Name: Patch Clamp Opnamen in Binnen-oorhaar cellen geïsoleerd uit zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 43 s
Description: Leer patch clamp-opnamen in binnenoorhaarcellen van zebravis voor elektrofysiologisch onderzoek. Deze methode karakteriseert biophysische eigenschappen van voltage-afhankelijke kanalen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gefinancierd door de NSF (0854551).

1. Pre-experimentele Voorbereidingen <ol><li> Neem zes oplossingen (zie tabel 1 voor samenstelling): (a) 100 ml NZR (normale zebravis Ringer&#39;s), (b) 50 ml NZR + Tricaine (MS222), (c) 10 ml NZR + BSA, (d) 100 ml Locas (laag Ca 2 + oplossing), (e) 10 ml Locas + papaïne, (f) 100 ml K +-interne oplossing. Solutions (a), (b), (d) en (f) worden gedurende maximaal een maand bij 4 ° C. Solutions (c) en (e) worden bereid op de dag van het experiment. Alle oplossingen moeten op kamertemperatuur voordat experimenten. </li><li> Etiket en vul vier 35 mm Petrischalen ongeveer halverwege oplossingen (a), (c), (d) en (e). </li><li> Maak een dissectie gerecht door het invullen van een 60 mm petrischaal met Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) en vervolgens het snijden van een holte in het waarmee een vis om rechtop te zitten zonder kantelen. </li><li> Bereid ten minste twee celisolatie instrumenten door lijmen van de follikel einde van haren die het uiteinde van een glazenPasteur pipet met superlijm, waardoor het haar voorbij het einde van de pipet te verlengen met ongeveer 0,5 cm. De haren van zacht-behaarde honden zoals Labrador Retrievers en Weimaraners werken goed. </li></ol> 2. Isolatie van auditieve en vestibulaire Labyrinth <ol><li> Offer een volwassen zebravis door onderdompeling in een bekerglas met NZR + Tricaine. Visueel toezicht op de kieuwen totdat alle opercular bewegingen hebben opgehouden. Wacht een extra tien minuten voor het verwijderen van vis en spoelen met verse NZR. Deze procedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Pepperdine University, maar de vergunning moet worden verkregen van de eigen instelling. </li><li> Pin de vissen aan de rugzijde ontleden schotel door het inbrengen van een standaard naai rechte pen (ongeveer 2,5 cm lang) door elk oogkas en een derde pin door de dorsale-ventrale as ongeveer een derde tot de helft van de afstand van het hoofd tot staart zoals inFiguur 1A. </li><li> Onder een zoom (0.62-5x) stereo dissectiemicroscoop uitgerust met 10x oculairs, gebruik dan de lente schaar (Fine Science Tools catalogus nummer 15000-02) op de hersenen en een kort segment van het ruggenmerg bloot door het verwijderen van de schedel dak van een punt ongeveer 0,5 cm caudaal van het niveau van de kieuwen uit naar de neus van de vis. Snijd het ruggenmerg en til de hersenen met fijne pincet (Fine Science Tools catalogus nummer 11251 tot 30), terwijl het snijden van de spinale zenuwen en andere bijlagen, verwijder de hersenen en gooi (Figuur 1B). </li><li> De ventrale helft van de schedel capsule die overblijft vormt een &quot;kom&quot; die het binnenoor organen bevat. Let op de opvallende, witte, ondoorzichtige otolieten in de lagenas en sacculi symmetrisch gelegen aan het caudale einde van elke binnenoor en de zijdelings geplaatste utriculus otolieten meer rostraal (Figuren 1C en 4A). </li><li> Verwijder de kom van het bot door te snijden alle ventrale en laterale attachments terwijl voorzichtig op te tillen het uit het hoofd met fijne pincet. Plaats deze in de petrischaal met Locas (Figuren 1D en 4B). </li><li> Gebruik van twee paar fijne forceps, kraken elkaar de kom de middellijn door ofwel grijpen de zijranden van het bot los te trekken of als alternatief, het scheiden van de rechter en linker helften door inbrengen van de punten van de forceps in het centrum en breekijzer helften apart. Verwijder de twee labyrinten van het bot met fijne pincet (Figuur 2). </li><li> Controleer de labyrinten van de auditieve en vestibulaire eind-organen te identificeren: de halfcirkelvormige kanalen, utricles, sacculi en lagenas (Figuur 4C). De roze gebieden onder elke otoliet zijn de maculae met de haarcellen. Ook een strook roze in de ampoules de halfcirkelvormige kanalen worden de cupula waar de haarcellen bevinden. </li><li> Verwijder voorzichtig de otolieten van de lagena en utriculus met behulp van de fijne pincet ( <strong&gt; figuren 2 en 4C). Het is niet nodig de otoliet uit de sacculus omdat dit kan schade aan het zakvormige haarcellen. </li></ol> 3. Hair Cell Isolation <ol><li> Met een kunststof transferpipet (Fisher Scientific Catalogus nummer 13-711-9AM), de eindorganen naar het schaaltje met Locas + papaïne minimaliseren de hoeveelheid fluïdum overgebracht. </li><li> Incubeer deze structuren in deze oplossing gedurende dertig minuten bij kamertemperatuur. </li><li> Aan het einde van de incubatieperiode verplaats de structuren het schaaltje met NZR + BSA en incubeer in deze oplossing gedurende ten minste dertig minuten. Haarcellen zullen gezond te blijven in deze oplossing voor maximaal vier uur, maar zal verslechteren na 1-2 uur na isolatie (zie volgende stappen). </li><li> Ter voorbereiding van celisolatie, verplaatst u een van de eind-organen het schaaltje met NZR. </li><li> Voor de lagenas en utricles, gebruik dan een hond haar om voorzichtig tillen van de maculae-bladen van roze epitheliale tissue de haarcellen (Figuur 3A) bevat. De maculae kunnen worden uitgehold (met behulp van een hond haar) van onder de otolieten van de sacculi, en de cupulae van hun locaties in de ampullen van de halfcirkelvormige kanalen. </li><li> Met twee celisolatie hulpmiddelen bereid in stap 1.4, vermalen of een macula cupula een puingebied de haarcellen (Figuur 3B) bevat genereren. Laat de cellen ten minste vijf minuten op de bodem van de schaal te regelen voordat het. </li><li> Verplaats de schotel naar de fase van een omgekeerde microscoop uitgerust met fasecontrast optiek. Let cellen onder 40x vergroting en let op de diversiteit in morfologie. Veel cellen zijn avocado-vormig, terwijl anderen zijn lang en dun. De aanwezigheid van apicale haarbundels identificeert ze als haarcellen en fase-helderheid verzekert hun gezondheid. Microfoto van geïsoleerde haarcellen zijn weergegeven in figuur 5. </li></ol> 4. Patch Spannen zebravis haarcellen <ol><li> Ter voorbereiding van perfonominaal patch opnames 5,6, voor te bereiden amfotericine-bevattende interne oplossing als volgt: plaats 5 mg amfotericine B (Sigma A4888) in een 1,5 ml microcentrifugebuis en vul aan met 100 ul DMSO. Onmiddellijk vortex deze oplossing gedurende 10-20 seconden totdat alle amfotericine opgelost. Vervolgens pipet 625 pi K +-interne oplossing in een tweede microcentrifugebuis. Voeg 10 ul van de oplossing van het amfotericine K +-oplossing en interne vortex als hierboven. De voorraad amfotericine oplossing zal duren enkele uren, maar gooi de uiteindelijke oplossing na een uur. </li><li> Vervaardig patch pipetten van BF 150-86-10 borosilicaatglas (Sutter Instruments) met behulp van een multi-stage trekker (Sutter P-1000). Pipetten moeten tip diameters van ongeveer 2 um en MQ hebben weerstanden van 1-3 met de oplossingen in tabel 1. De instellingen op de trekker die goed werken zijn als volgt: Heat = Ramp minus10, Pull = 0, Velocity = 18, Delay = 1, Druk = 600. De vorm vande punt van een pipet goed blijkt uit de foto in de inzet van figuur 5 c. Blunt &quot;kogelvormige&quot; pipetten hebben de voorkeur want ze bieden de minste toegang weerstand tijdens elektrofysiologische opnamen. </li><li> Gebruik een 28 gauge Microfil injectienaald (MF28G-5; Wereld Precisie-instrumenten) om een registratie-elektrode halverwege vullen met het amfotericine-bevattende K +-interne oplossing. </li><li> Bevestig de elektrode met de headstage een patch clamp-versterker. Toepassing -10 mV, 10 ms spanning treden bij 10 Hz en onderhouden positieve druk in de elektrode wordt gemanoeuvreerd door de lucht / oplossing interface naar de onderkant van de opname schotel bij de cellen. </li><li> Orthogonaal Plaats de elektrode om een ​​gezond uitziende cel. Wanneer de elektrode dicht genoeg bij de cel zodat het begint weg van de uit-stromende oplossing snel herstellen van de druk van een lichte onderdruk op de elektrode tot de cel &quot;jumps&quot; erop. Onmiddellijk te staken zuigkracht op the elektrode en toepassen die potentiaal van -70 mV aan de binnenkant van de elektrode. Binnen een paar seconden een gigaohm zegel zal vormen. </li><li> Let op de capacitieve stroom transiënten bij het begin en einde van de spanning stappen die verschijnen snel na afdichting vorming. Blijf de perforatie van het membraan te controleren onder de elektrode door de amfotericine door te kijken naar de passanten groeien in omvang tot hun maximale grootte (in ongeveer tien minuten). </li><li> Om de oprichting van whole-cell (geperforeerd)-configuratie in een gezonde cel te bevestigen, te lokken naar buiten K + stromen door het toepassen van hyperpolariserende en depolariserende stappen van spanning. De meeste haarcellen hebben opvallende uiterlijke stromen (zie figuur 6). </li></ol> 5. Representatieve resultaten Figuur 4 toont beelden die tijdens de stappen van celisolatie. In paneel A kan de otolieten worden geassocieerd met het lagenas, saccluli en utricles te zien through de dunne laag van bot dat ligt over hen. Deze ondoorzichtige structuren bieden handige oriëntatiepunten om te helpen bij de veilige verwijdering van de eindorganen van het dier tijdens de volgende stappen van de dissectie. Paneel B toont de &quot;kom&quot; van het bot dat het intacte labyrinten en de prominente otolieten in de utricles, lagenas en sacculi bevat. Paneel C toont een labyrint dat is verwijderd uit het bot. Let op de grote otoliet met de geschulpte rand in de lagena, de ijspegel-vormige otoliet in de sacculus en de boonvormige otoliet in de utriculus. Sommige van de diversiteit in grootte en morfologie gezien in cellen geïsoleerd uit de lagena wordt geïllustreerd in figuur 5. Een gezonde cel wordt gemakkelijk geïdentificeerd als zijnde fase helder met een scherpe rand. Cell vormen kunnen grofweg worden verdeeld in twee klassen: avocado-vormige (avo) en lang en dun (THN), hoewel de grootte van de cellen binnen elke groep kan sterk variëren (vergelijk bijvoorbeeld avo 1 en avo 3). Inzet toont een cluster vandrie cellen die niet volledig geïsoleerd van elkaar. De zwarte kleur en korrelig uiterlijk van de cel in inzet b identificeert gemakkelijk deze cel dood. C inzet toont de punt van een pipet patch illustreert de vorm en afmetingen geschikt voor het opnemen van deze cellen. De huidige sporen figuur 6 werden verkregen in reactie op hyperpolariseren en depolariserende stappen van potentiële opgelegd aan lagena soortgelijke cel het avo 2 weergegeven in figuur 5. Huidige reacties in cellen van verschillende maten en vormen kunnen sterk verschillen suggereren diversiteit in het complement van voltage-gated kanalen. Figuren 1-3: Cartoons stappen illustreert de isolatie van haarcellen. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig1.jpg" /> Figuur 1. Verwijdering van de schedel capsule met het binnenoor labyrinten van zebravissen. A. Pin opgeofferd zebravis dorsale zijde tot ontleden schotel. B. Open schedel, te verwijderen en gooi hersenen. C. Let op otolieten in utricles, lagenas en sacculi. D. Verwijder ventrale deel van de schedel capsule, die de labyrinten. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig2.jpg" /> Figuur 2. Verwijdering van labyrinten van schedel capsule. A. Crack uit elkaar schedel capsule op zijn middellijn. B. Verwijder labyrinten van bot. C. Verwijder de otolieten van de lagenas en utricles behulp van een tang. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig3.jpg" /> Figuur 3. Isolatie van haarcellen van labyrinten. A. Til off maculae met een hond haar. B. Tritureer maculae met twee honden haren. C. Gebruik geïsoleerd haarcellen voor patch-clamp. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig4.jpg" /> Figuur 4. Images tijdens stappen isolatie van afzonderlijke cellen. A. Na verwijdering van de hersenen, de otolieten geassocieerd met de twee lagenas en sacculi (pijlen) en utricles (pijlpunten) kan worden gevisualiseerd. B. Na verwijdering van het ventrale gedeelte van de schedel capsule dat het binnenoor organen van het dier bevat. De cartoon in de rechter helft van B identificeert de locaties van de linker utriculus, lagena en sacculus. De stippellijn geeft de globale positie van de linker labyrint. C. Rechts labyrint (mediaal aanzicht) D: Cartoon tekening van de belangrijkste delen van labyrint in C. a: voorste semiRingvaart, b: horizontaal kanaal, c: het achterste kanaal, d: utriculaire otoliet, e: zakvormig otoliet, f: lagenal otoliet. Schaalbalk in D is 1 mm voor A en B, 0,5 mm voor C en D. <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig5.jpg" /> Figuur 5 Geïsoleerde, gezonde cellen van lagena illustreert de diversiteit van morfologie; avo:. Avocado gevormde cellen; thn: lange, dunne cellen. Inzet van een: cluster van drie onvolledig geïsoleerde cellen; inzet b: dode cel; inzet c: punt van patch elektrode gebruikt in elektrofysiologische opnamen van zebravissen haarcellen. Scale bar = 20 urn is van toepassing op de hoofdfiguur en alle inlegwerk. <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig6.jpg" /> Figuur 6. Stromingen opgenomen in een patch geklemde haar cel. Gemiddelde respons in een cel (t vergelijkbaaro avo 2 in figuur 5) drie presentaties van spanningsverschillen toegepast in 10 mV stappen van -140 mV tot +70 mV van een bedrijf potentiaal van -70 mV. Noteer de inactiverende stroom die verschijnt gedepolariseerd meer mogelijkheden. Spanningssprong magnitudes naast aantal sporen aangegeven.

<ol><li>Lewis, R. S., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+solitary+vertebrate+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Voltage- and ion-dependent conductances in solitary vertebrate hair cells.</a> Nature. 304, 538-5341 (1983).</li>
<li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> J. Physiol. 385, 207-242 (1987).</li>
<li>Sugihara, I., Furukawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+and+functional+aspects+of+two+different+types+of+hair+cells+in+the+goldfish+sacculus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Morphological and functional aspects of two different types of hair cells in the goldfish sacculus.</a> J. Neurophysiol. 62, 1330-1343 (1989).</li>
<li>Lee, S., Briklin, O., Hiel, H., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+inactivation+of+calcium+channels+in+cochlear+hair+cells+of+the+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent inactivation of calcium channels in cochlear hair cells of the chicken.</a> J. Physiol. 583, 909-922 (2007).</li>
<li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).</li>
<li>Rae, J. R., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+access+perforated+patch+recordings+using+amphotericin+B%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Meth%22%5BJournal%5D)">Low access perforated patch recordings using amphotericin B.</a> J. Neurosci. Meth. 37, 15-26 (1991).</li>
<li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Ca2%2B+entry+through+mechanosensitive+channels+localizes+the+site+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 92, 10297-10301 (1995).</li>
<li>Liang, J., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gross+and+fine+dissection+of+inner+ear+sensory+epithelia+in+adult+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gross and fine dissection of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish (Danio rerio).</a> J. Vis Exp. 27, e1211(2009).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li>
<li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+electrical+resonance+and+frequency+tuning+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog%2C+Rana+catesbeiana%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 275-297 (1988).</li>
<li>Parsons, T. D., Lenzi, D., Almer, W., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-triggered+exocytosis+in+an+isolated+presynaptic+cell%3A+capacitance+measurements+in+saccular+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Calcium-triggered exocytosis in an isolated presynaptic cell: capacitance measurements in saccular hair cells.</a> Neuron. 13, 875-883 (1994).</li>
<li>Kim, M. -H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2%2B+imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis Exp. 59, e3345(2012).</li>
<li>Housley, G. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+the+action+of+acetylcholine+on+isolated+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+R.+Soc.+Lond.+B%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of the action of acetylcholine on isolated outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 244, 161-167 (1991).</li>
<li>Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+hearing+and+balance+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of hearing and balance in zebrafish.</a> Ann. Rev. Genetics. 39, 9-22 (2005).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Zorgvuldige dissectie van de eindorganen en zachte behandeling van de cellen is cruciaal voor de succesvolle isolatie van gezonde, intacte en fysiologisch actieve haarcellen. Vasthouden aan de volgende tips zal ervoor zorgen succes: <ol><li> Het is gemakkelijker te verkrijgen gezonde cellen van kleinere vissen (2-2,5 cm in lengte). Grotere vissen hebben veel meer vet druppeltjes die obscure visualisatie tijdens de dissectie proces. </li><li> Zorg moet worden genomen bij het verwijderen van de otolieten, die de haarcellen liggen boven. Vermijd het aanraken van de cellen bij het grijpen van de otolieten met een pincet. </li><li> De beste resultaten worden verkregen wanneer de maculae en cupulae worden opgetild zoals lakens en de cellen van het epitheel getritureerd. </li><li> Wij vinden het gebruik van haren die cellen vermalen superieur aan andere methoden, waaronder met menselijke wimpers 7 die niet zo taps en minder flexibel. </li><li> Tijdens patch klemming toepassing van positieve druk thij elektrode als het door de lucht / oplossing interface belangrijk om de tip te reinigen. De vrijgave van de positieve druk naar de cel mogelijk te &quot;springen&quot; op de elektrode van belang. Deze methode verwijdert een klein volume van amfotericine-bevattende oplossing afstand van de tip, waardoor de kans op het vormen van een afdichting met gigaohm de cel. In onze experimenten met de geperforeerde patch opnametechniek plaats van de traditionele volledige cel configuratie vanwege de kwetsbaarheid van de cellen. Proberen &quot;go whole cell&quot; resulteert vaak in het verlies van de gigaohm afdichting. </li></ol> De methode die hier beschreven zal opleveren honderden gezonde haarcellen per dier. De techniek kan worden uitgevoerd bij kamertemperatuur en vereist geen speciale apparatuur dan een ontleedmicroscoop. Een eerdere rapport in Jove beschrijft de dissectie van het binnenoor in de zebravis met behulp van een ventrale benadering 8. Deze auteurs tonen de Dissectie van geheel paraformaldehyde gefixeerde binnenoor organen. We moedigen de lezer om deze video te bekijken voor de vergelijking met onze werkwijze. Een voordeel van de hier gepresenteerde methoden is het verkrijgen van levende cellen nuttig voor fysiologische onderzoeken. Naast het gebruik in patch clamp experimenten de voltage-gated kanalen bestuderen (zoals hier getoond) het gebruik van deze cellen kunnen worden uitgebreid naar cel resonantie 9,10, monitor neurotransmitter afgifte bestuderen door capaciteitsmetingen 11,12, onderzoeken neuromodulatie geïnduceerd door de activering van ligand gated kanalen 13 en boren in de schat aan informatie die kan worden afgeleid uit het gebruik mutanten die zowel gehoor en evenwicht 14 beïnvloeden.

<table border="1"><tbody><tr><td> Oplossing Naam </td><td> Recept </td></tr><tr><td> (A) NZR (normale zebravis Ringer&#39;s) (in mM) </td><td> 116 NaCl, 2 KCl, 2 CaCl2, 3 Glucose, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (B) NZR + Tricaine </td><td> NZR + 0,02% 3-aminobenzoëzuur ethylester methaan sulfonaat (Sigma A5040). </td></tr><tr><td> (C) NZR + BSA </td><td> NZR + 0,4% runderserumalbumine (Sigma A2153). </td></tr><tr><td> (D) Locas (Low Ca 2 + Solution) (in mM) </td><td> 100 NaCl, 2 KCl, 0,05 CaCl2, MgCl2 0,05, 3 Glucose, 30 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (E) Locas + papaïne </td><td> Locas + 0,05% L-cysteïne (Sigma C1276) + 0,2% papaïne (Sigma P3375). </td></tr><tr><td> (F) K +-interne oplossing (in mM) </td><td> 52 K 2 SO 4,38 KCl, 1 K +-EGTA, 5 K +-HEPES, pH 7,3. </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Solutions.

patch clamp opnamen in binnen-oorhaar cellen geïsoleerd uit zebravis

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses van de voltage-gated kanalen in sensorische haarcellen geïsoleerd uit verschillende species zijn eerder beschreven 1-4 maar video is de eerste toepassing van deze technieken om haarcellen van zebravis. Hier laten we zien een methode om gezond, intact haarcellen te isoleren van al het binnenoor eind-organen: sacculus, lagena, utriculus en halfcirkelvormige kanalen. Verder tonen we de diversiteit in haarcel grootte en morfologie en een voorbeeld van het soort patch clamp opnamen die kunnen worden verkregen. Het voordeel van het gebruik van dit zebravis modelsysteem dan andere voort uit de beschikbaarheid van zebravismutanten dat zowel gehoor en het evenwicht beïnvloeden. In combinatie met het gebruik van transgene lijnen en andere technieken die genetische analyse en manipulatie, de celisolatie en elektrofysiologische werkwijzen gebruiken geïntroduceerd moet hier meer inzicht in de rollen vergemakkelijken haarcellen plag in het bemiddelen van deze sensorische modaliteiten.

Het doel van deze video aan te tonen procedures voor het verkrijgen van gezonde, intacte haarcellen van het binnenoor organen van volwassen zebravissen en gebruik voor patch clamp studies gericht op het karakteriseren van de biofysische eigenschappen van de voltage-gated kanalen.

Patch Clamp Opnamen in Binnen-oorhaar cellen geïsoleerd uit zebravis

Patchclamp-analyses van de voltage-afhankelijke kanalen in sensorische haarcellen, geïsoleerd uit diverse soorten, zijn eerder beschreven1-4, maar deze ...

Het doel van deze procedure is het demonstreren van de methoden voor het verkrijgen van gezonde, intacte haarcellen uit de auditieve en vestibulaire eindorganen van volwassen zebravissen, zodat deze kunnen worden gebruikt in patch-clampmetingen. Studies die gericht zijn op het karakteriseren van de biofysische eigenschappen van hun spanningsafhankelijke kanalen. Dit wordt bereikt door eerst de hersenen uit de vis te verwijderen en vervolgens het ventrale gedeelte van de schedel te verwijderen waarin de labyrinten zich bevinden.De tweede stap is het openbreken van het botte kapsel om de labyrinten te isoleren die de eindorganen bevatten: de sacculus, het utriculus en de halve cirkelgangen. Vervolgens wordt een hondenhaar gebruikt om de epitheellaagjes die de haarcellen bevatten, van de eindorganen af te tillen. De laatste stap is het isoleren van individuele haarcellen door de epitheellaagjes met twee hondenharen te tricureren.Uiteindelijk kunnen patch-clamp metingen worden uitgevoerd op geïsoleerde haarcellen om de eigenschappen van spanningsafhankelijke kanalen te karakteriseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden is dat het aantoont hoe levensvatbare haarcellen kunnen worden verkregen uit het genetisch hanteerbare modelorganisme van de zebravis. Deze methode kan worden gebruikt om te helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen de auditieve en vestibulaire fysiologie, zoals die gericht zijn op het begrijpen van de mechanismen die de afgifte van neurotransmitters reguleren vanuit cellen die het gehoor en het evenwicht bemiddelen.Begin deze procedure door zes verschillende oplossingen te bereiden volgens het bijbehorende manuscript. Label vervolgens 4 Petri-schalen van 35 millimeter en vul deze ongeveer halfvol met de oplossingen die in het bijbehorende manuscript worden aangegeven. Bereid daarna een dissectieschaal door een visvormige holte te snijden in een Petri-schaal van 60 millimeter gevuld met uitgeharde sil guard.Dit voorkomt dat het dier tijdens de dissectie omkantelt. Bereid ten minste twee instrumenten voor celisolatie voor door het follikeluiteinde van een hondenhaar met secondelijm aan het uiteinde van een glazen pasta-pipet te lijmen, waarbij het haar ongeveer 0,5 centimeter voorbij het uiteinde van de pipet uitsteekt. Offer nu één volwassen zebravis op door deze onder te dompelen in een bekerglas met normale zebravis-ringers of NZR en trica.Houd de kieuwen visueel in de gaten totdat alle bewegingen van de auricula zijn gestopt. Wacht nog ten minste 10 minuten voordat de vis wordt verwijderd en wordt afgespoeld met verse NZR. Plaats de vis daarna met de rugzijde naar boven in de dissectieschaal.Steek één standaard naaispeld door elke oogkas en een derde speld door de dorsoventrale as. Ongeveer een derde tot de helft van de afstand van kop tot staart, onder een stereodissectiemicroscoop, wordt het brein en een kort segment van het ruggenmerg blootgelegd door het schedeldak te verwijderen vanaf een punt ongeveer 0,5 centimeter caudaal van het niveau van de kieuwen tot aan de neus van de vis met behulp van een veerschaartje. Snijd vervolgens het ruggenmerg door en til het brein op met de fijne pincet terwijl de zenuwen en andere aanhechtingen worden doorgeknipt.Verwijder daarna de hersenen en gooi deze weg. Het resterende ventrale deel van de schedelkapsel vormt een kom waarin de organen van het binnenoor zich bevinden. Observeer de prominente witte, ondoorzichtige OTA-otolieten in de legina en sculli, die symmetrisch aan het kwartereinde van elk binnenoor liggen, en de lateraal gepositioneerde utriculus-otolieten.Verdere telling. Deze structuren zijn nuttige oriëntatiepunten die helpen bij het intact verwijderen van het labyrint met een fijne pincet en veerschaar. Verwijder de botkom door alle ventrale en laterale aanhechtingen door te knippen terwijl u deze voorzichtig uit de kop tilt.Plaats het vervolgens in de Petrischaal met de calciumarme oplossing of low cas. Breekt de schedel open langs de middellijn en scheid de rechter- en linkerhelft door de punten van een fijne pincet in het midden te steken en de helften uit elkaar te wrikken. Verwijder daarna de twee labyrinten uit het bot.Inspecteer de labyrinten en identificeer de auditieve en vestibulaire eindorganen. De halve cirkelgangen, utriculus, sacculus en lagena. Verwijder voorzichtig de otolieten uit de lagena en utriculus met een fijne pincet.Overbreng in deze procedure de eindorganen naar de schaal met locas en propaan. Incubeer deze structuren gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur met behulp van een plastic transferpipet. Overbreng de structuren na afloop van de incubatieperiode naar de schaal met NZR en BSA en incubeer deze gedurende ten minste 30 minuten.Verdere voorbereiding voor de celisolatie. Breng een van de uiteindige organen, bijvoorbeeld de legina, over naar de schaal met NZR. Deze schaal wordt vervolgens op de tafel van een stereozoom-dissectiemicroscoop geplaatst.Gebruik een hondenhaar om de macula, het vlies van roze epitheelweefsel dat de haarcellen bevat, voorzichtig op te tillen. De cristae kunnen ook worden verwijderd uit het utriculus en het sacculus, en de endolymfatische zakken kunnen worden geïsoleerd van hun locaties binnen de semicirculaire kanalen. Gebruik twee van de eerder voorbereide instrumenten voor celisolatie om de macula te versnipperen zodat er een debrisveld ontstaat dat de haarcellen bevat.Laat de cellen ten minste vijf minuten bezinken op de bodem voordat u de schaal verplaatst. Plaats de schaal vervolgens op de tafel van een omgekeerde microscoop die is uitgerust met fasecontrastoptiek. Observeer de cellen onder een 40-voudige vergroting.Let op de diversiteit in celmorfologie. Sommige cellen zijn avocado-vormig, terwijl andere lang en dun zijn. De aanwezigheid van apicale haarbundels duidt op haarcellen en de helderheid in fasecontrast bevestigt hun vitaliteit.Voor geperforeerde patch-registraties bereidt u een oplossing met amfotericine door eerst vijf milligram amfotericine B in een centrifugebuis van 1,5 milliliter te plaatsen. Voeg vervolgens 100 microliter DMSO toe en vortex de buis onmiddellijk gedurende 10 tot 20 seconden totdat alle amfotericine is opgelost. Pipetteer daarna 625 microliter kaliumion-interne oplossing in een tweede microcentrifugebuis.Voeg vervolgens 10 µL van de amfotericine-oplossing toe aan de interne kaliumionenoplossing en vortex deze nogmaals gedurende 10 tot 20 seconden. Maak patchpipetten van filament bestaande uit borosilicaatglas capillaire buisjes. Met behulp van een multi-stage puller moeten de pipetten een tipdiameter van ongeveer twee micron hebben en een weerstand tussen één en drie megaohm.Stompe, kogelvormige pipetten hebben de voorkeur, omdat ze de minste toegangsweerstand bieden tijdens elektrofysiologische registraties. Gebruik daarna een microfill-spuitnaald van 28 gauge om een patchpipet voor de helft te vullen met de kaliumion-interne oplossing die amfotericine bevat. Bevestig deze pipet aan de headstage van een patchclamp-versterker om patchclamp-registraties mogelijk te maken.Breng eerst een positieve druk aan op de elektrode terwijl deze door de lucht-oplossingsinterface naar beneden wordt bewogen tot aan de bodem van de meetschaal, nabij de cellen. Positioneer de elektrode vervolgens loodrecht ten opzichte van een gezond uitziende cel. Wanneer de elektrode dichtbij genoeg is zodat de cel begint weg te bewegen van de uitstromende oplossing, keer dan snel de druk om om een licht vacuüm in de elektrode te creëren totdat de cel erop springt.Stop onmiddellijk de zuigkracht op de elektrode om de vorming van een giga-ohm seal met de cel mogelijk te maken. Pas herhaalde hyperpolariserende voltagesprongen van 10 millivolts toe op de elektrode en observeer de capacitatieve stroomtransiënt. Blijf de door amfotericine geïnduceerde membraanperforaties monitoren terwijl de grootte van de transiënt toeneemt tot het maximum.Om de vestiging van de geperforeerde patch-configuratie in een gezonde cel te bevestigen, worden spanningsafhankelijke stromen opgewekt door hyperpolariserende en depolariserende potentiaalstappen toe te passen. De meeste haarcellen hebben prominente uitwaartse stromen die snel inactiveren tijdens aanhoudende depolarisatie. Deze figuur toont het ventrale deel van de schedel na verwijdering van de hersenen.De otolieten geassocieerd met de tulo, genus en sculli, evenals die geassocieerd met de twee utriculi, zijn zichtbaar door het dunne bot dat eroverheen ligt nadat de botkom is verwijderd. De aanwezigheid van de otolieten helpt bij het identificeren van de locatie van de labyrinten. De stippellijn in de illustratie geeft de geschatte omtrek van het linker labyrint aan.Wanneer het labyrint is geïsoleerd, kunnen de auditieve en vestibulaire eindorganen worden geïdentificeerd, zoals het s, legina, utriculus en de semicirculaire kanalen. De illustratie toont de locatie van deze structuren: A, B en C zijn de semicirculaire kanalen. D is de utriculus, E is het s en f is de lega.De diversiteit in de morfologie van haarcellen is duidelijk zichtbaar in deze figuur van cellen geïsoleerd uit de lega. De cellen vallen grofweg uiteen in twee klassen: dunne cellen of cellen in de vorm van een avocado. Gezonde cellen zijn in contrast hiermee fase-helder, met scherpe contouren en duidelijke haarbundels.Dode cellen, hier getoond in inzet B, hebben een granulaire zwarte verschijning. Deze figuur toont de gemiddelde responsen in een cel op drie presentaties van spanningsstappen, toegepast in stappen van 10 millivolt van minus 140 millivolt tot plus 70 millivolt met een rustpotentiaal van minus 70 millivolt. Merk op dat de inactiverende stroom verschijnt bij meer gedepolariseerde potentialen.Zodra de techniek onder de knie is, kunnen electrofysiologische registraties worden uitgevoerd al vanaf 90 minuten na het begin van de procedure. Bovendien kunnen, indien de tri-stap wordt uitgesteld en de eindorganen in een geschikte BS-oplossing worden bewaard, gezonde cellen worden verkregen tot vier uur na het begin van de dissectie. Deze preparatie, in combinatie met veelvoorkomende genetische mutaties bij zebravis, biedt een uniek modelsysteem om de moleculaire factoren te onderzoeken die ten grond liggen aan de mechanismen van gehoorstoornissen.

patch-clamp-recordings-in-inner-ear-hair-cells-isolated-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Larvale zebravis vormen de eerste gewervelde modelsysteem om gelijktijdig patch clamp opnamen toestaan ​​van een spinale motor-neuron en target skeletspieren. Deze video toont de microscopische methoden die worden gebruikt om een ​​segmentale CaP motor-neuron en doel spiercellen, alsook de methodologieën voor het opnemen van elk celtype te identificeren.

Gepaarde Patch Clamp Recordings van Motor-neuron en Target Skeletal Muscle in de zebravis

Whole-cell patch-clamp opnamen van auditieve zenuw vezel dendrieten in de binnenste haarcel lint synaps in het zoogdier slakkenhuis.

Postsynaptische Recordings op Afferente Dendrieten Contact opnemen met Cochlear binnenste haarcellen: Monitoring multivesiculaire release op een lint Synapse

Dit protocol beschrijft een techniek genaamd whole-cell patch clamp electrophysiology, een methode om elektrische eigenschappen van Mauthner neuronen en andere reticulospinale cellen in zebravisembryo's te bestuderen.

Whole-Cell Patch Clamp Electrophysiology: een methode om elektrische eigenschappen van neuronen te bestuderen

This video demonstrates the recording of electrical signals from the afferent neurons in a paralyzed zebrafish larva by positioning a micropipette near the lateral line ganglion and forming a loose seal for signal capture. The extracellular solution maintains neuronal viability during this process.

Monitoring Electrical Signals from the Afferent Neurons in an Immobilized Zebrafish Larva

This video demonstrates the patch-clamp technique for measuring ionic currents in inner ear sensory neuron cell bodies. It details the preparation and use of a polished patch-clamp pipette filled with an internal solution containing amphotericin B, which perforates the membrane to allow ion movement while preserving intracellular conditions. Voltage pulses are applied to trigger and record ion channel activity, providing insights into their properties and behavior.

Perforated Patch-Clamp Recordings of Inner Ear Sensory Neuron Cell Bodies

Source: Lukasz, D., et al. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates live imaging of calcium influx in the lateral-line hair cells of a paralyzed transgenic zebrafish larva using a confocal microscope. Mechanical stimulation of hair bundles via fluid pulses induces calcium entry through mechanotransduction channels and voltage-gated channels, which is visualized in real-time using fluorescence indicators. The method...

Imaging Calcium Dynamics in Lateral-Line Hair Cells of Larval Zebrafish

Een eenvoudige methode om extracellulaire veldpotentialen opnemen in het larvale zebravis voorhersenen beschreven. De methode omvat een...

Voorhersenen Elektrofysiologische Opname in larvale zebravis

We hebben een intacte hersenen ruggenmerg voorbereiding voor het vastleggen en bewaken elektrische activiteit via patch clamp opname van de Mauthner neuronen en andere reticulospinal cellen in de zebravis embryo's ontwikkeld. Zo zijn wij in staat om prikkelende en remmende synaptische stromen, voltage-gated kanaal activiteit en actiepotentialen opnemen van belangrijke neuronen in een zich ontwikkelende embryo.

Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells

Dit manuscript beschrijft werkwijzen voor elektrofysiologische opnames van spinale neuronen van zebravis embryo's en larven. Het preparaat handhaaft neuronen in situ en vaak gaat om minimale dissectie. Deze werkwijzen maken het elektrofysiologisch onderzoek van verschillende spinale neuronen van de initiële elektrische prikkelbaarheid overname door de vroege larvale stadia.

zebravis<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Voorbereiding voor elektrofysiologische registraties van Spinal sensorische en motorische neuronen

Dit protocol wordt beschreven methoden om vast te leggen van de auditieve brainstem response van postnatale rat pups. Om te onderzoeken de functionele ontwikkeling van buitenste haarcellen, is de experimentele procedure van geheel-cel patch klem opnemen in geïsoleerde buitenste haarcellen stapsgewijze beschreven.

Auditieve Brainstem Response en buitenste Haarcel geheel-cel Patch klem opname bij postnatale ratten

De zebravis is een modelsysteem dat heeft veel waardevolle eigenschappen met inbegrip van optische helderheid, snelle externe ontwikkeling, en, met name van belang op het gebied van gehoor en evenwicht extern gelegen zintuiglijke haarcellen. Dit artikel schetst hoe transgene zebrafish kan worden gebruikt voor de gehaltebepaling van zowel de Haarcel mechanosensation en de presynaptische functie in toto.

In Vivo Calcium beeldvorming van dwarslijn haarcellen in larvale zebravis

Leer patch clamp-opnamen in binnenoorhaarcellen van zebravis voor elektrofysiologisch onderzoek. Deze methode karakteriseert biophysische eigenschappen van voltage-afhankelijke kanalen.

Patch Clamp Opnamen in Binnen-oorhaar cellen geïsoleerd uit zebravis

Meer video's verkennen