Iteratieve optimalisatie van DNA-duplexen voor kristallisatie van SeqA-DNA complexen
November 1st, 2012
Kristalstructuur van eiwit-DNA-complexen kan inzicht verschaffen in eiwitfunctie, mechanisme, evenals de aard van de specifieke interactie. Hier rapporteren we hoe de lengte en sequentie uiteinden van duplex DNA optimaliseren voor co-kristallisatie met Escherichia coli SeqA, een negatieve regulator van replicatie-initiatie.
Dit experiment beschrijft hoe je diffractiekwaliteitskristallen kunt verkrijgen van een eiwit gebonden aan DNA dat een tandem hem gemethyleerd bevat.GATC. Herhaal om de kristallisatie van het eiwit-DNA-complex te bevorderen. Begin met het rationele ontwerp van de DNA-lengte, de GATC-afstand en de DNA-uiteinden. Ga verder met de complementaire enkelstrengige oligonucleotiden om het DNA te zuiveren en vervolgens om het hemi gemethyleerde DNA-duplex te vormen, en meng dan het gezuiverde seq A om het complex te vormen.
Zoek vervolgens optimale omstandigheden om diffractiekwaliteitskristallen van het eiwit-DNA-complex te laten groeien met kristallisatieproeven met commerciële sparse matrix-schermen. Getoonde resultaten. Deel het effect van variërende DNA-lengte, GATC-afstand en uiteinden op de diffractiekwaliteit van de CQ A DNA-kristallen.
Het doel van dit werk is om diffractiekwaliteitskristallen te verkrijgen van CK gebonden aan DNA, maar het kan ook helpen om de algemene variabelen te begrijpen die moeten worden overwogen bij het ontwerpen van DNA-duplexen voor kristallisatie van andere eiwit-DNA-complexen. Deze procedure zal worden gebruikt in Chang, A voor een doctoraalonderzoeker van mijn lab. Deze studie gebruikt een variant van de DNA-replicatieregulatie-eiwitten. Zoek naar een variant die stabiele dimeren vormt en een verkorte linkerregio heeft tussen zijn izatie en DNA-bindende domeinen.
Deze variant beperkt DNA-binding tot tandem GATC-herhalingen gescheiden uitsluitend door één draai op het DNA. Transformeer eerst BBL 20 1D drie cellen met het plasmide dat codeert voor DEMETRIC seq A onder controle van de T zeven-promotor plaat. De transformatiereactie op LB-agarplaten bevattende 100 microgram per milliliter, ampicilline en plaats in de bacterie-incubator overnacht. Kies gemengde kolonies en start een kleine schaal overnachtelijke cultuur.
De volgende ochtend inoculer je een liter cultuur met 10 milliliter van de overnachtelijke inoculum. Wanneer de cultuur zich in de log-fase bevindt, voeg je twee milliliter van 0,5 molair IPTG toe om eiwitproductie te induceren. Vervolg de incubatie gedurende drie uur in een 37 graden Celsius orbitale shaker.
Verzamel vervolgens de cellen door centrifugatie bij 3.300 G gedurende 10 minuten. Reese, suspendeer het celpalette in zuiveringsbuffer, een ligt door sonicatie en verduidelijk het lysate door centrifugatie bij 39.000 keer G gedurende 40 minuten. Laad nu het S-supernatant op een heparinekolom geëquilibreerd met zuiveringsbuffer.
Om het CK-eiwit te elueren. Gebruik een lineair gradiënt tot een molair natriumchloride. CK-eiwit elueert bij ongeveer 0,7 molair natriumchloride. Trek de CK-bevattende fracties en verdun om de ionensterkte van het monster te verlagen.
Laad vervolgens het monster in een kationenuitwisselingschromatografiekolom E geëquilibreerd met zuiveringsbuffer. Breng een lineair zoutgradiënt aan om zuiver CK-eiwit te lokaliseren bij ongeveer 0,4 molair natriumchloride. Combineer de CK-bevattende fracties.
Concentreer tot drie milligram per milliliter en bewaar in opslag. Ontwerp complementaire ongemethyleerde en gemethyleerde oligonucleotiden. Bereid monsters voor van één micromol van elk gelyofiliseerd enkelstrengs DNA in 800 microliter geautoclaveerde, dubbel gedestilleerd water. Vorm een vortex en zet apart gedurende 15 minuten, nu en 800 microliter.
Heeft twee keer voorverwarmd laadbuffer voor elk monster voor 20 tot 30 nucleotiden lange oligonucleotiden. Bereid een grote 10% denaturerende gel voor. Eenmaal gepolymeriseerd, verwijder de kam en spoel de putjes grondig af. Verzamel de gel en vul de bovenste en onderste reservoirs met één keer TBE-loopbuffer.
Voorloop de gel bij 750 volt om de gel op te warmen tot 55 graden Celsius. Stop vervolgens de run en spoel de putjes grondig af met loopbuffer. Verhit nu de oligonucleotiden gedurende twee minuten tot 90 graden Celsius.
Vorm een vortex en draai. De monsters gaan onmiddellijk naar het laden van de gel. Laat de gel lopen bij ongeveer 700 volt totdat het oligonucleotide is gemigreerd.
Halverwege op een 10% polyacrylamide gel alph fenolblauw co-migreert met oligonucleotiden van ongeveer 20 basen lang en xyleen syl ff met ongeveer 60 basen lang. Demonteer de gel van het apparaat en verwijder de ruimtes op een vlakke oppervlakte. Verwijder een glasplaat en bedek de gel met plasticfolie.
Keer vervolgens de gel om, verwijder de andere glasplaat en bedek de gel met plasticfolie. Markeer vervolgens de banden met UV-licht en een fluorescente plaat achter de gel. Om de DNA-schaduw te zien met een scheermes, snij de band uit en snijd deze in kleine stukjes.
Breng elk monster over in een steriele 15 milliliter buis. Voeg negen milliliter eluciabuffer toe en verdun overnacht bij 37 graden Celsius met roeren. Breng de oplossing voorzichtig over naar een autoclaaf centrifugeerbuis met behulp van een gellaadtip.
Om het overbrengen van acrylamidestukjes te voorkomen, voeg je een milliliter toe van drie milli natriumacetaat op pH zeven plus 25 milliliter gekoelde 100% ethanol. Incubeer bij minuus 20 graden Celsius gedurende ten minste drie uur. Centrifugeer het geprecipiteerde DNA. Droog vervolgens de pellets op de speed vac op gemiddelde warmte en resuspendeer elk pellet in 400 microliter geautoclaveerde, dubbel gedestilleerd water en breng over naar een verse buis.
Voeg 40 microliter toe van drie molair natriumacetaat op pH zeven en een milliliter 100% ethanol. Vorm een vortex en incubeer gedurende 30 minuten bij minuus 20 graden Celsius. Na centrifugatie gedurende 15 minuten bij 18.000 keer G, spoel de DNA-pellets af met 100 microliter 70% koud ethanol om eventuele resterende zouten te verwijderen. Centrifugeer gedurende zes minuten bij 18.000 keer G en gooi vervolgens de ethanol weg en droog de pellet op een speed vac.
Stuur nu elk pellet opnieuw in 100 microliter geautoclaveerde dubbel gedestilleerd water. Bepaal de concentratie van de oligonucleotiden door spectrometrie. Om de hemi gemethyleerde DNA-duplexen te bereiden, meng je eerst gelijke mol
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel beschrijft het proces van het verkrijgen van diffractiekwaliteit kristallen van een eiwit gebonden aan DNA. Het benadrukt de optimalisatie van DNA-lengte, GATC-afstand en uiteinden om de kristallisatie van het eiwit-DNA complex te verbeteren.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Structurele biologie
- Kristallografie
- Eiwit-DNA interacties
Achtergrond
- Het begrijpen van eiwit-DNA complexen is cruciaal voor inzichten in eiwitfunctie.
- Kristalstructuren kunnen mechanismen van eiwitinteracties onthullen.
- Escherichia coli SeqA is een negatieve regulator van replicatie-initiatie.
- Optimaliseren van DNA-ontwerp is essentieel voor succesvolle co-kristallisatie.
Doel van de studie
- Om DNA-parameters te optimaliseren voor co-kristallisatie met SeqA.
- Om de effecten van DNA-modificaties op kristallenkwaliteit te onderzoeken.
- Om een protocol te bieden voor het verkrijgen van hoogwaardige diffractiekristallen.
Gebruikte methoden
- Rationeel ontwerp van DNA-lengte en sequentie.
- Bereiding van hemi-gemethyleerde DNA-duplexen.
- Zuivering van DNA met behulp van complementaire oligonucleotiden.
- Kristallisatieproeven met commerciële sparse matrix schermen.
Belangrijkste resultaten
- Variëren van DNA-lengte en GATC-afstand heeft significante invloed op de kristallenkwaliteit.
- Optimale omstandigheden voor het kweken van diffractiekwaliteit kristallen werden geïdentificeerd.
- De studie toonde succesvolle vorming van eiwit-DNA complexen aan.
- Resultaten geven inzichten in het kristallisatieproces voor vergelijkbare complexen.
Conclusies
- Optimaliseren van DNA-ontwerp is cruciaal voor succesvolle kristallisatie.
- De bevindingen kunnen helpen bij toekomstige studies van eiwit-DNA interacties.
- Dit protocol kan worden aangepast voor andere eiwit-DNA complexen.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Optimizing DNA duplex design for protein-DNA crystallization addresses a key bottleneck in structural biology workflows, where poor crystal quality impedes target validation and mechanistic de-risking. Systematic variation of DNA length, GATC spacing, and terminal overhangs enables identification of conditions that promote diffraction-quality crystals, directly supporting lead identification efforts for replication-associated targets. This approach provides a reusable framework for enhancing predictive confidence in early discovery by improving the success rate of structural studies on protein-DNA complexes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of SeqA-DNA binding preferences through systematic screening of hemimethylated GATC repeat spacing and duplex length.
- Operational Value: Provides a standardized protocol for preparing hemimethylated DNA duplexes compatible with crystallization screening.
- Predictive Value: Identifies optimal DNA parameters (9-10 bp GATC separation, 5' overhang presence) that correlate with improved crystal morphology and diffraction quality.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Demonstrates how DNA end modifications (blunt vs. 5' overhang) alter molecular contacts and crystal packing in protein-DNA complexes.
- Operational Value: Uses commercial sparse matrix screens to identify initial crystallization conditions, enabling scalable assay setup.
- Predictive Value: Shows that 5' dinucleotide overhangs, not pseudo-continuous DNA formation, drive beneficial crystal contacts via strand-specific protein interactions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Confirms that protein-protein and protein-DNA interactions dominate crystal packing when the protein footprint covers most of the DNA, informing target selection for structural studies.
- Operational Value: Establishes a workflow for purifying SeqA variants and forming hemimethylated DNA complexes suitable for high-throughput screening.
- Predictive Value: Links DNA design optimization to reduced mechanistic ambiguity in replication initiation regulation, supporting risk-adjusted advancement decisions.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the early discovery continuum, where optimized DNA duplex design enables structural interrogation of replication regulatory proteins, informing target validation and lead identification stages.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of SeqA binding specificity to tandem GATC repeats through defined DNA duplex design.
- Screening: Enables assay readiness via standardized preparation of hemimethylated DNA duplexes for crystallization trials.
- Analytics: Provides quantitative readouts on crystal diffraction quality as a function of DNA length, spacing, and end modifications.
- Translational Research: Connects structural insights to functional understanding of SeqA's role in organizing newly replicated DNA.
- Enterprise Reuse: Offers a adaptable framework for designing DNA duplexes for crystallization of other protein-DNA complexes beyond SeqA.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in protein-DNA interactions by enabling high-resolution structural data.
- Operational Value: Standardizes DNA duplex preparation and purification, improving reproducibility across crystallization campaigns.
- Strategic Value: Increases success rate of structural studies, leading to better go/no-go decisions in target validation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of replication-associated targets through improved structural confidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, protein purification, and crystallization techniques.
- Dependent on access to commercial sparse matrix screens and crystallization imaging systems.
- Necessitates standardization of hemimethylated DNA duplex preparation across teams.
- Involves adaptation considerations for different protein-DNA systems based on relative size and footprint.
- Limited by the need for iterative optimization of DNA length, spacing, and ends to achieve diffraction quality.
