Name: Iteratieve optimalisatie van DNA-duplexen voor kristallisatie van SeqA-DNA complexen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Leer de iteratieve optimalisatie van DNA-duplexen voor kristallisatie van SeqA-DNA complexen. Deze methode helpt onderzoekers hoogwaardige diffractiekristallen te verkrijgen voor structurele biologie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen de PXRR medewerkers bedanken bij de NSLS (Brookhaven National Laboratory) voor hulp tijdens het verzamelen van gegevens en Monica Pillon voor hulp bij DNA-zuivering. Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research (MOP 67189).

1. Protein Purification De flexibele linker die de N-(oligomerisatie) en C-terminal (DNA binding) domeinen van SeqA steun erkenning van hemimethylated GATC herhalingen gescheiden door een tot drie slagen op het DNA. Voor deze studie hebben we een dimere variant van SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) met een puntmutatie in het N-terminale domein dat verdere oligomerisatie en verkorte linker die DNA binden tandem GATC herhaalt uitsluitend gescheiden beperkt voorkomt een slag op het DNA (Figuur 1) 2,8. <ol><li> Transformeren BL21 (DE3) cellen met het plasmide dat codeert SeqA onder de controle van T7 promoter, </li><li> Plaat de transformatie reactie in LB-agarplaten met 100 ug / ml ampicilline, </li><li> Extra gemengde kolonies een kleinschalige overnacht inoculeren (LB medium met 100 ug / ml ampicilline) </li><li> De volgende ochtend inoculeren een 1 L van media met een 1:100 verdunning van het overniGHT cultuur, </li><li> Groeien de cellen aan een OD 600 van ~ 0,7 en eiwitproductie door toevoeging van isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) tot een uiteindelijke concentratie van 1 mM induceren, </li><li> Verdere incubatie gedurende 3 uur bij 37 ° C met schudden orbitale en oogst de cellen door centrifugeren (10 minuten bij 3300 g), </li><li> Resuspendeer de celpellet in buffer A en zuivering lyseren door sonicatie, </li><li> Verwijder het lysaat door centrifugatie (40 min bij 39.000 g) en de supernatant op een heparine geëquilibreerd met buffer zuivering laden </li><li> Elueren SeqA met een lineaire gradiënt van 1 M NaCl (SeqA elueert bij ~ 0,7 M NaCl), </li><li> Pool de SeqA bevattende fracties samen verdunnen tot de ionsterkte van het monster en belasting te verlagen tot een kationenwisselingschromatografie geëquilibreerd met buffer zuivering, </li><li> Met een lineaire zoutgradiënt, pure SeqA elueert bij -0,4 M NaCl, </li><li> Pool de SeqA bevattende fracties samen CONCENTRATe (3 mg / ml) en opslag in opslagbuffer. </li></ol> 2. DNA Purification <ol><li> Bestel complementaire niet-gemethyleerd en gemethyleerde oligonucleotiden van uw favoriete bedrijf, </li><li> Los 1 mol van elk gevriesdroogde enkelstrengs DNA in 800 ul van geautoclaveerd ddH 2 O, vortex en laat het zitten voor 10-20 min., </li><li> Voeg 800 ul voorverwarmde 2X laadbuffer elke oligonucleotide, </li><li> 20-30 nucleotiden lange oligonucleotiden, om een ​​grote 10% denaturerende gel (160 x 250 x 1 mm): * Meng 80 ml van 10% PAGE mix, 80 ul TEMED en 800 ul ammoniumpersulfaat per gel en giet, * Eenmaal gepolymeriseerd, verwijder dan de kam en spoel de putten met ddH 2 O grondig, * Monteer de gels op gel cast waaronder koelplaat en de bovenste en onderste reservoirs met loopbuffer (1X TBE) vullen, * De gel Pre-run op 700 tot 750 V om de gel op te warmen tot 55 ° C, * Stop de run en spoel de putten THOROughly met loopbuffer. </li><li> Verwarm de oligonucleotiden aan 90 ° C gedurende 2 min, </li><li> Vortex en draai de monsters en onmiddellijk vóór het laden van de gel, </li><li> Voer de gel op ~ 700 V en stoppen zodra uw oligonucleotide is halverwege gemigreerd. (Op een 10% polyacrylamide gel broomfenolblauw co-migreert met oligonucleotiden ~ 20 basen lang en xyleencyanol FF met ~ 60 basen lang) </li><li> Stop de gel, demonteer hem uit de gel doos en verwijder de afstandhouders, </li><li> Op een vlakke ondergrond, verwijder dan een glazen plaat en dekking van de gel met plastic omslag, </li><li> Draai de gel rond, verwijder dan de andere glasplaat en dek deze af met plastic omslag, </li><li> Markeer de banden met behulp van UV-licht en een fluorescerende plaat achter de gel aan het DNA schaduw te zien, </li><li> Snijd de band met een scheermesje in kleine stukjes en ze in een steriele 15 ml buis te brengen, </li><li> Voeg 9 ml elutiebuffer en overnacht bij 37 ° C onder roeren elueren, </li><li> Voorzichtig breng de oplossingeen geautoclaveerde centrifugebuis met een gel-lading pipetpunt de overdracht acrylamide stukken voorkomen en 1 ml van 3 M natriumacetaat bij pH 7 (1:10 verdunning) plus 25 ml gekoelde 100% ethanol (2,5 volumes) toevoegen </li><li> Incubeer bij -20 ° C gedurende ten minste 3 uur, </li><li> Draaien en overdracht het supernatant naar een afzonderlijke buis, </li><li> Droog de pellet op de speed-vac op middelhoog vuur, </li><li> Resuspendeer de pellet in 400 pl geautoclaveerd ddH 2 O en naar een nieuwe buis, </li><li> Voeg 40 pl 3 M natriumacetaat bij pH 7 en 1 ml 100% ethanol, goed mengen (vortex) en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door 30 min bij -20 ° C, </li><li> Draai gedurende 15 min bij 18.000 g en het supernatans, </li><li> Spoel de pellet met 100 pl 70% ethanol aan koude resterende zout uit de pellet en spin gedurende 6 min bij 18.000 g. Gooi de ethanol en droog de pellet op speed-vac, </li><li> Resuspendeer de pellet in een totaal van 100 pi van geautoclaveerd ddH <sub&gt; 2 O. Concentratie van het oligonucleotide </li><li> De hemimethylated DNA duplexen gloeien, meng equimolaire concentraties van de complementaire enkele strengen en verwarm het mengsel tot 95 ° C in een waterbad gedurende 5 minuten en laat ze langzaam afkoelen tot kamertemperatuur in het waterbad. </li></ol> 3. Eiwit-DNA Complex Formation and Analysis <ol><li> Meng gelijke volumes van gezuiverd SeqAΔ (41 tot 59)-A25 (81 uM) en hemimethylated DNA (81 uM), </li><li> Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten en bewaar bij 4 ° C totdat u klaar bent om het te gebruiken, </li><li> Scherm voor kristallisatie omstandigheden met behulp van commerciële sparse-matrix schermen, </li><li> Zodra de eerste kristallisatie leads geïdentificeerd, optimaliseren van de omstandigheden diffractie kwaliteit kristallen groeien </li><li> Cryoprotect het resulterende DNA-SeqA kristallen door ofwel de hoeveelheid van PEG 400 in de kristallisatie oplossing tot een eindconcentratie van 25% (v / v) of het toevoegen van 20% glycerol (v / v) om de kristallisatie oplossing </li><li> Schep individuele kristallen met een nylon lus en deze flash-bevriezen in vloeibare stikstof, </li><li> Test de diffractielimiet van elk kristal bij 100 K. </li></ol> 4. Representatieve resultaten De kristalstructuur van SeqAΔ (41-59)-A25R gebonden aan hemimethylated DNA bekomen, achtereenvolgens drie parameters geoptimaliseerd op DNA: (i) scheiding tussen hemimethylated GATC sequenties, (ii) lengte van de duplex, en (iii) de afwezigheid / aanwezigheid van 5 &#39;overhangen. Electro-mobility shift assays blijkt dat SeqAΔ (41-59)-A25R voorkeur GATC repeats gescheiden door 9-10 baseparen (figuur 1) bindt. Daarom hebben we in eerste instantie gescreend duplexen 23 tot 24 basenparen (bp) lang met twee hemimethylated GATC sequenties gescheiden door 9 of 10 bps. Drie duplexen leverde mooi gevormde kristallen (figuur 2). Alhoewel geen van de kristallen afgebogen naar een hoge resolutie, de 23 bps lange duplex met de twee GATC plaatsen gescheiden door 9 bps afgebogen X-stralen beter dan de rest, wat aangeeft dat een GATC scheiding van 9 bps is de voorkeur voor kristallisatie. Daarom hebben we vast de inter-GATC afstand tot 9 bps voor alle volgende schermen. In het algemeen wordt DNA kristallisatie voorkeur voor duplex lengtes exact overeenkomt met schroefvormige windingen omdat meerdere DNA-moleculen kunnen kop-staart stapel een continue B-DNA te vormen binnen het kristal 9. Daarom verkort we de totale lengte van de duplexen tot 21 bps (twee spiraalvormige windingen). Terwijl een 21 bps duplex met stompe uiteinden leverde geen diffractie kwaliteit kristallen (gegevens niet getoond), een 21 bps duplex met een 5 &#39;overhang nucleotide aan elk uiteinde heeft verkregen kristallen die afgebogen tot 5 A in huis bron. De verbetering van de diffractielimiet voorgesteld end-to-end duplex vereniging inderdaad bevorderening kristal verpakking. Aangezien SeqA interageert met GATC sequenties die op dezelfde zijde van het DNA moeten de andere zijde van de DNA duplex wordt blootgesteld aan het oplosmiddel. Verdere verbetering van de kristallen van het complex vervolgens gemodificeerd we de sequentie van de duplex een dinucleotide CG tussen de twee sites GATC groef-backbone via interacties met aangrenzende DNA-moleculen in het kristal door de andere zijde van de duplex, een methode omvatten dat is gebruikt om DNA kristallisatie bevorderen in het verleden 10. De diffractielimiet van de kristallen van de CG-bevattende duplex was identiek aan die geteeld met een soortgelijke DNA duplex die niet dinucleotide CG bevatten (Figuur 3). Dit resultaat gaf aan dat groefvormige backbone interacties belangrijk waren in dit geval. We vervolgens geoptimaliseerd de lengte van de overhangen door vergelijking van de kristallen van een DNA duplex die twee extra nucleotiden hadden elk5 &#39;uiteinde. Deze wijziging heeft een drastische invloed op kristalmorfologie, alsmede, diffractielimiet aangeeft dat de aanvullende nucleotide drastisch de moleculaire contacten en verbeterde kristal organisatie (figuur 3) veranderd. De kristalstructuur van SeqAΔ (41 tot 59)-A25R gebonden aan deze laatste DNA-duplex bevestigd dat de vrije gezicht van de DNA-duplex niet bezighouden met kristal contacten, zoals verwacht van het beperkte effect van de invoering van een CG-dinucleotide. Ondanks de relatieve grootte van eiwitten en DNA zijn de meeste interacties tussen symmetrie mates gemedieerd door eiwit-eiwit en eiwit-DNA-interacties (figuur 4). Interessant is dat in dit geval het gunstige effect van dinucleotide een 5 &#39;overhang is door de vorming van een pseudo-continue DNA. In plaats daarvan het 5&#39;-uiteinde van het gemethyleerde streng projecten weg van de DNA assen en interageert met het proximale SeqA molecule van het complex, verklaart waarom twee nucleotiden w<html> ere strikt nodig is om het kristal verpakken 8,11 te wijzigen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig1.jpg" /> Figuur 1. Binding van SeqAΔ (41-59) aan-A25R hemimethylated DNA. (A) Schematische weergave van de domeinen van SeqA die bemiddelen eiwit oligomerisatie en DNA binding. (B) elektroforetische mobiliteit shift assay van SeqAΔ (41-59)-A25R met DNAs die twee hemimethylated GATC sequenties gescheiden door een toenemend aantal baseparen ( X). De meest linkse baan (gelabeld Blank) bevat een equimolair mengsel van DNA met 5, 7, 12, 21, 25 en 34 basenparen tussen de twee GATC sequenties in afwezigheid van SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) diagram dat de drie variabelen geoptimaliseerd op DNA duplexen diffractie kwaliteit kristallen te verkrijgen. upload/4266/4266fig2.jpg &quot;fo: inhoud-width =&quot; 6in &quot;fo: src =&quot; / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg &quot;/&gt; Figuur 2. Effect van het variëren van de inter-GATC afstand. Samenvatting van de gebruikte oligonucleotiden en kristallen verkregen met drieëntwintig-vierentwintig bp lange duplexen met twee hemimethylated GATC plaatsen gescheiden door 9 of 10 basenparen. Alle foto&#39;s van kristallen werden genomen bij dezelfde vergroting en de schaal balk geeft 100 pm. De resolutie limiet van elk SeqAΔ (41 tot 59)-A25R-DNA kristal is gebaseerd op diffractie beelden verzameld op een Rigaku RU-300 X-ray generator systeem. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3.jpg" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/4266/4266fig3highres.jpg" /> Figuur 3. Effect van het variëren van de DNA-uiteinden. Samenvatting van thij oligonucleotiden gebruikt en kristallen verkregen met 21 bps lange duplexen die twee hemimethylated GATC plaatsen gescheiden door 9 basenparen en met 0, 1 of 2 nucleotide 5 &#39;uiteinde overhangen. Alle foto&#39;s van kristallen werden genomen bij dezelfde vergroting en de schaal balk geeft 100 pm. De resolutie limiet van elk SeqAΔ (41 tot 59)-A25R-DNA kristal is gebaseerd op diffractie beelden verzameld op bundellijnen X12C en X29 (NSLS, BNL). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4266/4266fig4.jpg" /> Figuur 4. Kristalpakking van SeqAΔ (41-59)-A25R gebonden aan DNA met dinucleotide overhang: Vanuit de (A) boven en zijde (B). De asymmetrische eenheid bevat twee SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA complexen waar het eiwit wordt getoond in grijs, terwijl het DNA oranje weergegeven. Symmery gerelateerde SeqAΔ (41 tot 59)-A25R-DNA-moleculen worden getoond in het wit voor het eiwit en geel voor het DNA. Dit cijfer werd bereid met behulp PyMOL 12. Dit cijfer heeft betrekking op Film 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . Film 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4266/4266movie1.avi" target="_blank">Klik hier om naar de film te bekijken</a> .

<ol><li>Campbell, J. L., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E.+coli+oriC+and+the+dnaA+gene+promoter+are+sequestered+from+dam+methyltransferase+following+the+passage+of+the+chromosomal+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork.</a> Cell. 62, 967-979 (1990).</li>
<li>Guarné, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+SeqA-N+filament%3A+implications+for+DNA+replication+and+chromosome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization.</a> Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).</li>
<li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).</li>
<li>Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+variation+in+DNA+length+yields+highly+ordered+repressor-operator+cocrystals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals.</a> Science. 230, 1383-1385 (1985).</li>
<li>Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+of+the+yeast+MATalpha2%2FMCM1%2FDNA+ternary+complex%3A+general+methods+and+principles+for+protein%2FDNA+cocrystallization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization.</a> J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).</li>
<li>Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+an+IHF-DNA+complex%3A+a+protein-induced+DNA+U-turn%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn.</a> Cell. 87, 1295-1306 (1996).</li>
<li>Yang, W., Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+site-specific+recombinase+gamma+delta+resolvase+complexed+with+a+34+bp+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site.</a> Cell. 82, 193-207 (1995).</li>
<li>Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+cooperative+binding+of+SeqA+to+a+tandem+GATC+repeat%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat.</a> Nucleic Acids Res. , (2009).</li>
<li>Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocrystals+of+the+DNA-binding+domain+of+phage+434+repressor+and+a+synthetic+phage+434+operator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).</li>
<li>Timsit, Y., Moras, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+self-fitting%3A+the+double+helix+directs+the+geometry+of+its+supramolecular+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly.</a> Embo J. 13, 2737-2746 (1994).</li>
<li>Chung, Y. S., Guarne, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystallization+and+preliminary+X-ray+diffraction+analysis+of+SeqA+bound+to+a+pair+of+hemimethylated+GATC+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+Sect+F+Struct+Biol+Cryst+Commun%22%5BJournal%5D)">Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).</li>
<li>DeLano, W. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDeLano%2C+WL+%22The+PyMOL+Molecular+Graphic+Systems%22">The PyMOL Molecular Graphic Systems</a>. , DeLano Scientific. (2002).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Een van de grootste uitdagingen in macromoleculaire X-ray kristallografie is het verkrijgen van diffractie kwaliteit kristallen. Bij eiwit of eiwit-DNA-complexen, is deze uitdaging door de extra variabelen die moeten worden geoptimaliseerd verergerd. Het wordt algemeen aangenomen dat de lengte van de DNA en de aanwezigheid van kleverige overhangen aan associatie van aangrenzende DNA-moleculen te verbeteren in een langere pseudo-duplex worden de belangrijkste parameters te optimaliseren. We hebben echter aangetoond dat d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus # </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> TRIS </td><td> Bioshop </td><td> TRS003.5 </td><td></td></tr><tr><td> Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) </td><td> Fisher Scientific </td><td> E478-500 </td><td></td></tr><tr><td> Dithiotheitrol (DTT) </td><td> Bio Basic Inc </td><td> DB0058 </td><td></td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Bioshop </td><td> SOD002.10 </td><td></td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Caledon </td><td> 5,350-1 </td><td></td></tr><tr><td> Sucrose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5016-500G </td><td></td></tr><tr><td> Natriumdodecylsulfaat (SDS) </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td> Ureum </td><td> Bioshop </td><td> URE001.5 </td><td></td></tr><tr><td> 40% Bis 29:1 / acrylamide </td><td> Bio Basic Inc </td><td> A0007-500ml </td><td> Bewaar bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Boorzuur </td><td> EMD </td><td> BX0865-1 </td><td></td></tr><tr><td> Xyleencyanol FF </td><td> Bio-Rad </td><td> 161-0423 </td><td></td></tr><tr><td> Broomfenolblauw </td><td> Bioshop </td><td> BR0222 </td><td></td></tr><tr><td> Dual Adjustable Verticale Gel System </td><td> CBC Scientific Company Inc </td><td> DASG-250 </td><td></td></tr><tr><td> Index kristallisatie scherm </td><td> Hampton Onderzoek </td><td> HR2-144 </td><td> Bewaar bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Wizard I kristallisatie scherm </td><td> Emerald BioSystems </td><td> EBS-WIZ-1 </td><td> Bewaar bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Wizard II kristallisatie scherm </td><td&gt; Emerald BioSystems </td><td> EBS-WIZ-2 </td><td> Bewaar bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Classics kristallisatie scherm </td><td> Qiagen </td><td> 130701 </td><td> Bewaar bij 4 ° C </td></tr><tr><td> Intelliplate trays </td><td> Art Robbins Instruments </td><td> 102-0001-00 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Oplossingen Eiwitzuivering buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT en 5% glycerol. Protein opslagbuffer: 20 mM Tris pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0,5 mM EDTA en 5% glycerol. Gel loading mix: Voeg 20 g sucrose, 25 mg broomfenol blauw, 25 mg xyleencyanol FF, 1 ml van 10% w / v SDS en 10 ml 10X TBE 70 ml geautoclaveerd ddH 2 O. Roer met een lichte verwarming tot sucrose is opgelost en pas de laatstevolume van 100 ml met geautoclaveerd ddH 2 O. Bewaar bij 4 ° C. 2X laadbuffer: Voeg 11 g ureum aan 10 ml gel loading mix. Roer op een hete plaat tot ureum is opgelost. Aliquot in 2 ml buizen en bewaar bij 4 ° C. 10X mix PAGE: Mix 420,4 g ureum, 100 ml 10X TBE (geautoclaveerd), 250 ml 40% Bis 29:1 / acrylamide in ddH 2 O. Roer totdat er opgelost en zet het volume op 1 liter. Bewaar in donkere flessen bij 4 ° C. 10X TBE: Los 108 g Tris, 55 g boorzuur 9,3 g EDTA in 1 liter ddH 2 O. Autoclaaf en bewaar bij kamertemperatuur. Elutiebuffer: Verdun 8 ml van 5 M NaCl, 2 ml 1 M TRIS pH 7,5, 0,4 ml 0,5 M EDTA pH 8 over 200 ml ddH 2 O. Autoclaaf en bewaar bij kamertemperatuur. </td></tr></tbody></table&gt;

iteratieve optimalisatie van dna-duplexen voor kristallisatie van seqa-dna complexen

Iterative Optimization of DNA Duplexes for Crystallization of SeqA-DNA Complexes

Escherichia coli SeqA is een negatieve regulator van DNA replicatie die premature her-initiatie gebeurtenissen sequestering hemimethylated GATC clusters voorkomt in de oorsprong van replicatie 1. Voorbij de oorsprong, wordt SeqA vinden op de replicatie vorken, waar het onlangs gerepliceerd DNA organiseert in hogere geordende structuren 2. SeqA associeert slechts zwak met enkele GATC sequenties, maar het vormt een hoge affiniteit complexen met DNA duplexen met meerdere GATC sites. De minimale functionele en structurele eenheid SeqA een dimeer, daardoor verklarend de eis van ten minste twee sequenties GATC een hoge affiniteit complex met DNA hemimethylated 3. Bovendien, de SeqA architectuur met de oligomerisatie en DNA-bindende domeinen gescheiden door een flexibele linker, kan binden aan GATC herhalingen gescheiden door maximaal drie spiraalvormige bochten. Daarom begrijpen van de functie van SeqA op moleculair niveau heeft de structurele analysis van SeqA gebonden aan meerdere GATC sequenties. In eiwit-DNA kristallisatie kan DNA hebben een uitzonderlijke Geen effect op de verpakking interacties afhankelijk van de relatieve afmetingen en structuur van het eiwit en DNA. Als het eiwit is hoger dan de DNA of voetafdrukken meeste DNA, wordt de kristalpakking hoofdzakelijk gemedieerd door eiwit-eiwit interacties. Omgekeerd, wanneer het eiwit even groot of kleiner dan de DNA of slechts betrekking op een fractie van de DNA, DNA-DNA en DNA-eiwit interacties domineren kristalpakking. Daarom kristallisatie van eiwit-DNA-complexen vereist een systematische screening van DNA lengte 4 en DNA-uiteinden (stomp of overhang) 5-7. In dit rapport beschrijven we hoe te ontwerpen, te optimaliseren, te zuiveren en kristalliseren hemimethylated DNA duplexen met tandem GATC herhalingen in complex met een dimeer variant van SeqA (SeqAΔ (41 tot 59)-A25R) om kristallen geschikt voor structuurbepaling te verkrijgen.

Kristalstructuur van eiwit-DNA-complexen kan inzicht verschaffen in eiwitfunctie, mechanisme, evenals de aard van de specifieke interactie. Hier rapporteren we hoe de lengte en sequentie uiteinden van duplex DNA optimaliseren voor co-kristallisatie met<em&gt; Escherichia coli</em&gt; SeqA, een negatieve regulator van replicatie-initiatie.

Iteratieve optimalisatie van DNA-duplexen voor kristallisatie van SeqA-DNA complexen

Escherichia coli SeqA is een negatieve regulator van DNA-replicatie die premature re-initiatiegebeurtenissen voorkomt door hemigemethyleerde GATC-clusters weg te vangen ...

Dit experiment beschrijft in detail hoe diffractiekwaliteitskristallen kunnen worden verkregen van een eiwit gebonden aan DNA dat een tandem hemi-gemethyleerde GATC bevat. Herhalingen worden gebruikt om de kristalpakking van het eiwit-DNA-complex te bevorderen. Begin met het rationele ontwerp van de DNA-lengte, de GATC-afstand en de DNA-uiteinden, ga verder met de complementaire enkelstrengse oligonucleotiden om het DNA te zuiveren en vervolgens te annealen om de hemi-gemethyleerde DNA-duplex te vormen, en meng daarna de gezuiverde seq A erbij om het complex te vormen.Bepaal vervolgens de optimale omstandigheden voor het kweken van diffractiekwaliteitskristallen van het eiwit-DNA-complex met crystallisatiedisplays met behulp van commerciële sparse matrix screens. Gedemonstreerde resultaten. Deel het effect van variërende DNA-lengte, GATC-afstand en uiteinden op de diffractiekwaliteit van de CQ A DNA-kristallen.Het doel van dit werk is om kristallen van CK gebonden aan DNA van diffractiekwaliteit te verkrijgen, maar het kan ook helpen om de algemene variabelen te begrijpen die in overweging moeten worden gebracht bij het ontwerpen van DNA-duplexen voor de kristallisatie van andere eiwit-DNA-complexen; de demonstratie van deze procedure zal worden gebruikt in Chang, A, een promovendus uit mijn laboratorium. Deze studie maakt gebruik van een variant van de DNA-replicatieregulatie-eiwitten. Zoek een variant die stabiele dimeren vormt en een verkorte linkerregio heeft tussen zijn oligomerisatie- en DNA-bindingsdomeinen.Deze variant beperkt de DNA-binding tot tandem GATC-herhalingen die uitsluitend door één winding op het DNA gescheiden zijn. Transformeer eerst BBL 20 1D drie cellen met het plasmide dat DEMETRIC seq A codeert onder controle van de T7-promotor. Plaats de transformatiereactie op LB-agarplaten die 100 µg/mL ampicilline bevatten en zet deze overnacht in de bacteriële incubator. Selecteer gemengde koloniën en start een overnight-cultuur op kleine schaal.Inoculeer de volgende ochtend één liter cultuur met 10 milliliters van het overnacht gekweekte inoculum. Wanneer de cultuur zich in de log-fase bevindt, voegt u twee milliliters 0,5 molar IPTG toe om de eiwitproductie te induceren. Zet de incubatie drie uur voort in een orbitale schudkerf bij 37 °C.Oogst vervolgens de cellen door centrifugatie bij 3.300 G gedurende 10 minuten. Resuspendeer de celpellet in zuiveringsbuffer, lysis door sonicatie en klaarte het lysaat door centrifugatie bij 39.000 ×g gedurende 40 minuten. Laad nu de supernatant op een met zuiveringsbuffer geëquilibreerde heparinekolom.Om het CK-eiwit te elueren. Gebruik een lineaire gradiënt naar één molair natriumchloride; het CK-eiwit elueert bij ongeveer 0,7 molair natriumchloride. Verzamel de CK-bevattende fracties en verdun deze om de ionsterkte van het monster te verlagen.Laad vervolgens het monster in een kationenuitwisselingschromatografiekolom die is geëquilibreerd met purificatiebuffer. Pas een lineaire zoutgradiënt toe om puur CK-eiwit te elueren bij ongeveer 0,4 molar natriumchloride. Combineer de CK-bevattende fracties.Concentreer tot drie milligram per milliliter en bewaar in de opslag. Bufferontwerp van complementaire ongemethyleerde en gemethyleerde oligonucleotiden. Bereid monsters voor van één micromol van elk gelyofiliseerd enkelstrengs DNA in 800 microliters geautoclaveerd, dubbel gedestilleerd water, vortex en laat 15 minuten staan, en 800 microliters.Voeg voor oligonucleotiden met een lengte van 20 tot 30 nucleotiden twee keer voorverwarmde laadbuffer toe aan elk monster en bereid een grote denaturerende gel van 10% voor. Verwijder na polymerisatie de kam en spoel de wells grondig uit. Assembleer de gel door de bovenste en onderste reservoirs te vullen met één keer TBE-runbuffer.Voer een voorloop uit op de gel bij 750 volt om de gel op te warmen tot 55 °C. Stop vervolgens de run en spoel de wells grondig uit met run-buffer. Verhit nu de oligonucleotiden gedurende twee minuten tot 90 °C.Vortexen en centrifugeren. De monsters worden direct gebruikt voor het laden van de gel. Laat de gel lopen op ongeveer 700 volt totdat het oligonucleotide is gemigreerd.Halverwege een 10% polyacrylamidegel co-migreert alph phenol blue met oligonucleotiden van ongeveer 20 basen lang en xylene syl ff met oligonucleotiden van ongeveer 60 basen lang. Demonteer de gel uit het apparaat en verwijder de afstandhouders op een vlak oppervlak. Verwijder één glasplaat en dek de gel af met vershoudfolie.Draai vervolgens de gel om, verwijder de andere glasplaat en dek de gel af met vershoudfolie. Markeer daarna de banden met UV-licht en een fluorescerende plaat achter de gel. Om de DNA-schaduw met een scheermesje te kunnen zien, snijdt u de band uit en verdeelt u deze in kleine stukjes.Breng elk monster over in een steriele buis van 15 milliliter. Voeg negen milliliter elutiebuffer toe en verdun dit gedurende de nacht bij 37 °C onder agitatie. Breng de oplossing voorzichtig over naar een autoclaafcentrifugebuis met behulp van een gel-laadpipetpunt.Om te voorkomen dat er acrylamidefragmenten worden overgedragen, voegt u 1 mL 3 mM natriumacetaat bij pH 7 toe, plus 25 mL gekoelde 100% ethanol, en incubeert u dit gedurende ten minste drie uur bij -20 °C. Centrifugeer het neersla de DNA. Droog vervolgens de pellets in de speed vac bij medium hitte, resuspendeer elke pellet in 400 µL geautoclaveerd, dubbel gedestilleerd water en breng deze over naar een nieuwe buis.Voeg 40 µL natriumacetaat 3 M bij pH 7 en 1 mL 100% ethanol toe, vortex en incubeer 30 minuten bij -20 °C. Centrifugeer vervolgens 15 minuten bij 18.000 ×g. Spoel de DNA-pellets met 100 µL koude 70% ethanol om eventuele resterende zouten te verwijderen en centrifugeer zes minuten bij 18.000 ×g. Verwijder daarna de ethanol en droog de pellet in een SpeedVac.Resuspende nu elk pellet in 100 µL autoclaaf-dubbel gedestilleerd water. Bepaal de concentratie van de oligonucleotiden via spectrometrie. Om de hemi-gemethyleerde DNA-duplexen te bereiden, mengt u eerst gelijke molaire concentraties van de complementaire enkelstrengse fragmenten.Verwarm de mengsels vervolgens vijf minuten lang in een waterbad tot 95 °C om de strengen te denatureren. Laat de monsters langzaam afkoelen tot kamertemperatuur in het waterbad. Combineer gelijke volumes van 81 µM gezuiverd CQ a-eiwit en 81 µM hemigemetyleerd DNA.Incubeer vervolgens 15 minuten bij kamertemperatuur. Bewaar bij vier graden Celsius tot gebruik; screen voor kristallisatiecondities met behulp van commerciële sparse matrix screens. Zodra de initiële kristallisatie-leads zijn geïdentificeerd, kunnen de condities worden geoptimaliseerd om kristallen van diffractiekwaliteit te laten groeien. Cryoprotegeer de resulterende CK DNA-kristallen.Verhoog ofwel de hoeveelheid PEG 400 in de crystallisatieloplossing tot een eindconcentratie van 25% of voeg 20% glycerol toe aan de crystallisatieloplossing. Schep individuele kristallen op met een nylon loop flash. Bevries de monsters in vloeibare stikstof.Test nu de diffractielimiet van elk kristal bij 100 k. Om de kristalstructuur te verkrijgen van de verkorte mutant van CK gebonden aan hemi-gemethyleerd DNA, optimaliseren we opeenvolgend drie parameters van het DNA: de afstand tussen hemi-gemethyleerde GATC-sequenties, de lengte van de duplex en de afwezigheid of aanwezigheid van 5'-overhangs. Deze studie maakt gebruik van een DME-variant van seek a met een puntmutatie in het eindterminale domein die verdere ligamentisatie voorkomt en een verkorte linker die DNA-binding beperkt tot tandem.GATC-herhalingen gescheiden door precies één winding in de DNA-electrophoretische mobiliteitsshift-assays wijzen erop dat het gemodificeerde CK-eiwit bij voorkeur bindt aan GATC-herhalingen die gescheiden zijn door negen tot 10 basenparen. Daarom maken de initiële screenings gebruik van duplexen van 23 tot 24 basenparen lang die twee hemigemethyleerde GATC-herhalingen bevatten, gescheiden door negen of 10 basenparen.Drie duplexen leverden mooi gevormde kristallen op. Hoewel geen van de kristallen diffractie tot een hoge resolutie vertoonde, gaven de gegevens aan dat een A-G-A-T-C scheiding van negen baseparen bij voorkeur leidde tot kristallisatie; het onverwacht versterken van de interacties tussen de groef en het ruggengraat door een CG-dinucleotide tussen de twee GATC-plaatsen op te nemen, veranderde de diffractielimiet van de kristallen niet.In tegenstelling hiermee veranderde het optimaliseren van de lengte van de overhangs de moleculaire contacten en de kristalmorfologie drastisch. De kristalstructuur van dit CK-eiwit gebonden aan een hemigemetyleerde DNA-duplex bevestigde dat het vrije vlak van de DNA-duplex niet betrokken is bij kristalcontacten ondanks de relatieve grootte van het eiwit en het DNA; de meeste interacties tussen symmetriepartners worden gemedieerd door eiwit-eiwit- en eiwit-DNA-interacties. Interessant is dat in dit specifieke geval het gunstige effect van een 5'-dinucleotide-overhang niet te wijten is aan de vorming van een pseudocontinu DNA.In plaats daarvan steekt het 5'-uiteinde van de gemethyleerde streng weg van de DNA-assen en interageert het met het proximale CK-molecuul van het complex, wat verklaart waarom twee nucleotiden strikt noodzakelijk waren om de kristalpakking te veranderen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht hebben in hoe u eiwitten zuivert en DNA-duplexen ontwerpt voor de kristallisatie van eiwit-DNA-complexen. Het is belangrijk om te onthouden dat, hoewel dit protocol is ontwikkeld om het CK-DNA-complex te kristalliseren, de rationele optimalisatie van de DNA-lengte, sequentie en uiteinden een algemeen kader biedt voor het ontwerpen van DNA-duplexen voor de kristallisatie van andere eiwit-DNA-complexen.

iterative-optimization-dna-duplexes-for-crystallization-seqa-dna

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Structure-based drug design speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van geneesmiddelen. Nastreven van meerdere doelen tegelijkertijd verhoogt de kans op succes voor lood ontdekking. Het volgende artikel belicht hoe de Seattle Structural Genomics Centrum Infectieziektebestrijding maakt gebruik van een multi-target benadering voor gen-tot-structuur bepaling van de PB2 influenza A subunit.

Multi-target Parallel Processing Aanpak voor Gene-to-structuur bepalen van de Influenza Polymerase PB2 Subunit

De 3DNA softwarepakket is een populaire en veelzijdige bioinformatica tool met mogelijkheden om te analyseren, construeren, en drie-dimensionale nucleïnezuur structuren te visualiseren. Dit artikel presenteert gedetailleerde protocollen voor een subset van nieuwe en populaire functies die beschikbaar zijn in 3DNA, van toepassing op zowel individuele structuren en ensembles van verwante structuren.

Het analyseren en opbouwen nucleinezuurstructuren met 3DNA

Hier beschrijven we een algemene methode voor willekeurige microseed matrix screening. Deze techniek is een significante toename van de slaagkans van eiwitkristallisatie screeningsexperimenten, de behoefte aan optimalisatie en een betrouwbare aanvoer van kristallen voor gegevensverzameling en ligand-inweken experimenten.

Het verbeteren van de slaagkans van eiwitkristallisatie door Random Microseed Matrix Screening

DNA-tegeling is een effectieve benadering om programmeerbare nanostructuren te maken. We beschrijven de protocollen om complexe tweedimensionale vormen te construeren door de zelfassemblage van enkelstrengse DNA-tegels.

Zelf-assemblage van Complex Tweedimensionaal Vormen van enkelstrengs DNA Tiles

We beschrijven hierin een test door het koppelen van DNA adenine methyltransferase identificatie (damid) tot high throughput sequencing (damid-volgende). Deze verbeterde werkwijze een hogere resolutie en een groter dynamisch bereik en maakt analyse damid-seq data in combinatie met andere high throughput sequentiebepaling gegevens zoals ChIP-seq, RNA-seq, etc.

Damid-seq: Genoom-brede kaart brengen van eiwit-DNA-interacties door High Throughput Sequencing van adenine gemethyleerd DNA-fragmenten

Deze methode beschrijft de klonen, expressie en zuivering van recombinante Nsa1 voor structurele bepaling door middel van röntgendiffractie en small-angle X-ray scattering (SAXS), en is van toepassing voor de hybride structurele analyse van andere eiwitten die beide bevatten besteld en ontregelde domeinen.

Het combineren van röntgendiffractie met kleine hoek X-Ray Scattering model ongestructureerde regio's van de Nsa1 van S. Cerevisiae

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor T4 afbinding en denatureren pagina zuivering van kleine cirkelvormige DNA moleculen, gloeien en inheemse pagina analyse van circulaire tegels-, montage- en AFM beeldvorming van 1D en 2D DNA nanostructuren, evenals agarose gel elektroforese en centrifugeren zuivering van eindige DNA nanostructuren.

Stabiele DNA motieven, 1D en 2D nanostructuren opgebouwd uit kleine cirkelvormige DNA-moleculen

De endonucleases van de beperking met nieuwe opeenvolgingsspecificiteit kunnen van enzymen worden ontwikkeld die een gedeeltelijk gedegenereerde opeenvolging erkennen. Hier bieden we een gedetailleerd protocol dat we met succes gebruikt om de volgorde specificiteit van NlaIV enzym te veranderen. De belangrijkste ingrediënten van het protocol zijn de in vitro compartimentering van de transcriptie/vertaalreactie en selectie van varianten met nieuwe sequentiespecifiekekenmerken.

In Vitro Gerichte Evolutie van een beperking Endonuclease met strengere specificiteit

Het doel van dit artikel is om de kijker een goed begrip te geven van hoe ze hun kleine volume, dampdiffusieprotocol, voor het kweken van grote, enkele eiwitkristallen, kunnen transformeren in een grote batch microkristallisatiemethode voor seriële kristallografie.

Optimaliseren van de groei van endothiapepsine kristallen voor seriële kristallografie experimenten

We presenteren een protocol voor het bereiden van synthetische biomoleculaire condensaten bestaande uit amfifiele DNA-nanosterren uitgaande van hun samenstellende DNA-oligonucleotiden. Condensaten worden geproduceerd uit een enkele nanostercomponent of twee componenten en worden gemodificeerd om in vitro transcriptie van RNA van een ingebedde DNA-sjabloon te ondersteunen.

Synthetische condensaten en celachtige architecturen van amfifiele DNA-nanostructuren

Leer de iteratieve optimalisatie van DNA-duplexen voor kristallisatie van SeqA-DNA complexen. Deze methode helpt onderzoekers hoogwaardige diffractiekristallen te verkrijgen voor structurele biologie.

Iteratieve optimalisatie van DNA-duplexen voor kristallisatie van SeqA-DNA complexen

Meer video's verkennen