans van KV zeven kanalen minimaal is, tot plus 16 millivolt, waarbij de open kans van KV z