Het verkennen van arteriële gladde spier KV7 Kalium Kanaal Functie met Patch Clamp Elektrofysiologie en druk myografie

Het algemene doel van deze procedure is om de activiteit van KV7-kaliumkanalen in vers gedissocieerde gladde spiercellen van de mesenteriale arterie te meten, en dit te relateren aan de metingen van de arteriële diameter die onder fysiologische omstandigheden zijn vastgelegd. Dit wordt bereikt door eerst de mesenteriale vasculaire arcade chirurgisch te verwijderen uit een rat. De tweede stap is het dissekeren en reinigen van de segmenten van de mesenteriale arteriën.

Vervolgens worden sommige segmenten gebruikt om individuele gladde spiercellen te isoleren voor patchclamp-elektrofysiologische metingen van KV7-kaliumstromen. De laatste stap is de canulatie van intacte arteriële segmenten voor drukmyografie-metingen van arteriële constrictie of dilatatie als reactie op farmacologische modulatoren van KV7-kaliumkanalen. Uiteindelijk wordt de combinatie van patchclamp-elektrofysiologie en drukmyografie gebruikt om aan te tonen hoe een toename of afname van de activiteit van KV7-kaliumkanalen de constrictie van de mesenteriale arterie beïnvloedt.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden, zoals het gebruik van kloonkanalen tot expressie gebracht in cellijnen, is dat de stromingen worden geregistreerd van niet-gekweekte cellen die de kanalen van nature tot expressie brengen en dat de KV-stromingen kunnen worden geïsoleerd van andere klassen kaliumkanalen die in dezelfde cellen kunnen worden geactiveerd. De drukmyografie maakt het mogelijk om de functionele responsen te registreren van hetzelfde weefsel waarvan de geïsoleerde cellen afkomstig zijn, en de methode is zowel gevoeliger als fysiologischer dan andere preparaten zoals arteriële ringen of arteriële strips. Dr. Bareth Mani, een postdoctoral fellow uit mijn laboratorium, zal de arteriële canulatie- en drukmyografie-technieken demonstreren en Dr. Luba Brueggeman, een research assistant professor in mijn laboratorium, zal de procedures voor celisolatie en patch-clamp demonstreren.

Om deze procedure te starten, gebruikt u een chirurgische schaar om aan beide uiteinden van de dunne darm van een rat een segment van 10 tot 12 centimeter af te knippen. Isoleer vervolgens de darm samen met de bijbehorende vaatstructuren. Zet daarna het segment van de dunne darm vast met spelden.

Spreid het mesenterium over de nabijgelegen zijde van de kamer, zodanig dat de primaire tak van de arteria mesenterica superior in het centrum ligt en de daaropvolgende vertakkingen vanuit het centrum uitstralen. Plaats vervolgens de pinnen uitsluitend op de darmsegmenten, terwijl u door een verlicht dissectiemicroscoop kijkt. Verwijder zorgvuldig het vetweefsel en het bindweefsel rondom de arteriën van de tweede tot vierde orde nabij de darmen met behulp van microforceps en scharen.

Houd de aangrenzende venen vast om het verwijderen van het vet- en bindweefsel te vergemakkelijken en onnodige rek van de arteriën te voorkomen. Draag nu twee tot drie segmenten van de mesenteric artery over naar een weefselkweekschaal van 35 millimeter met twee milliliters ijskoude isolatie-oplossing. Plaats de schaal vervolgens op ijs en knip de segmenten van de mesenteric artery in stukjes van drie tot vier millimeter lang met een Pasteur-pipet met een vuurgepolijste tip.

Breng de arteriële segmenten over naar een glazen vial met twee milliliters voorverwarmde isolatieoplossing van 37 °C. Incubeer deze vervolgens 30 minuten bij 37 °C. Aspireer na 30 minuten voorzichtig de isolatieoplossing van 37 °C met een micropipet.

Voeg twee milliliters warme enzymoplossing toe en incubeer dit gedurende 35 minuten bij 37 graden Celsius. Plaats het buisje direct na de incubatie van 35 minuten in de enzymoplossing op ijs, aspireer de enzymoplossing en voeg twee milliliters ijskoude isolatieoplossing toe. Herhaal deze procedure vier keer.

Itereer vervolgens de arteriële segmenten voorzichtig 10 tot 20 keer met de gepolijste posterieure pipet in één milliliter ijskoude isolatie-oplossing om individuele gladde spiercellen van de mesenteriale arterie vrij te maken. Controleer periodiek het uiterlijk van de myocyten door een druppel van de celsuspensie op een schaal van 35 millimeter te plaatsen en deze onder de microscoop te bekijken.

Gezonde MA SMC's moeten een glad en langgerekt uiterlijk hebben. Breng vervolgens ongeveer 100 tot 200 µL cel-suspensie over naar de registratiekamer met een gepolijste pastierpipet en laat de cellen 15 minuten hechten. Vul in deze stap de tip van de patchpipet met amphotericin B-vrije interne oplossing door de pipetpunt erin te dopen.

Pas vervolgens zuiging toe aan het andere uiteinde met een syringe van 10 milliliter die via een stukje slang is verbonden; voeg info terin B met pipettersoplossing vanaf de bovenkant toe. Gebruik een einor micro loader pipetpunt totdat de pipet voor ongeveer de helft gevuld is met de oplossing. Verwijder eventuele luchtbellen door voorzichtig tegen de pipet te tikken.

Plaats daarna de pipet in de電rodehouder. Gebruik een micromanipulator om de pipet naar het oppervlak van een langgerekte myocyt te laten zakken. Wanneer de weerstand van de pipet toeneemt tot 6 tot 10 mega ohm, wordt er zuigkracht uitgeoefend om een giga seal te verkrijgen.

Stel tegelijkertijd de holdingspanning in op nul millivolt terwijl u wacht op de perforatie van het membraan. Pas vervolgens spanningsstappen van 100 milliseconden toe naar plus 10 millivolt en daarna naar minus 10 millivolt. Gebruik de versterker om de snelle overgang van de pipetcapaciteit te compenseren die gelijktijdig met het verschijnen van de whole-cell capaciteit optreedt.

Tijdelijke, kleine, aanhoudende positieve stromen van 2 tot 10 pA, puur en in amplitude, wijzen op de aanwezigheid van functionele KV7-kanalen. Een succesvolle perforatie met amphotericine B zal de toegangsweerstand verminderen tot 35 MΩ of minder. Om de stroom-spanningsrelatie van KV7 te registreren, worden spanningsstappen van vijf seconden toegepast, variërend van -84 mV, waarbij de openingskans van KV7-kanalen minimaal is, tot +16 mV, waarbij de openingskans van KV7-kanalen een plateau bereikt. Na vijf seconden bij elke testspanning wordt er gedurende 10 seconden teruggegaan naar de holding-spanning van -4 mV.

Hanteer bij deze procedure twee vooraf gemaakte fijne nylon hechtingen die aan elke zijde losjes zijn opgehangen. Verplaats het gedissecteerde segment van de mesenterische arterie voorzichtig van de dissectiekamer naar de drukmyograftkamer door één uiteinde van het segment vast te houden met een micro-pincet naast de glazen canule. Houd vervolgens, onder zicht van een verlicht dissectiemicroscoop, één uiteinde van het arteriesegment vast en schuif dit voorzichtig over de linker glazen canule.

Zet het uiteinde vast met de nylon hechtingen. Spoel vervolgens voorzichtig vloeistof door het lumen van het gemonteerde vat om bloed en debris te verwijderen. De klep naar de linker spuit moet vervolgens worden gesloten, zodat deze zijde een statische vloeistofkolom vormt waartegen de druk vanaf de rechterzijde wordt geregeld; positioneer met de micromanipulator de beweegbare rechter glazen canule dichter bij het arteriesegment en trek het rechter uiteinde van het segment eroverheen.

Zet tot slot het arteriesegment vast met nylon hechtingen en knip de overtollige hechtdraden af. Monteer nu de drukgrafiekeenheid op de tafel boven de drukmicrofoogmicroscoop. Verbind de drukkolom met de rechterkant van de grafiekkamer en plaats vervolgens de afdekking over de kamer.

Verhoog de 10 milliliter spuit geleidelijk over een periode van 15 minuten en controleer het vat op lekken totdat de P one druktransducer 80 millimeters mercury aangeeft; pas indien nodig de afstand tussen de canules aan. De afstand moet zodanig worden aangepast dat het onder druk gezette arteriesegment ongeveer recht is en een schouderachtig patroon vormt op de plaatsen waar de bindingen zijn aangebracht. Controleer de levensvatbaarheid van het gemonteerde vat door een kortstondige superfusie met 60 millimolar kaliumchloride gedurende 30 seconden. Een levensvatbaar vat vernauwt snel bij toevoeging van kaliumchloride en verwijdt onmiddellijk na het uitspoelen ervan.

Voeg vervolgens de geconcentreerde testsubstantie toe aan de badoplossing door deze direct met een pipet voorzichtig heen en weer te pipetteren nabij het uiteinde van de kamer om de testsubstantie in de badoplossing te mengen, waardoor de juiste uiteindelijke concentratie in de kamer van 10 milliliter wordt bereikt. Volumeveranderingen in de diameter van het vat na toevoeging van de testsubstantie kunnen in het live-videobeeld worden gevolgd en tevens worden uitgezet in het venster voor beeldanalyse terwijl het experiment gaande is. Deze figuur toont een reeks opeenvolgende stroomregistraties opgenomen als reactie op spanningsstappen vóór de behandeling, weergegeven in het zwart, en na stabilisatie in aanwezigheid van 100 nanomolaire zinkperion in een enkele myocyten van een mesenteric artery, weergegeven in het rood; hier zijn de representatieve stromen voor de controle en voor 100 nanomolaire zinkperion.

De grijze balken geven het tijdsinterval aan waarin de gemiddelde stroomamplitudes zijn gemeten. Voor de stroom-spanningsdiagrammen worden de stapspanningen rechts aangegeven met pijlpuntjes. Dit is het verloop van de KV7-stroomversterking door 100 nanomolaire zinkionen, gemeten met een continue voltage-clamp bij minus 20 millivolt. Hier worden de gemiddelde stroom-spanningscurven getoond die zijn afgeleid van KV7-stroomdichtheden geregistreerd vóór, tijdens behandeling met 100 nanomolaire zinkionen, en tijdens behandeling met 10 micromolaire van de KV7-kanaalblokker XC 9 9 1; zinkionen-geïnduceerde relaxatie van de mesenteriale arterie vooraf geconstringeerd met 100 picomolaire argininevasopressine.

Deze figuur laat het verloop in de tijd zien van veranderingen in de buitendiameter van het vat als reactie op de toediening van 100 picomolar arginine vasopressine, gevolgd door de toediening van 100 nanomolar zinkionen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u arteriën voorbereidt voor de isolatie van enkelvoudige cellen of voor drukmyografische meting van arteriële constrictie en dilatatie-responsen. Daarnaast zou u moeten weten hoe u KV7-stromen registreert, geïsoleerd van andere stromen, in vers geïsoleerde arteriële myocyten.