Name: Techniek skeletspier weefsel van muizen myoblast progenitorcellen en toepassing van elektrische stimulatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Leer hoe je skeletspierweefsel genereert uit muizen-myoblast-voorlopercellen met behulp van hydrogel-ankerpunten en elektrische stimulatie. Deze methode ondersteunt regeneratieve geneeskunde en duurzame vleesproductie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen Yabin Wu bedanken voor het kweken van de weefsels die in figuur 2, werd de foto genomen door Bart van Overbeeke. Het werk werd financieel ondersteund door SenterNovem, subsidie ​​ISO 42022.

1. Cultuur van Murine myoblast Progenitor Cellen of C2C12 Cellen <ol><li> Isoleer cellen volgens het protocol oorspronkelijk gepubliceerd Shefer en collega&#39;s 10 en later aangepast door Collins et al.. 11 en Boonen et al.. 12 en bewaar deze in vloeibare stikstof. Dit vereist muizen, bijv. C57Bl / 6. Alternatieve methoden worden in andere laboratoria, bijvoorbeeld een methode, gepubliceerd in Journal of Gevisualiseerde Experimenten door Li Y et al.. 13. Voor de reagentia en apparatuur wordt verwezen naar de tabel op pagina 7 en 8. Van de spier van een muis kunt u over het algemeen het verkrijgen van voldoende cellen tot ongeveer 20 flesjes in vloeibare stikstof cryopreserveren. Vervolgens beginnen we het protocol bij de cellen van de vloeibare stikstof opslag ontdooien. </li><li> Plaats de cellen van een flacon in een 25 cm 2 Matrigel (1 mg / ml) bekleed weefselkweekfles en voeg groeimedium (GM) bestaande uit (335 ml DMEM advanced, 100 ml foetale bovine serum (FBS), 50 ml HS, 5 ml penicilline / streptomycine, 5 ml L-glutamine, 5 ml kippenembryo extract (CEE)). </li></ol> Let op: jas voor 2 uur bij kamertemperatuur en de Matrigel door aspiratie te verwijderen. <ol start="3"><li> Subcultuur van de cellen ongeveer 01:03 om de 3 dagen. Dit betekent: op dag 3: Passage cellen van een 25 cm 2 bij een 75 cm2 fles, op dag 6: passage cellen van een 75 cm2 fles met twee 150 cm2 flessen (met 30 min preplating in ongecoate kolven). Op dag 9 overdracht een 150 cm2 kolf tot 1 triple 150 cm2 kolf, of bij ontstentenis drie 150 cm2 flessen (indien nodig preplate weer afhankelijk van het fenotype van de cellen). Op dag 12 de cellen klaar voor het zaaien in een spier construct. </li></ol> Opmerkingen: - Per triple 150 cm 2 het aantal cellen zal ongeveer 4,5 x 10 6 cellen. - Gebruik vials uit verschillende isolaten te mengen tot een gemengde populatie van cellen te verkrijgen op het moment van zaaien. Opmerking: Als u ervoor kiest niet te werken met primaire cellen, C2C12 myoblasten zijn een goed alternatief. 2. Techniek Skeletal spierweefsel <ol><li> Bereid siliconenlijm door mengen van de &quot;elastomeer&quot; de &quot;hardingsmiddel&quot; (10:1). Cut + / - 5 mm vierkant segmenten van klittenband met een driehoekige kant (huis-achtige vorm; Figuur 1). Lijm het klittenband in de putjes van een 6-wells plaat cultuur in een ruimte van ongeveer 12 mm tussen de pleinen. </li></ol> Opmerkingen: - Gebruik alleen de zachte kant van het klittenband en het gezicht van deze kant naar boven. - Zorg ervoor dat de daken naar elkaar toe. - Alleen de klittenband te bedekken met siliconenlijm, verspreiden zich niet lijmen in de put. - Voor elektrostimulatie later is relevant voor de constructen lijnen in verticale richting van de put platen (langs de lange as). <ol start="2"><li> Laat een nacht drogen in een vacuümoven, niet verwarmd, vooral om luchtbellen te verwijderen. Steriliseer door toevoeging 70% EtOH aan de putjes en incubeer gedurende 15 minuten. Spoel 3x met PBS en onder UV gedurende 15 minuten. Verwijder alle PBS uit de putjes en de klittenband en in incubator tot gebruik. </li><li> Ontdooien Matrigel oplossing in de koelkast en bereiden collageenoplossing tot de gewenste concentratie kort voordat de 3D constructen. Verdun de stock collageen met steriel 0,02% azijnzuur (eindconcentratie 3,2 mg / ml). </li></ol> Let op: laat alles op ijs. <ol start="4"><li> Trypsinize de cellen, resuspendeer in GM en tellen. Laat cellen in centrifugebuis in de incubator. </li><li> Voeg de gewenste hoeveelheid Collageen voorraad oplossing voor het aantal constructies die u wilt maken op een buis (volgens tabel 1), voeg 0,5 M NaOH aan deze collageen oplossing totdat een licht roze color aangeeft een pH van 7,5. Meng voorzichtig door en neer te pipetteren zonder blaasjes vorming. Voeg dan de Matrigel en meng zeer grondig, maar voorzichtig. Voeg ten slotte de GM de Collagen / Matrigel mengsel (voor de juiste hoeveelheden zie Tabel 1). </li></ol> Opmerkingen: - Voer elke stap op het ijs! Matrigel en collageen gel zal gemakkelijk bij toenemende temperatuur. - Let op dat de kleur inderdaad roze is! Een toename van pH zal induceren snelle gelering. - Eindconcentratie van collageen: 1,6 mg / ml. <ol start="6"><li> Centrifugeer de gewenste hoeveelheid cellen bij 1000 rpm gedurende 5 min en verwijder het supernatant. </li></ol> Opmerking: - Afhankelijk van de activiteit van de cellen het aantal cellen per construct moet worden aangepast. Typisch, het aantal cellen ligt tussen 750.000 en 1.250.000 cellen per construct. <ol start="7"><li> Voor sommige gel mengsel de cel pellet te resuspenderenen breng de cellen in de resterende mengsel en meng grondig, maar zonder dat er luchtbellen. </li><li> Neem de voorverwarmde well platen uit de incubator en pipet 0,35 -0,4 ml van de cel-gel mengsel in de klittenband eerst. Vervolgens beginnen het mengsel pipet uit het midden tussen de bevestigingsplaatsen en de Velcro verlengen. Gebruik ten slotte de rest van gel op te vullen het gat tussen de twee klittenband ankers en pipet om de klittenband stukken. </li><li> Controleer zorgvuldig na 5-10 min als de gels zijn solide genoeg om te worden overgedragen, dat wil zeggen tik de gerechten en inspecteer visueel als de gel is stijf. Als dat zo is, plaatst u voorzichtig de schalen in een incubator. Meestal kunnen ze worden opgehaald na tien minuten. Dan, na 1-2 uur voorzichtig bedekken elke gel met 4 ml warm GM. </li></ol> Let op:-Maak geen krachtige bewegingen bij het ​​hanteren van de platen. <ol start="10"><li> Vervang GM door differentiatie medium (groeimediumzonder kippenembryo-extract) na 24 uur, en te vervangen door vers medium om de 2-3 dagen. Op dag 7 moet verkregen rijpe georiënteerde spiervezels, zoals kan worden geëvalueerd met kleuring voor cross strepen ontwikkeling in de gesmolten spiervezels. </li></ol> 3. Elektrische Stimulatie <ol><li> Steriliseer de elektroden van de ionoptix plaat (zie tabel van de reagentia en apparatuur) voor gebruik met 70% ethanol en vervolgens droog onder UV in een veiligheidskabinet. Plaats de plaat met elektroden op de cultuur plaat met de constructen en dek af met het deksel van de petrischaal en overdracht aan een incubator. Sluit de Ionoptix C-pacer met de juiste kabels. </li></ol> Opmerking: elektroden parallel geplaatst naast de spier construct (figuur 2). <ol start="2"><li> Breng de stimulatie protocol zoals verwacht. </li></ol> Opmerking: We gebruiken over het algemeen 4 V / CM,6ms pulsen met een frequentie van 2 Hz. Wijzig kweekmedium om de 24 uur tijdens de stimulatie.

<ol><li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meet+the+new+meat%3A+tissue+engineered+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Food+Sci.+Tech%22%5BJournal%5D)">Meet the new meat: tissue engineered skeletal muscle.</a> Trends Food Sci. Tech. 21 (2), 59-66 (2010).</li>
<li>Shansky, J., Chromiak, J., Tatto, M., Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+method+for+tissue+engineering+skeletal+muscle+organoids+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Animal%22%5BJournal%5D)">A simplified method for tissue engineering skeletal muscle organoids in vitro.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Animal. 33 (9), 659-661 (1997).</li>
<li>Vandenburgh, H., Del Tatto, M., Shansky, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum. Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Yaffe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+differentiation+potentialities+during+prolonged+cultivation+of+myogenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 61 (2), 477-483 (1968).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J. Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Koning, M., Werker, P. M. N., vander Schaft, D. W. J., Bank, R. A., Harmsen, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-1+and+MicroRNA-206+Improve+Differentiation+Potential+of+Human+Satellite+Cells%3A+A+Novel+Approach+for+Tissue+Engineering+of+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-1 and MicroRNA-206 Improve Differentiation Potential of Human Satellite Cells: A Novel Approach for Tissue Engineering of Skeletal Muscle.</a> Tissue Eng. Part A. , (2011).</li>
<li>Darabi, R., Pan, W., Bosnakovski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+myogenic+engraftment+from+mouse+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Functional myogenic engraftment from mouse iPS cells.</a> Stem Cell Rev. 7 (4), 948-957 (2011).</li>
<li>Langelaan, M. L. P., Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+maturation+by+electrical+stimulation%3A+Differences+in+response+between+C2C12+and+primary+muscle+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Advanced maturation by electrical stimulation: Differences in response between C2C12 and primary muscle progenitor cells.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 5 (7), 529-539 (2011).</li>
<li>van der Schaft, D., van Spreeuwel, A. C., van Assen, H. C., Baaijens, F. Mechanoregulation of vascularization in aligned tissue engineered muscle; a role for VEGF. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avan+der+Schaft%2C+D+%22Tissue+Eng.+Part+A%22">Tissue Eng. Part A</a>. , (2011).</li>
<li>Shefer, G., Wleklinski-Lee, M., Yablonka-Reuveni, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle+satellite+cells+can+spontaneously+enter+an+alternative+mesenchymal+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle satellite cells can spontaneously enter an alternative mesenchymal pathway.</a> J. Cell. Sci. 117 (Pt. 22), 5393-5404 (2004).</li>
<li>Collins, C. A., Olsen, I., Zammit, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+function%2C+self-renewal%2C+and+behavioral+heterogeneity+of+cells+from+the+adult+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche.</a> Cell. 122 (2), 289-301 (2005).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Rosaria-Chak, K. Y., Baaijens, F. P. T., van der Schaft, D. W. J., Post, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+environmental+cues+from+the+satellite+cell+niche%3A+optimizing+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Essential environmental cues from the satellite cell niche: optimizing proliferation and differentiation.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296 (6), C1338-C1345 (2009).</li>
<li>Li, Y., Pan, H., Huard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+Stem+Cells+from+Soft+Musculoskeletal+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating Stem Cells from Soft Musculoskeletal Tissues.</a> J. Vis. Exp. (41), e2011(2010).</li>
<li>Boonen, K. J. M., Langelaan, M. L. P., Polak, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+a+combined+mechanical+stimulation+protocol%3A+Value+for+skeletal+muscle+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Effects of a combined mechanical stimulation protocol: Value for skeletal muscle tissue engineering.</a> J. Biomech. 43 (8), 1514-1521 (2010).</li>
<li>Gawlitta, D., Boonen, K. J. M., Oomens, C. W. J., Baaijens, F. P. T., Bouten, C. V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+serum-free+culture+conditions+on+skeletal+muscle+differentiation+in+a+tissue-engineered+model%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">The influence of serum-free culture conditions on skeletal muscle differentiation in a tissue-engineered model.</a> Tissue Eng. Part A. 14 (1), 161-171 (2008).</li>
<li>Koning, M., van Luijn, M., van der Schaft, D. W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+formation+and+engraftment+In+vivo+is+independent+of+preconditioning+In+vitro+with+HUVEC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle formation and engraftment In vivo is independent of preconditioning In vitro with HUVEC.</a> , In revision (2013).</li>
<li>Levenberg, S., Rouwkema, J., Macdonald, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+vascularized+skeletal+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering vascularized skeletal muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 23 (7), 879-884 (2005).</li>
<li>Koffler, J., Kaufman-Francis, K., Yulia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vascular+organization+enhances+functional+integration+of+engineered+skeletal+muscle+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Improved vascular organization enhances functional integration of engineered skeletal muscle grafts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (36), 14789-14794 (2011).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De engineering van spierweefsel heeft een groot potentieel voor het gebruik als een ziekte model, voor drug discovery, in de regeneratieve geneeskunde en voor de vleesproductie. Echter, de eisen voor deze toepassingen variëren. We kozen voor werken met een combinatie van collageen en Matrigel, omdat collageen maakt celuitlijning en omdat de myoblast progenitor cellen vereisen de aanwezigheid van basale membraan eiwitten afkomstig zoals bepaald in eerdere studies 2D 12. Bovendien zijn fibrinegelen getest in on...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> Matrigel-groeifactor verminderd </td><td> Beckton en Dickinson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM (hoog glucose) * </td><td> Gibco </td><td> 42430 </td><td></td></tr><tr><td> Geavanceerde DMEM </td><td> Gibco </td><td> 12491 </td><td></td></tr><tr><td> Paardenserum </td><td> Gibco </td><td> 65050-122 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum </td><td> Greiner </td><td> 758075 </td><td></td></tr><tr><td> 0,45 en 0,22 urn spuitfilter * </td><td> Whatmann (Schleicher en Scheull) </td><td> 10462100 </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030024 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Penicilline / streptomycine </td><td> Gibco </td><td> 10378016 </td><td></td></tr><tr><td> Amfotericine </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Cultuur kunststof </td><td> Greiner </td><td></td><td> Inclusief cultuur kolven en pipetten </td></tr><tr><td> Kippenembryo-extract </td><td> United States Biological </td><td> C3999 </td><td></td></tr><tr><td> Pasteur pipet * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> Pasteurpipetten, met een vernauwing, met katoen, open tip L: 230 mm met tip diameter van 0,9 - 1,1 mm </td></tr><tr><td> Pasteur pipet * </td><td> Hilgenberg </td><td></td><td> Pasteurpipetten, met een vernauwing, met katoen, open tip L: 230 mm met tip diameter van 1,4 - 1,6 mm </td></tr><tr><td> Pasteur pipet </td><td> VWR </td><td> 612-1702 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase type I* </td><td> Sigma </td><td> C0130-16 </td><td></td></tr><tr><td> 40 um cel zeef * </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> 19G naald </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Elastomeer </td><td> Dow Corning Corporation </td><td> 3097358-1004 </td><td> Silastic MDX 4-4.210 # </td></tr><tr><td> Verharder </td><td> Dow Corning Corporation </td><td></td><td> Silastic MDX 4-4.210 # </td></tr><tr><td> Klittenband </td><td> Reguliere winkel </td><td></td><td> U kunt deze kopen bij een reguliere winkel, alleen de zachte kant </td></tr><tr><td> Collageen type I, rattenstaart </td><td> BD Biosciences </td><td> 3544236 </td><td></td></tr><tr><td> C-Pace EP Cultuur Pacer </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6-well kweekplaten voor elektrische stimulatie </td><td> Beckton Dickinson-Falcon </td><td> BD Falcon # 353846 </td><td></td></tr><tr><td> C-Dish cultuur schotel elektroden </td><td> Ionoptix </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * Nodig voor de isolatie van cellen (punt 1.1) # Samen in een kit </td></tr></tbody></table>

techniek skeletspier weefsel van muizen myoblast progenitorcellen en toepassing van elektrische stimulatie

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Ontworpen spierweefsel kan worden gebruikt voor verschillende doeleinden, waaronder de productie van weefsel voor gebruik als een ziektemodel in vitro, bijv. decubitus bestuderen voor regeneratieve geneeskunde en als vlees alternatief 1. De eerste melding 3D spier constructen zijn vele jaren geleden gemaakt en pioniers op het gebied zijn Vandenburgh en collega&#39;s 2,3. Vooruitgang in spierweefsel engineering zijn niet alleen het gevolg van de enorme winst in kennis van de biochemische factoren, stamcellen en progenitorcellen, maar zijn met name gebaseerd op inzichten die door de onderzoekers dat de fysieke factoren een essentiële rol in de controle van cel gedrag spelen en weefsel ontwikkeling. State-of-the-art ontworpen spier bouwt bestaan ​​momenteel uit cel-bevolkte hydrogel constructen. In ons lab deze over het algemeen bestaan ​​uit murine myoblast progenitorcellen, geïsoleerd uit muizen achterste ledematen spieren of een muizen myoblast cellijn C2C12, mixed met een mengsel van collageen / Matrigel en uitgeplaat tussen twee ankerpunten, nabootsen van de spier ligamenten. Andere cellen kunnen eveneens worden overwogen, bijvoorbeeld alternatieve cellijnen zoals L6 myoblasten rat 4 neonatale spier afgeleide progenitorcellen 5, cellen afkomstig van volwassen spierweefsel van andere species zoals humaan 6 of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS cellen) 7 . Cell contractiliteit veroorzaakt uitlijning van de cellen langs de lengteas van de construct 8,9 en differentiatie van de spier progenitorcellen na ongeveer een week van cultuur. Bovendien is de toepassing van elektrische stimulatie kan de differentiatie verbeteren enigszins 8. Vanwege de beperkte omvang (8 x 2 x 0,5 mm) het volledige weefsel kan worden geanalyseerd met behulp van confocale microscopie zoals levensvatbaarheid, differentiatie en celuitlijning controleren. Afhankelijk van de specifieke toepassing van voorschriften voor de engineerood spierweefsel variëren, bijvoorbeeld bij gebruik voor regeneratieve geneeskunde is het opschalen van weefsel grootte en vascularisatie, terwijl om als vleesvariatie vertaling naar andere soorten noodzakelijk.

Het eindproduct wordt spier constructen zoals aangegeven in figuur 3. De grootte van het weefsel zal ongeveer 8 mm lang en 2 mm breed en 0,5 mm dik. Elektrische stimulatie tijdens differentiatie verandert de expressie van myosine zware keten isovormen, maar niet sterk verbeteren van de differentiatieproces zoals geïnduceerd door de differentiatie medium 8, maar elektrische stimulatie kan ook worden toegepast op het einde van het proces om te controleren functionaliteit van de spier omdat een spier met v...

Engineered spierweefsel heeft een groot potentieel in de regeneratieve geneeskunde, als de ziekte model en ook als een alternatieve bron voor vlees. Hier beschrijven we de constructie van een spier construct, in dit geval van muis myoblast progenitor cellen en stimulering van elektrische pulsen.

Techniek skeletspier weefsel van muizen myoblast progenitorcellen en toepassing van elektrische stimulatie

Door techniek vervaardigde spierweefsels kunnen voor verschillende doeleinden worden gebruikt, waaronder de productie van weefsels voor gebruik als in vitro ziektevoorbeeld, bijvoorbeeld om ...

Het algemene doel van deze procedure is het genereren van gemanipuleerd spierweefsel. Dit wordt bereikt door eerst satellietcellen of een myoblastcellijn te kweken om het vereiste aantal cellen te verkrijgen. De tweede stap is het maken van de ankerpunten.Vervolgens worden de cellen gemengd met een gel en wordt het resulterende mengsel gegoten tussen de ankerpunten. De laatste stap is het differentiëren van de cellen tot spierweefsel. Uiteindelijk kan elektrische stimulatie worden gebruikt om contracties van de cellen op te wekken, en kunnen fluorescente kleuring en fluorescentie- of confocale microscopie worden gebruikt om de sarcomere organisatie van het cytoskelet in de gedifferentieerde spiercellen aan te tonen.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat spiercellen in deze weefsels in één richting zullen uitlijnen. Deze techniek heeft ook implicaties voor patiënten die lijden aan spierverlies. Als we in de toekomst bijvoorbeeld eigen cellen van de patiënt gebruiken om deze weefsels te maken, kunnen deze worden ingezet voor transplantatiedoeleinden.Deze methode biedt inzicht in de ontwikkeling van spieren en spierschade, maar biedt ook inzicht voor innovatieve toepassingen zoals regeneratieve geneeskunde en in vitro gekweekt vlees. De demonstratie van de procedure zal de methoden beschrijven voor het isoleren en invriezen van myoblast progenitorcellen, zoals elders is beschreven.Raadpleeg het schriftelijke protocol voor de volledige referenties. Nadat het vial met muis-myoblast progenitorcellen uit de vloeibare stikstof is gehaald, wordt het vial geplaatst in een waterbad op 37 °C om te ontdooien.Voeg vervolgens 10 milliliters verwarmd groeimedium toe aan een met Matrigel gecoate weefselkweekfles van 25 centimeter squared. Zodra de cellen zijn ontdooid, wordt de inhoud van het vial aan het medium toegevoegd. Incubeer de cellen in de weefselkweekfles bij 37 degrees Celsius en 5%carbon dioxide.Oogst op dag drie van de incubatie de cellen met trypsine, resuspensie en centrifugatie bij 1000 RPM. Passeer de cellen vervolgens naar een tissue culture flask van 75 cm² gecoat met Matrigel. Splits de cellen elke drie dagen en pas op dag zes de cellen over naar een tissue culture flask van 150 cm² gecoat met Matrigel. Transfer op dag negen de cellen van de tissue culture flask van 150 cm² gecoat met Matrigel naar een triple 150 cm² tissue culture flask gecoat met Matrigel of naar drie flasks van 150 cm².Op dag 12 van de incubatie zijn de cellen klaar om in een spierconstruct te worden gezaaid. Begin met het uitknippen van stukken klittenband van ongeveer vijf millimeter vierkant, waarbij één zijde een driehoekige vorm heeft zoals weergegeven in dit schema; er wordt alleen de zachte zijde van het klittenband gebruikt. Bereid vervolgens siliconenlijm voor door het elastomeer te mengen met het hardingsmiddel in een verhouding van 10 op 1.Lijm vervolgens twee stukjes klittenband in elke put van een kweekplaat met zes putten, waarbij ongeveer 12 millimeters ruimte tussen de stukjes wordt gelaten, en laat dit een nacht drogen. Steriliseer de volgende dag de putten en het klittenband door 70%ethanol aan de putten toe te voegen en deze 15 minuten te incuberen. Spoel de putten vervolgens drie keer met PBS.Laat de derde wasbeurt in de wells achter en stel de plaat 15 minuten bloot aan UV-licht. Aspireer vervolgens de PBS en plaats de platen in de weefselkweekincubator tot ze klaar zijn voor gebruik. Bereid een oplossing voor van 3,2 mg/mL collageen en steriel 0,02% azijnzuur.Plaats de collageenoplossing op ijs samen met de matrigel-oplossing die vooraf in de koelkast is ontdooid. Oogst vervolgens de cellen door trypsinisatie en centrifugatie. Resuspendeer daarna het celpellet in groeimedium en voer een celtelling uit volgens standaardprocedures.Zodra de cellen zijn geteld, plaatst u de buis met de cellen in de weefselkweekincubator. De matrixoplossing wordt bereid door de volgende percentages van de oplossingen op ijs te mengen: 51,3% collageenoplossing 0,2% 0,5 molair natriumhydroxide, 8,6% matrixgel en 39,9% groeimedium. Zorg ervoor dat de uiteindelijke oplossing roze van kleur is, aangezien een stijging van de pH kan leiden tot snelle gelering.Het uiteindelijke volume hangt af van het aantal wells dat wordt geplaatst. Deze tabel toont de volumes voor 10 spieren. Zorg ervoor dat de cellen volledig zijn geresuspendeerd en breng 750, 000 tot 1, 250, 000 cellen per construct over naar een schone centrifugebuis; centrifugeer 5 minuten bij 1000 RPM, aspireer het supernatant en resuspendeer de celpellet in een klein maar voldoende volume van het matrixmengsel.Zodra het pellet volledig is geresuspendeerd, voegt u de cellen toe aan het resterende volume van het matrixmengsel. Nadat u de voorverwarmde platen uit de incubator heeft gehaald, pipetteert u 0.35 tot 0.4 milliliters van het cel-matrixmengsel in elk stuk Velcro. Pipetteer het mengsel vervolgens vanaf het centrum tussen de aanhechtingsplaatsen en breid dit uit naar het Velcro.Gebruik tot slot het restant van de gel om de opening tussen de twee klittenbandankers op te vullen en pipetteer rond de klittenbandstukjes. Dek de plaat af en laat deze vijf tot 10 minuten op kamertemperatuur staan. Tik vervolgens voorzichtig tegen de schaal en controleer visueel of de gel stijf is.Indien dit het geval is, kunnen de schaaltjes voorzichtig worden overgebracht naar de weefselkweekincubator. Na één tot twee uur in de incubator wordt elke gel voorzichtig bedekt met vier milliliter voorverwarmd groeimedium. Plaats de plaat vervolgens terug in de weefselkweekincubator.Vervang na 24 uur het groeimedium door differentiatiedium. Herhaal de mediumwissel elke twee tot drie dagen. Volgroeide, georiënteerde spiervezels zouden op dag zeven van de cultuur zichtbaar moeten zijn.Op dit punt kunnen de vezels elektrisch worden gestimuleerd. Steriliseer eerst de elektroden van de ionoptiekplaat met 70% ethanol gedurende 15 minuten en droog deze gedurende 30 minuten onder UV-licht. Plaats vervolgens de gesteriliseerde elektroden op de kweekplaat, waarbij u ervoor zorgt dat de elektroden parallel aan het spierconstruct worden geplaatst, zoals getoond in deze afbeelding van de onderkant van een plaat; de witte pijlen geven aan dat de elektroden de plaat bedekken met het deksel erop, en plaats deze vervolgens in de weefselkweekincubator.Verbind de ionenoptische C-pacer met de juiste kabels en pas hier het stimuleringsprotocol toe. Er worden pulsen van 4 V/cm van 6 ms gebruikt bij een frequentie van 2 Hz.Elektrische stimulatie wordt gewoonlijk gedurende een periode van 48 uur uitgevoerd. Vervang het kweekmedium elke 24 uur tijdens de stimulatie. Deze afbeelding toont een typisch voorbeeld van een volwassen spierconstruct.De afmetingen van het weefsel zijn ongeveer acht millimeter lang, twee millimeter breed en 0,5 millimeter dik. Deze afbeelding toont een typisch voorbeeld van een spierprogenitorcel in technisch vervaardigde skeletspierweefsels. Bevroren coupes van niet-gestimuleerde mirroring bio-artificiële spieren of M bms.Op dag acht van de differentiatie werd gekleurd voor sarcomere alfa-actinine (weergegeven in rood), sarcomere myosine (weergegeven in groen) en kernen (weergegeven in blauw). De panelen rechts zijn vergrotingen van de omkaderde gebieden. Het protocol kan ook worden toegepast op C2C12-cellen.Deze afbeelding toont gedifferentieerde C2C12-cellen die op dezelfde wijze zijn gekleurd als in de laatste afbeelding. Sarcomere alfa-actinine is in het rood weergegeven. Sarcomere myosine is in het groen weergegeven en kernen zijn in het blauw weergegeven.Ook hier zijn de panelen aan de rechterkant vergrotingen van de omkaderde gebieden. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alles op ijs moet blijven. Na deze procedure kunnen andere methoden worden toegepast om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals kwantitatieve PCR om veranderingen in genexpressieniveaus na de ontwikkeling aan te tonen.De techniek maakte het voor onderzoekers mogelijk om de rol van mechanica bij weefselmorfogenese te bestuderen. Het heeft daarnaast geholpen bij het ontwerpen van kunstmatige hartspiermodellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u kunstmatige spierweefsels kunt genereren met behulp van een scaffold op basis van hydrogel.

engineering-skeletal-muscle-tissues-from-murine-myoblast-progenitor

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

De micro-ontleed explantaten techniek is een robuuste en betrouwbare methode voor het isoleren van proliferatieve skeletspieren cellen van jonge, volwassen of embryonale spieren als bron van skeletspieren stamcellen. Uniek, zijn deze cellen zijn klonaal ontleend aan de skeletspieren stamcellijnen gebruikt voor in vivo transplantatie te produceren.

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Een muizenmodel van neuromusculaire elektrostimulatie (NMES), een veilige en goedkope klinische modaliteit, aan de voorste compartiment spieren wordt beschreven. Dit model heeft het voordeel van het wijzigen van een beschikbaar klinische inrichting voor het opwekken van gerichte en specifieke spiercontracties in muizen.

Een muizenmodel van Muscle Training door Neuromusculaire elektrische stimulatie

Isolatie en cultuur van myovezels is de gouden...

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

Geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide myogene voorlopers zijn veelbelovende kandidaten voor celtherapiestrategieën om spierdystrofieën te behandelen. Dit protocol beschrijft transplantatie en functionele metingen die nodig zijn om de engraftment en differentiatie van iPSC-afgeleide mesoangioblasten (een type spiergenitors) te evalueren in muismodellen van acute en chronische spierregeneratie.

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Dit protocol maakt gebruik van elektroporatie om fluorescerend gelabelde eiwitten te introduceren en tot expressie te brengen in muisspiervezels. Na herstel na elektroporatie worden de vezels geïsoleerd. Individuele vezels worden vervolgens geïmaged met behulp van hoge resolutie confocale microscopie om de spierstructuur te visualiseren.

DNA Elektroporatie, Isolatie en beeldvorming van myofibers

We beschrijven een nieuwe experimentele techniek die wij minimaal invasieve spier insluiten (MIME), die is gebaseerd op het bewijsmateriaal bellen dat skelet spierweefsel levensvatbare myogenic cellen, die vergemakkelijken donor-cel-gemedieerde myogenesis bevat kunnen wanneer ingeplant een host spier.

Minimaal invasieve spier insluiten (MIME) - een roman experimentele techniek ter vergemakkelijking van de Donor-cel-gemedieerde Myogenesis

Hier presenteren we een protocol voor de opleiding van de bevolking van een cel met behulp van elektrische en mechanische stimuli emuleren cardiale fysiologie. Deze elektromechanische stimulatie verbetert het cardiomyogenic potentieel van de behandelde cellen en is een veelbelovende strategie voor verdere celtherapie, ziekte modellering en drug screening.

Gelijktijdige elektrische en mechanische stimulatie ter verbetering van de cellen Cardiomyogenic potentieel

Myoblasten zijn prolifererende precursor cellen die differentiëren om polynucleated myotubes en uiteindelijk skeletspieren myofibers vormen. Hier presenteren we een protocol voor efficiënte isolatie en cultuur van primaire myoblasten van jonge volwassen muis skeletspieren. De methode maakt moleculaire, genetische, en metabole studies van spiercellen in de cultuur.

Isolatie en differentiatie van primaire Myoblasten van muis skeletspieren Explants

In dit protocol wordt een in vitro kweek- en functionele analysemethode voor spierstamcellen beschreven, die de meeste van hun interacties met hun endogene niche behoudt.

Single Myofiber Culture Assay voor de beoordeling van volwassen spierstamcelfunctionaliteit Ex Vivo

Dit manuscript beschrijft een gedetailleerd protocol om arrays van 3D menselijke skeletspierenmicrotissues en minimaal invasieve downstream in situ assays van functie te produceren, inclusief contractiele kracht en calciumbehandelingsanalyses.

Beoordeling van functionele statistieken van de gezondheid van skeletspieren in microtissues van menselijke skeletspieren

Optische helderheid is een groot voordeel voor celbiologisch en fysiologisch werk bij zebravissen. Robuuste methoden voor het meten van celgroei bij individuele dieren worden beschreven die nieuwe inzichten mogelijk maken in hoe de groei van skeletspieren en naburige weefsels worden geïntegreerd met de groei van het hele lichaam.

Real-time en herhaalde meting van skeletspiergroei in individuele levende zebravissen die worden blootgesteld aan veranderde elektrische activiteit

Leer hoe je skeletspierweefsel genereert uit muizen-myoblast-voorlopercellen met behulp van hydrogel-ankerpunten en elektrische stimulatie. Deze methode ondersteunt regeneratieve geneeskunde en duurzame vleesproductie.

Techniek skeletspier weefsel van muizen myoblast progenitorcellen en toepassing van elektrische stimulatie

Meer video's verkennen