Name: Kwantitatieve analyse van chromatine proteomen in de ziekte van (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-28T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Leer chromatine-eiwitisolatie uit muizenhartweefsel voor cardiovasculair onderzoek met sucrose-dichtheidsgradiënt en kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode onthult nucleaire proteoomdynamiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De Vondriska lab wordt ondersteund door subsidies van de National Heart, Lung and Blood Institute van de NIH en de Laubisch Endowment aan de UCLA. EM is ontvanger van de Jennifer S. Buchwald Graduate Fellowship voor de Fysiologie aan de UCLA, HC is de ontvanger van een American Heart Association Pre-doctorale beurs, MP is de ontvanger van een NIH Ruth Kirschstein post-doctorale beurs, en SF is de ontvanger van een NIH K99 Award.

De experimentele workflow bevat zeven belangrijke stappen (Figuur 1). Voor alle werkzaamheden waarbij monsters die zullen worden uitgevoerd op de massaspectrometer, moet er worden dragen een laboratoriumjas, handschoenen en haarnetje en zorg om besmetting tegen stof en persoonlijke vergieten van keratine te voorkomen. 1. Hart Homogenisatie en nucleaire Isolatie Muis harten gehomogeniseerd en een intacte kernen pellet wordt geïsoleerd (Figuur 2). <ol><li> Sacrifice volwassen muis, accijnzen het hart, spoel in ijskoud PBS, en homogeniseren op ijs in glas dounce (wij geven de voorkeur aan Wheaton Tissue Grinder van Fisher, # 08-414-13A, maar andere methoden kunnen even goed werken) met 2 ml lysebuffer (een hypotone oplossing die differentieel het celmembraan lyseert de organellen zoals de nucleus) (10 mM Tris pH 7,5, 15 mM NaCl en 0,15% v / v Nonidet P-40 [NP-40] in gedeïoniseerd water plus protease en fosfatase inhibitor mengsel: 10 mM natriumbutyraat, 0,1 mM fenylmethylsulfonylfluoride [PMSF], 0,2 mM Na 3 VO 4, 0,1 mM NaF en 1 ml Roche protease pellet/10 - lysis buffer kan worden opgeslagen gedurende een week bij -20 ° C ). (Let op: Wij vinden het niet nodig om de harten perfuseren met PBS, als onze massaspectrometrie data en GO-analyse identificeren van de eiwitten als overwegend cardiomyocyten [p-waarde 3.8E-22] in oorsprong, in tegenstelling tot besmet bloed [p-waarde 5,0 E-2].) </li><li> Pour lysaat door 100 um zeef en verzameld doorstroming in 1,5 ml centrifugebuis. Op dit punt, tenzij anders vermeld, moet monster op ijs gehouden. </li><li> Centrifugeer bij 4.000 tpm gedurende 5 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder supernatant. (Dit is het cytosol, en worden opgeslagen bij -80 ° C. Het bevat het gelyseerde mitochondria.) Hersuspendeer pellet in 200 ul lysis buffer door fijnwrijven. (Dit is de primitief nucleair pellet.) </li><li> Vul 1,5 ml centrifugebuis met 1 ml van sucrose buffer (24% sucrose gewicht / volume, 10 mM Tris pH 7,5 en 15 mM NaCl in gedeïoniseerd water met protease / fosfatase-inhibitor mengsel - sucrose buffer moet worden vers op de dag van gebruik). Voorzichtig laag de geresuspendeerde pellet bovenop de sucrose pad en centrifugeer bij 5000 rpm gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder de dunne film geplaatst en de sucrose pad (welke membraan). Spoel de resterende pellet met 200 ul ijskoude PBS / EDTA (1x PBS met 1 mM EDTA). (Dit is de kern pellet en kunnen oplosbaar of vastgesteld voor gebruik in western blotting of elektronenmicroscopie [Zie stappen 4.1 en 4.2] tot verrijking kwantificeren.) </li></ol> 2. Nucleoplasma en Wasmiddel geëxtraheerd Chromatine Fractionering Het ruwe kernen pellet wordt gescheiden in een nucleoplasma en detergent geëxtraheerd chromatine fractie, bevattende eiwitten los geassocieerd met de DNA. <ol><li> Tritureer pellet vanaf stap 1.6 in 200 ul detergent extractiebuffer (20 mM HEPES pH 7,6, 7,5 mM MgCl2. 0,2 mM EDTA, 30 mM NaCl, 1 M ureum, 1% NP-40 in gedeïoniseerd water met protease / fosfatase-inhibitor mengsel - detergensextractie buffer kan worden opgeslagen gedurende een week bij -20 ° C). </li><li> Vortex monster 2 keer, 10 sec per stuk. Op ijs 10 min. </li><li> Centrifugeer bij 13.000 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C. </li><li> Verwijder supernatant. (Dit is het nucleoplasma en moeten worden bewaard bij -80 ° C). Spoel pellet met ijskoude PBS / EDTA. (Dit is de chromatine pellet.) </li><li> Tritureer pellet in 300 pl Tris, SDS, EDTA buffer (50 mM Tris pH 7,4, 10 mM EDTA, 1% SDS in gedeïoniseerd water met protease / fosfatase-inhibitor mengsel - Tris, SDS, EDTA buffer kan gedurende maximaal een week -20 ° C). </li><li> Sonificeer 3-6 keer gedurende 10 seconden elke te breken DNA. Houd monster op ijs tussen sonications. </li><li> Centrifugeer bij 13.000 rpm gedurende 5 min bij 4 ° C. Houd het supernatant. (Supernatant is het wasmiddel-geëxtraheerde chromatine eiwit fractioneringsstabilisatien en worden bewaard bij -80 ° C). De resterende pellet moeten klein en kunnen worden weggegooid. </li><li> Bij gebruik van geïsoleerde myocyten in plaats van het gehele hart isoleren neonatale rat ventriculaire myocyten van ratten een dag na de geboorte met enzymatische digestie, gevolgd door kweek in Dulbecco gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal bovine serum (FBS), 1% insuline -transferrine-natriumseleniet (ITS) en 1% penicilline. Na 24 uur overbrengen naar serumvrij medium (zelfde als hierboven, maar zonder FBS). Oogst cellen in lysis buffer (1,1 in), en beginnen nucleaire fractionering bij stap 1.3. </li></ol> 3. Acid-extractie Fractionering - DNA-gebonden eiwit Verrijking Een aparte fractionering verrijkt voor eiwitten stevig gebonden aan het DNA, waaronder histonen. <ol><li> Herhaal de stappen 1,1-2,4. </li><li> Tritureer de chromatine pellet in 400 pl van 0,4 N zwavelzuur. Vortex om klonten te verwijderen. </li><li> Incubeer bij 4 ° C gedurende 30 min of overnight tijdens het roteren. </li><li> Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C nucleaire afval te verwijderen. </li><li> Breng supernatant naar een nieuwe buis. </li><li> Voeg 132 ul van trichloorazijnzuur druppelsgewijs aan de supernatant. Omkeren meerdere malen. Incubeer op ijs gedurende 30 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Gooi supernatant. Spoel pellet met ijskoude aceton. (Dit is de histone pellet.) </li><li> Centrifugeer bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. </li><li> Herhaal wassen, stappen 3,8-3,9. </li><li> Lucht drogen pellet. </li><li> Resuspendeer de pellet in 100 pl Tris, SDS, EDTA buffer. Stel pH tot 8 door toevoeging van 1 M Tris. (Gebruik een 1 M Tris voorraad die niet is pH-aangepast.) </li><li> Ultrasone trillingen in een waterbad gedurende 15 minuten. Voorkom oververhitting door het toevoegen van ijs waterbad. (Dit is het zuur geëxtraheerde fractie en moeten worden bewaard bij -80 ° C.) </li></ol> 4. Zuiverheid Controleer Western blots en elektronenmicroscopiebevestigen succesvolle verrijking van kernen en uitputting van andere organellen. Om typische resultaten voor alle volgende kwaliteitscontrole testen zie, zie onze eerdere publicatie 18. <ol><li> Western blot-analyse uitvoeren. Probe membraan dat elke fractie voor histon H2A en nucleoporin p62 (zo nucleaire markers voor verrijking controleren), en adenine nucleotide transporter, BiP en tubuline (als mitochondriale marker, endoplasmatisch reticulum marker en cytoskelet marker respectievelijk zuiverheid te controleren). Om succesvol te subfractionation van de kernen, sonde controleert voor histon H3 of fibrillarin (reinigingsmiddel en zuur geëxtraheerde chromatine en intacte kernen) en SNRP70 of E2F (nucleoplasma). Probe voor retinoblastoom of hypoxia induceerbare factor-1 (verrijkt in detergent geëxtraheerd chromatine meer zuur geëxtraheerde fractie). Extra steekproeven voor controles van HeLa-cellysaat en hele hart lysaat kan ook worden uitgevoerd in dezelfde gel: Bereid HeLa cel lysaat controle door het toevoegen van Tris, SDS, EDTA buffer om de cultuur schotel en het gebruik van een cel schraper om te proeven verzamelen. Sonificeer en centrifugeer steekproef als in stappen 2,6-2.7. Bereid gehele hart lysaat controle door homogeniseren van het hart in 2 ml buffer (20 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1% triton X-100, 2,5 mM natriumpyrofosfaat, 1 mM glycerofosfaat in gedeïoniseerd water met protease en fosfatase-inhibitor mengsel). Sonificeer en centrifugeer als in stappen 2,6-2,7. Zie stap 5 voor het bereiden eiwitmonsters voor SDS-PAGE. </li><li> Elektronenmicroscopie: Resuspendeer de kernen pellet uit stap 1.6 in lysis-buffer met 2% gluteraldehyde en monster bij 4 vaststellen ° C. Spoel monsters in osmic zuur, gedehydreerd, en in te bedden in epoxyhars. Cut 70 nm plakken met een Reichert Ultracut ultramicrotoom. Stain monsters in uranylacetaat en dan lood en beeld met behulp van een JEOL 100CX Transmission Electron Microscope. Kwantificeren verrijking door meten van het oppervlak van intacte kernen versus oppervlakte materiaal afgebeeld. We vinden 60-80% van kernen naarintact zijn. 14 </li></ol> Belangrijke overwegingen voor het verrijken versus zuiveren kernen. Dit protocol werd ontwikkeld om proteoomanalyse van cardiale chromatine toestaat voor de bestudering van globale genregulatie processen bij ziekte. Een belangrijk onderdeel van het ontwerpen van geheel-proteoom massaspectrometrie-experimenten is de kwestie van dynamisch bereik en het kunnen identificeren en karakteriseren van lage-overvloed eiwitten. Naast het primaire doel van het verstrekken van informatie over nucleaire en chromatine-specifieke biologie, verrijkend voor de nucleaire proteoom, verhoogt de waarschijnlijkheid van het opsporen van deze low-overvloed eiwitten, net als verdere subfractionation van de kernen. Zoals besproken, de volwassen cardiomyocyten een dichte cytoskelet component aangesloten op de kernmembraan. Wij geloven niet dat we volledig hebben de kernen van deze andere cellulaire componenten gezuiverd. Echter door verrijking alleen de kernen, krijgen weed een aanvaardbare drempel van het soort analyses mogelijk beschreven. Specifiek hebben we EM de zuiverheid van onze grove kernen pellet beoordelen en vond 60-80% van de breuk intacte kernen, mitochondria ongeveer 10%, en de rest puin. Daarnaast hebben we weten uit onze vorige studie over de intacte kernen bevolking, terwijl veel myofilamenten niet verrijkt met dit protocol (inclusief tubuline en actine zoals gemeten door Western) bepaalde eiwitten (calsarcin-1) zijn verrijkt suggereert een echte biologische populatie deze eiwitten in de cardiale kernen 19. Bovendien hebben we de eiwitten die we gevonden dat in de zuur geëxtraheerde fractie chromatine, het voorspelde rollen van deze eiwitten door gen ontologie. Belangrijk is dat dit gen ontologie analyse geen rekening gehouden met de relatieve hoeveelheden van de verschillende eiwitten (evenals onze Western blot data) maar telt alle geïdentificeerde eiwitten (verrijkened of niet) als gelijkwaardige bij het vaststellen van gemeenschappelijke paden en cellulaire compartimenten. Analyse van deze routes en cellulaire compartimenten kan worden gevonden in onze eerdere publicaties. 18,20 Het belangrijkste is dat het succes van de verrijking in het zuur-geëxtraheerde chromatine fractie liet ons toe om de aanwezigheid van 54 histon-varianten in de volwassen muis myocyte, 18 te identificeren waarvan vele zich op een unieke peptide voor identificatie, en dus zou waarschijnlijk niet zijn aantoonbaar zonder deze verrijking protocol gezien de enorme complexiteit van de totale cardiomyocyt proteoom. Van 1.048 eiwitten identificeerden we de cardiale kernen, 56 van hen (5,3%) werden geannoteerd door GO analyse van het nucleosoom (een component van de kern plaats) zijn. Een onderzoek naar het gehele hart geïdentificeerd 6.180 eiwitten, waarvan slechts 11 eiwitten (0,18%) werden geannoteerd deel van het nucleosoom 21 worden. Dit illustreert verder de kracht van onze protocol meaningfully verrijken voor nucleaire eiwitten. 5. Eiwit Gel en Enzymatische Protein Digest Eiwitten worden gescheiden door eendimensionale SDS-PAGE en trypsine geknipt worden uitgevoerd op de massaspectrometer. <ol><li> Ontdooien monsters op ijs en eiwitconcentratie te bepalen voor elk monster met de bicinchoninic zuur (BCA) eiwitbepaling. </li><li> Verdun monsters met een bekende concentratie met 5x Laemmli buffer, koken gedurende 10 minuten en bij -20 ° C voor eendimensionale SDS-PAGE. Verdun monsters met een bekende concentratie ureum extractiebuffer en bij -20 ° C voor tweedimensionale gels. </li><li> Run gel keuze laden gelijke hoeveelheid eiwit in elke baan. Eiwit kan worden overgebracht naar een nitrocellulose membraan worden gebruikt voor Western blotting (zoals met controles in stap 4,1) of banden worden gesneden voor massaspectrometrische analyse, zie volgende stappen. </li><li> Verwijder gel van apparatuur met behulp van gedeïoniseerd water over te dragen aan een schone container.Cover gel in Oriole vlek, en wikkel de verpakking in aluminiumfolie om licht te blokkeren. Toestaan ​​gel bij kamertemperatuur op een schudinrichting geïncubeerd ten minste 90 minuten. </li><li> Afbeelding Oriole-gekleurde gel (figuur 3) met behulp van UV-licht, en teken waar bands zullen worden gesneden op de afbeelding. We snijden elke baan in ongeveer 25 2-mm banden voor studies meten van de totale proteoom. </li><li> Plaats gel op een schone ondergrond. Gebruik alleen materialen die zijn gehouden verzegelde of worden bespoten met ethanol om keratine besmetting te voorkomen. Knip de band, en dan verder te snijden in 3 gelijke stukken. Leg alle drie de stukken van elke band in zijn eigen label 1,5 ml buis. Gel stukken kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C enkele maanden. </li><li> Bereid gel pluggen voor enzymatische vertering. Digest gel stukken met trypsine bij 37 ° C geroerd. Voor gedetailleerde gelmonster protocol zie onze vorige publicatie. 22 U kunt een laag molecuulgewicht bands verteren met chymotrypsine in plaats van trypsine,uitgebreide splitsing trypsine van histone staarten elimineren. </li></ol> 6. Massaspectrometrie en data-analyse Monsters worden gescheiden op een LC en geanalyseerd door MS / MS. De spectra worden doorzocht tegen een eiwit database voor eiwitidentificatie. <ol><li> Run 10 pi van elk monster door LC / MS / MS. We gebruiken een nano-flow Eskigent LC met een 75 urn omgekeerde fasekolom. Gebruik een LC run geoptimaliseerd voor verschillende eiwitten en peptiden. Gebruik van een lineaire gradiënt van mobiele fase A (0,1% mierenzuur, 2% acetonitril [ACN] in water) mobiele fase B (0,1% mierenzuur, 20% water in ACN): 60 min van 5% mobiele fase B tot 50 % B en 15 min van 50% B tot 95% B en tenslotte 10 min bij een constante 95% B. Gebruik een stroomsnelheid van 200 nl / min. Acquire massaspectrometrie gegevens in een data-afhankelijke functie. We maken gebruik van een Thermo Orbitrap dat de top 6 meest voorkomende ouder ionen fragmenten. </li><li> Herhaal loopt gedurende ten minste drie biologische en twee technische repliceert. (RANBEVOLEN) </li><li> Gebruik software (in de handel beschikbare opties zijn BioWorks en Xcalibur;! Publiekelijk beschikbare opties zijn jacht, X Tandem, SpectraST) om spectra zoeken tegen de Uniprot database van keuze via een zoekalgoritme (zoals Sequest of MASCOT). </li><li> Overwegen om zoekparameters mogelijk te maken cysteïne en methionine carbamidomethylation oxidatie, twee gemeenschappelijke aanpassingen gemaakt tijdens de monster verwerking. </li><li> Bereken een valse meldingen met behulp van omgekeerde database zoeken. </li><li> Filter eiwitidentificaties dat alleen voor wedstrijden van een drempel vertrouwen. Wij adviseren de volgende parameters om mee te beginnen: Xcorr&gt; 3 (+2),&gt; 4 (+3),&gt; 5 (+4); deltaCN&gt; 0,1, consensus score ≥ 20, massa tolerantie 2 Da voor ouder ion, massa tolerantie van 0,5 Da voor ion product ten minste 2 unieke peptiden per eiwit en niet meer dan 3 gemiste splitsingen. </li></ol> 7. Label-free Kwantificering Determine de relatieve overvloed van eiwitten met label vrije kwantificering (Figuur 4). <ol><li> Een aantal software programma&#39;s zijn openbaar of commercieel beschikbaar voor label-free kwantificering van massaspectrometrie gegevens, inclusief Census (Prof. Yates &#39;groep), 23 Elucidator (Microsoft), 24 ZEEF (Thermo Scientific), 25 Steiger (Proteome Software) 26. Deze programma&#39;s beogen de massaspectrometrische signaal intact peptiden of het aantal gebeurtenissen met peptidesequentiebepaling relatieve hoeveelheden eiwit tussen twee of meer staten correleren. </li><li> Terwijl elk programma een soortgelijke analyse pijpleiding, worden sommige programma beperkt tot de soorten specifieke analyse die kan worden uitgevoerd op de data. Aanvankelijk gegevens van verschillende runs uitgelijnd wordt signaalintensiteit genormaliseerd en peptide pieken zijn geselecteerd voor analyse. </li><li> De twee meest voorkomende werkwijzen zijn gebaseerd op kwantificering spectrale tellen of LC-MS piekgebied. Overvloedverhoudingen worden berekend veranderingen in overvloed peptide tussen verschillende groepen te bepalen. </li><li> Deze programma&#39;s kunnen gekoppeld worden aan proteomische zoekalgoritmen (Mascot, Sequest, X! Tandem) voor kwantificering informatie te correleren met eiwit identificatie. </li><li> Om de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de gegevens te garanderen is het belangrijk om zowel biologische (verschillende experimentele monsters) en technische (het uitvoeren van de hetzelfde monster op de massaspectrometer meerdere keren) op te nemen replica van de massa spec gegevens. </li><li> Variatie van peptide in overvloed en tussen experimentele omstandigheden worden beoordeeld door ANOVA en uitgezet via PCA (Figuur 5). </li></ol> Belangrijke overwegingen voor label-free kwantificatie. Bij het ​​uitvoeren van label-free kwantificatie, moet specifieke aandacht worden besteed aan de consistente monstervoorbereiding, de spijsvertering tijd en LC-MS/MS voorwaarden waarborgen elk monster moeten worden verwerkt en afzonderlijk geanalyseerd. In tegenstelling tot ontmoetteabolic etikettering benaderingen, vergelijkingen in label-free experimenten worden gedaan op de gegevens van verschillende massaspectrometrie loopt (vanwege het ontbreken van etikettering voorkomt de mogelijkheid van het runnen van hen samen), waardoor noodzakelijk hoge reproduceerbaarheid in alle aspecten van het monster analyse (dwz van het monster prep, LC en MS stappen) en het gebruik van hoge massa nauwkeurigheid massaspectrometers. Om rekening te houden lichte veranderingen in monstervoorbereiding en analyse een bekende standaard worden toegevoegd aan elk monster om te helpen bij normalisatie van data. Bovendien, de meeste software programma&#39;s kunt normalisering van de signaal intensiteit (bijvoorbeeld door het aanpassen van voor achtergrondgeluiden of een bekende overvloedige analyt) na data-acquisitie om rekening te houden met verschillen in injectie, ionisatie en fragmentatie. Uitlijningsalgoritmen bestaan ​​in de meeste van de hierboven genoemde software die helpen bij het corrigeren verschillen in peptide elutieprofielen. Het gebruik van biologische en technische repliceert is essentieel in dit soort onderzoek, omdat hiermee statistische analyses om te bevestigen de reproduceerbaarheid en consistentie van alle waargenomen veranderingen in eiwit overvloed.

<ol><li>Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+transition+of+cardiac+myocytes+from+hyperplasia+to+hypertrophy+during+postnatal+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development.</a> J Mol Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).</li>
<li>Rumyantsev, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelations+of+the+proliferation+and+differentiation+processes+during+cardiact+myogenesis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Rev.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Interrelations of the proliferation and differentiation processes during cardiact myogenesis and regeneration.</a> Int Rev. Cytol. 51, 186-273 (1977).</li>
<li>Olson, E. N., Schneider, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+up+the+heart%3A+development+redux+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Sizing up the heart: development redux in disease.</a> Genes Dev. 17, 1937-1956 (2003).</li>
<li>Molkentin, J. D., Dorn, G. W. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+signaling+pathways+that+regulate+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic signaling pathways that regulate cardiac hypertrophy.</a> Annu Rev. Physiol. 63, 391-426 (2001).</li>
<li>Fishman, M. C., Chien, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fashioning+the+vertebrate+heart%3A+earliest+embryonic+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fashioning the vertebrate heart: earliest embryonic decisions.</a> Development. 124, 2099-2117 (1997).</li>
<li>Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Return+to+the+fetal+gene+program+protects+the+stressed+heart%3A+a+strong+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Fail+Rev%22%5BJournal%5D)">Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis.</a> Heart Fail Rev. 12, 331-343 (2007).</li>
<li>Roger, V. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+disease+and+stroke+statistics--2011+update%3A+a+report+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association.</a> Circulation. 123, e18-e209 (2011).</li>
<li>Schirmer, E. C., Florens, L., Guan, T., Yates, J. R. 3rd, Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+membrane+proteins+with+potential+disease+links+found+by+subtractive+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Nuclear membrane proteins with potential disease links found by subtractive proteomics.</a> Science. 301, 1380-1382 (2003).</li>
<li>Lambert, J. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+proteomics+approach+for+the+discovery+of+chromatin-associated+protein+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel proteomics approach for the discovery of chromatin-associated protein networks.</a> Mol. Cell Proteomics. 8, 870-882 (2009).</li>
<li>Malik, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-specific+and+lamin-dependent+targeting+of+novel+transmembrane+proteins+in+the+nuclear+envelope%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Cell-specific and lamin-dependent targeting of novel transmembrane proteins in the nuclear envelope.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 1353-1369 (2010).</li>
<li>Tweedie-Cullen, R. Y., Reck, J. M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+mapping+of+post-translational+modifications+on+synaptic%2C+nuclear%2C+and+histone+proteins+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Comprehensive mapping of post-translational modifications on synaptic, nuclear, and histone proteins in the adult mouse brain.</a> J. Proteome Res. 8, 4966-4982 (2009).</li>
<li>Chu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chromatin+proteomics+identifies+evolutionarily+conserved+fertility+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Sperm chromatin proteomics identifies evolutionarily conserved fertility factors.</a> Nature. 443, 101-105 (2006).</li>
<li>Uchiyama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome+analysis+of+human+metaphase+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Proteome analysis of human metaphase chromosomes.</a> J. Biol. Chem. 280, 16994-17004 (2005).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+compartments+of+cardiac+nuclei+exhibit+distinct+proteomic+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy.</a> Mol. Cell Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Kislinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+organ+and+organelle+protein+expression+in+mouse%3A+combined+proteomic+and+transcriptomic+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global survey of organ and organelle protein expression in mouse: combined proteomic and transcriptomic profiling.</a> Cell. 125, 173-186 (2006).</li>
<li>Moore, D. H., Ruska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscope+study+of+mammalian+cardiac+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biophys+Biochem.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Electron microscope study of mammalian cardiac muscle cells.</a> J. Biophys Biochem. Cytol. 3, 261-268 (1957).</li>
<li>Anversa, P., Vitali-Mazza, L., Visioli, O., Marchetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+cardiac+hypertrophy%3A+a+quantitative+ultrastructural+study+in+the+compensatory+stage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Experimental cardiac hypertrophy: a quantitative ultrastructural study in the compensatory stage.</a> J. Mol. Cell Cardiol. 3, 213-227 (1971).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specialized+compartments+of+cardiac+nuclei+exhibit+distinct+proteomic+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Specialized compartments of cardiac nuclei exhibit distinct proteomic anatomy.</a> Mol Cell. Proteomics. 10, (2011).</li>
<li>Paulsson, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+regulation+of+calsarcin-1+during+pressure+overload-induced+cardiac+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+and+cellular+cardiology%22%5BJournal%5D)">Post-translational regulation of calsarcin-1 during pressure overload-induced cardiac hypertrophy.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. 48, 1206-1214 (2010).</li>
<li>Franklin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+the+chromatin+proteome+in+disease+reveals+remodeling+principles+and+identifies+high+mobility+group+protein+b2+as+a+regulator+of+hypertrophic+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of the chromatin proteome in disease reveals remodeling principles and identifies high mobility group protein b2 as a regulator of hypertrophic growth.</a> Mol Cell Proteomics. 11, (2012).</li>
<li>Gramolini, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+proteomics+profiling+of+a+phospholamban+mutant+mouse+model+of+dilated+cardiomyopathy+reveals+progressive+intracellular+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comparative proteomics profiling of a phospholamban mutant mouse model of dilated cardiomyopathy reveals progressive intracellular stress responses.</a> Mol Cell Proteomics. 7, 519-533 (2008).</li>
<li>Singh, H., Warburton, S., Vondriska, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomics+to+Identify+Proteins+Interacting+with+P2X2+Ligand-Gated+Cation+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels.</a> J. Vis. Exp. (27), e1178(2009).</li>
<li>Park, S. K., Venable, J. D., Xu, T., Yates, J. R. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+analysis+software+tool+for+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A quantitative analysis software tool for mass spectrometry-based proteomics.</a> Nat. Methods. 5, 319-322 (2008).</li>
<li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+%28DARTS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 21984-21989 (2009).</li>
<li>Kamleh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomic+profiling+using+Orbitrap+Fourier+transform+mass+spectrometry+with+hydrophilic+interaction+chromatography%3A+a+method+with+wide+applicability+to+analysis+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Metabolomic profiling using Orbitrap Fourier transform mass spectrometry with hydrophilic interaction chromatography: a method with wide applicability to analysis of biomolecules.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 22, 1912-1918 (2008).</li>
<li>Searle, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold%3A+a+bioinformatic+tool+for+validating+MS%2FMS-based+proteomic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Scaffold: a bioinformatic tool for validating MS/MS-based proteomic studies.</a> Proteomics. 10, 1265-1269 (2010).</li>
<li>Murray, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Basic+Proteins+of+Cell+Nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The Basic Proteins of Cell Nuclei.</a> Annu Rev. Biochem. 34, 209-246 (1965).</li>
<li>Johns, E. W., Phillips, D. M., Simson, P., Butler, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+fractionations+of+arginine-rich+histones+from+calf+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Improved fractionations of arginine-rich histones from calf thymus.</a> Biochem. J. 77, 631-636 (1960).</li>
<li>Rodriguez-Collazo, P., Leuba, S. H., Zlatanova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+methods+for+purification+of+histones+from+cultured+mammalian+cells+with+the+preservation+of+their+native+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Robust methods for purification of histones from cultured mammalian cells with the preservation of their native modifications.</a> Nucleic Acids Res. 37, e81(2009).</li>
<li>Kuehl, L., Salmond, B., Tran, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentrations+of+high-mobility-group+proteins+in+the+nucleus+and+cytoplasm+of+several+rat+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Concentrations of high-mobility-group proteins in the nucleus and cytoplasm of several rat tissues.</a> J. Cell Biol. 99, 648-654 (1984).</li>
<li>Gronow, M., Griffiths, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+and+separation+of+the+non-histone+proteins+of+rat+liver+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation and separation of the non-histone proteins of rat liver nuclei.</a> FEBS Lett. 15, 340-344 (1971).</li>
<li>Mischke, B. G., Ward, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+tissue+specificity+of+chromatin-associated+proteins+in+Vicia+faba%5BTitle%5D)+AND+%22Can+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Isolation and tissue specificity of chromatin-associated proteins in Vicia faba.</a> Can J. Biochem. 53, 91-95 (1975).</li>
<li>Andersen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+proteomic+analysis+of+the+human+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed proteomic analysis of the human nucleolus.</a> Curr. Biol. 12, 1-11 (2002).</li>
<li>Zhao, Y., Jensen, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification-specific+proteomics%3A+strategies+for+characterization+of+post-translational+modifications+using+enrichment+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Modification-specific proteomics: strategies for characterization of post-translational modifications using enrichment techniques.</a> Proteomics. 9, 4632-4641 (2009).</li>
<li>Ahrne, E., Muller, M., Lisacek, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unrestricted+identification+of+modified+proteins+using+MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unrestricted identification of modified proteins using MS/MS.</a> Proteomics. 10, 671-686 (2010).</li>
<li>Young, N. L., Plazas-Mayorca, M. D., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems-wide+proteomic+characterization+of+combinatorial+post-translational+modification+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Systems-wide proteomic characterization of combinatorial post-translational modification patterns.</a> Expert Rev. Proteomics. 7, 79-92 (2010).</li>
<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Mol. Cell Proteomics. , (2012).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protease+for+%27middle-down%27+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A protease for 'middle-down' proteomics.</a> Nat. Methods. , (2012).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+intact+protein+isoforms+in+discovery+mode+using+top-down+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mapping intact protein isoforms in discovery mode using top-down proteomics.</a> Nature. 480, 254-258 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Twee methoden voor nucleaire isolatie eerder zijn beoordeeld: 27 men de techniek van Behrens homogeniseren gelyofiliseerd weefsel in een niet-waterig oplosmiddel en de tweede een wijziging waarvan we hier homogeniseren van weefsel in een waterige sucrose / zoutoplossing gevolgd door differentiële of dichtheid-gradiënt centrifugatie. Subfractionation van de kernen door zure extractie op weefselmonsters is een belangrijk instrument voor het bestuderen van chromatine die is sinds 196...

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Dulbeco Modified Eagle Medium </td><td> Invitrogen </td><td> 11965 </td></tr><tr><td> Protease pellet </td><td> Roche </td><td> 04 693 159 001 </td></tr><tr><td> 100 um zeef </td><td> BD Falcon </td><td> 352360 </td></tr><tr><td> Ultracut ultramicrotoom </td><td> Reichert </td><td></td></tr><tr><td> 100CX Transmissie Elektronen Microscoop </td><td> JEOL USA, Inc </td><td></td></tr><tr><td> Wielewaal </td><td> BioRad </td><td> 161-0496 </td></tr><tr><td> Histon H2A antilichaam </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-8648 </td></tr><tr><td> Nucleoporin p62 antilichaam </td><td> BD Biosciences </td><td> 610498 </td></tr><tr><td> Adenine nucleotij transporter antilichaam </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-9299 </td></tr><tr><td> BiP antilichaam </td><td> Santa Cruz </td><td> sc-1050 </td></tr><tr><td> Tubuline antilichaam </td><td> Sigma </td><td> T1568 </td></tr><tr><td> Histon H3 antilichaam </td><td> Abcam </td><td> ab1791 </td></tr><tr><td> Fibrillarin antilichaam </td><td> Cell Signaling </td><td> C12C3 </td></tr><tr><td> SNRP70 antilichaam </td><td> Abcam </td><td> ab51266 </td></tr><tr><td> E2F-1 antilichaam </td><td> Thermo Fisher </td><td> MS-879 </td></tr><tr><td> Retinoblastoom antilichaam </td><td> BD Biosciences </td><td> 554136 </td></tr><tr><td> Hypoxie induceerbare factor-1 antilichaam </td><td> Novus Biologicals </td><td> NB100-469 </td></tr><tr><td> BCA eiwitbepaling </td><td> Thermo Scientific </td><td> 23227 </td></tr><tr><td> Omgekeerde fasekolom </td><td> Nieuwe Objectief </td><td> PFC7515-B14-10 </td></tr><tr><td> BioWorks Browser </td><td> Thermo Scientific </td><td></td></tr></tbody></table>

kwantitatieve analyse van chromatine proteomen in de ziekte van

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In de kern bevinden de proteomen waarvan de functies zijn het meest nauw verbonden met de genregulatie. Volwassen zoogdier cardiomyocyte kernen zijn uniek vanwege het hoge percentage binucleaire cellen, de overwegend een heterochromatine toestand van het DNA en de niet-delende aard van de cardiomyocyt waarin volwassen kernen maakt in een permanente staat van interfase. Twee Transcriptionele regulatie tijdens de ontwikkeling en ziekte zijn goed bestudeerd in dit orgaan, 3-5 maar wat blijft relatief onontdekt is de rol van de nucleaire eiwitten die verantwoordelijk zijn voor DNA verpakking en expressie, en hoe deze eiwitten veranderingen in transcriptie&#39;s die tijdens ziekte te bestrijden. 6 In de ontwikkelde wereld, hart-en vaatziekten is de nummer een doodsoorzaak voor zowel mannen als vrouwen. 7 Inzicht in hoe nucleaire eiwitten samen te werken om de progressie van deze ziekte te reguleren is van cruciaal belang voor het bevorderen van de huidige behandeling oOPTIES. Massaspectrometrie is de ideale tool voor het aanpakken van deze vragen omdat het zorgt voor een onpartijdige annotatie van de nucleaire proteoom en de relatieve kwantificatie voor de manier waarop de overvloed van deze eiwitten verandert met de ziekte. Hoewel er verschillende proteomics studies voor zoogdieren nucleaire eiwit-complexen, 8-13 tot voor kort 14 is er slechts een studie naar de cardiale nucleaire proteoom, en zij van mening was de hele kern, in plaats van het verkennen van het proteoom op het niveau van de nucleaire sub compartimenten 15. In groot deel is dit gebrek aan werk te wijten aan de moeilijkheid van het isoleren van cardiale kernen. Cardiac kernen optreden binnen een starre en dichte actine-myosine inrichting waaraan zij verbonden via meerdere verlengingen van het endoplasmatisch reticulum, voorzover myocyte contractie verandert bovendien hun algemene vorm. 16 cardiomyocyten zijn 40% mitochondria vol 17 die necessitates verrijking van de kern naast de andere organellen. Hier beschrijven we een protocol voor cardiale nucleaire verrijking en verdere fractionering in biologisch relevante compartimenten. Verder hebben we detail werkwijzen voor label-free kwantitatieve massaspectrometrische dissectie van deze fracties-technieken vatbaar voor in vivo experimenten in verschillende diermodellen en orgaansystemen waar metabolische labeling niet haalbaar.

Figuur 4 benadrukt het nut van deze vorm van relatieve kwantificatie. Getoond in het linker paneel zijn de individuele mono-isotopische peptide pieken (bedekt met verschillende muizen), die zijn aangewezen als behorend tot het eiwit HMGB1 (geïdentificeerd via database). Elke piek in wezen een ionenchromatograaf geëxtraheerd voor de gegeven peptide afkomstig is van een andere muis. De groepen vertegenwoordigen drie verschillende fysiologische toestanden: basale, cardiale hypertrofie en hartfalen, met dri...

Advances in massaspectrometrie toestemming hebben high throughput analyse van eiwitexpressie en modificatie in een groot aantal weefsels. Gecombineerd met subcellulaire fractionering en ziektemodellen, kwantitatieve massaspectrometrie en bioinformatica nieuwe eigenschappen kunnen onthullen in biologische systemen. De werkwijze hierin beschreven analyseert chromatine-geassocieerde eiwitten in de vaststelling van hart-en vaatziekten en is gemakkelijk toepasbaar op andere<em&gt; In vivo</em&gt; Modellen van menselijke ziekten.

Kwantitatieve analyse van chromatine proteomen in de ziekte van

In de nucleus bevinden zich de proteomen waarvan de functies het nauwst verbonden zijn met genregulatie. Kernen van cardiomyocyten van volwassen zoogdieren zijn uniek vanwege ...

Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van chromatinegebonden eiwitten uit het hart van een muis. Dit wordt bereikt door eerst het hart te homogeniseren en vervolgens de cardiale kernen te isoleren via een sucrose-dichtheidsgradiënt. Vervolgens wordt het nucleoplasma gescheiden van de chromatinefractie.Vervolgens worden eiwitten geëxtraheerd uit het chromatinepellet om eiwitten die losjes aan het DNA gebonden zijn te verrijken. Ten slotte worden eiwitten geëxtraheerd uit een ander chromatinepellet om eiwitten die stevig aan het DNA gebonden zijn te verrijken. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die de kenmerken van het nucleaire proteoom onder verschillende fysiologische omstandigheden laten zien via kwantitatieve label-vrije massaspectrometrische analyse.Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het cardiologische veld, zoals de wijze waarop chromatine-remodellering bijdraagt aan cardiale hypertrofie en hartfalen. Nadat een volwassen muis is geofferd en het hart is uitgesneden, spoelt u dit af met ijskoud PBS. Plaats het hart vervolgens in een glazen reageerbuis met 2 mL lysisbuffer die een protease- en fosfataseremmer-mix bevat en homogeniseer het geheel.Giet de lysaten door een zeef van 100 micron en verzamel het filtraat in een buisje van 1,5 milliliter; houd het monster vanaf dit punt, tenzij anders aangegeven, op ijs. Centrifugeer het monster 5 minuten bij 4.000 RPM op 4 °C. Verzamel het supernatant dat het cytosol bevat en bewaar dit bij -80 °C.Resuspendeer het pellet in 200 µL lysisbuffer. Voeg één ml sucrosebuffer toe aan een nieuwe buis en breng het geresuspendeerde pellet voorzichtig aan op het sucrosekussen met een transferpipet. Centrifugeer 10 minuten bij 5.000 RPM bij 4 °C. Verwijder de dunne film aan de bovenzijde evenals het sucrosekussen, waarin het membraan zich bevindt.Spoel het resterende pellet met de kernen met 200 µL ijskoude PBSE-DTAs, resuspendeer het pellet met de kernen in 200 µL detergent-extractiebuffer en vortex het monster twee keer gedurende elk 10 seconden. Plaats het monster 10 minuten op ijs en centrifugeer het vervolgens 5 minuten bij 13.000 RPM bij 4 °C. Verwijder het supernatant met de nucleoplasmaproteïnen en bewaar dit bij -80 °C.Spoel de pellets met ijskoude PBSEDTA en resuspendeer deze in 300 µL Tris-SDS-EDTA-buffer. Soniceren het monster drie tot zes keer gedurende elk 10 seconden. Om het DNA af te breken, het monster tussen de sonicaties op ijs houden en centrifugeren bij 13.000 RPM gedurende vijf minuten bij 4 °C.Bewaar het supernatant met het geïsoleerde eiwit bij -80 °C om eiwitten te verrijken die strak aan DNA gebonden zijn, zoals histonen. Voer een aparte fractionering uit om chromosomen te isoleren, beginnend met een geïsoleerd volwassen hart of cardiomyocyten van rat PARPs. Tritureer het chromatinepellet in 400 µL 0,4 N zwavelzuur en vortex. Om klonten te verwijderen, wordt het monster 30 minuten of overnacht bij 4 °C geroteerd; verwijder na de incubatie het nucleair debris door te centrifugeren bij 16.000 G gedurende 10 minuten bij 4 °C.Overbreng het supernatant naar een nieuwe buis en voeg druppelsgewijs 132 µL trichloorazijnzuur toe aan het monster. Keer de buis meerdere keren om en incubeer 30 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens, verwijder het supernatant en spoel het pellet met histonen voorzichtig af met ijskoud aceton en centrifugeer opnieuw.Herhaal opnieuw de acetonwasbeurt en laat het pellet aan de lucht drogen voordat u het opnieuw resuspendeert in 100 µL Triss S-D-S-E-D-T-A buffer. Gebruik 1 M triss om de pH op 8 in te stellen.Sonicate het monster in een waterbad gedurende 15 minuten. Bewaar het monster bij minus 80 °C. Gebruik massaspectrometrie om analyses uit te voeren ter bepaling van de zuiverheid en ter identificatie van de hier getoonde eiwitten.De over elkaar gelegde geëxtraheerde ionchromatogrammen voor een enkel peptide dat is toegewezen aan het HMGB1-eiwit. Elk chromatogram is afkomstig van een ander chromatine-monster en is kleurgecodeerd om de fysiologische staat van de muis weer te geven waarvan het monster is verkregen. Voor elk van de fysiologische condities, basale cardiale hypertrofie en hartfalen, werden drie biologische replica's geanalyseerd, waarbij elk monster twee keer is geanalyseerd, wat resulteert in een totaal van 18 chromatogrammen.Door de oppervlakte onder de curve te integreren, kan de relatieve abundantie voor elk replica worden bepaald. In dit paneel zijn de zes replica's gemiddeld voor elk van de drie fysiologische condities om globale abundantiewaarden te verkrijgen. Uit deze analyse blijkt duidelijk dat de abundantie van HGB one verandert tijdens het verloop van de ziekte, zoals hier te zien is.Het fragmentatiespectrum voor dit peptide bevestigt de aminozuursequentie en maakt het mogelijk om dit te koppelen aan het H MG B one-eiwit. Daarentegen laat de kwantificering van een ander peptide van het eiwit histon H four zien dat de abundantie ervan niet verandert bij ziekte. We kunnen de reproduceerbaarheid van de waargenomen veranderingen in peptide-abundantie tussen de verschillende fysiologische toestanden analyseren met behulp van statistische analyse.Ten eerste wordt de abundantie van alle in elk replica geïdentificeerde peptiden onderworpen aan een anova, gevolgd door een principale componentenanalyse of PCA. De clustering van zowel technische als biologische replica's in deze plot bevestigt dat de door massaspectrometrie gedetecteerde abundantieveranderingen consistent en reproduceerbaar zijn tussen de verschillende ziektestadia. Basaal in blauw, hypertrofie in rood en falen in groen; van gelijk belang als de kwantificering en reproduceerbaarheid van de resultaten is de toegenomen dekking van het nucleaire proteoom die mogelijk is gemaakt door nucleaire subfractionering.Deze figuur illustreert dat analyse van de gehele kern alleen er niet in slaagt om zelfs maar een meerderheid van de kernproteïnen te onthullen die worden geïdentificeerd wanneer individuele analyses van de afzonderlijke compartimenten worden gecombineerd. Bovendien demonstreert de matige overlap tussen de verschillende fracties de biologische relevantie van het afzonderlijk beschouwen van deze compartimenten voor aanvullend inzicht in de kernfunctie en genregulatie. Ten slotte zorgt het vermogen om zuurextraheren of detergent-extraheren chromosomen specifiek te fractioneren voor een verrijking van belangrijke structurele chromatineproteïnen zoals histonen, waardoor een meer gerichte massaspectrometrische analyse van een groep proteïnen mogelijk wordt zonder dat specifieke antilichamen voor elke variant en isovorm vereist zijn. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat alle monsters die op de massaspectrometer worden geanalyseerd, vrij moeten blijven van keratinecontaminatie.Dit is vooral belangrijk in de opeenvolgende stappen na de eiwitisolatie.

quantitative-analysis-of-chromatin-proteomes-in-disease

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Hier presenteren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) procedure voor genoom-brede locatie analyse van eiwit-isovormen die verschillen in een histon-bindend domein. We zijn toe te passen op ChIP-Seq analyse om de doelstellingen van het KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase te identificeren.

Genoom-brede analyse met behulp van chip Isoform-specifieke Gene targets te identificeren

De combinatie van chromatine immunoprecipitatie en ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) kan identificeren en in kaart eiwit-DNA-interacties in een bepaald weefsel of cellijn. Geschetst is hoe je een hoge kwaliteit ChIP sjabloon voor de daaropvolgende sequencing, met ervaring met de transcriptiefactor TCF7L2 als een voorbeeld te genereren.

Generatie van hoge kwaliteit Chromatine immunoprecipitatie DNA Template voor High-throughput sequencing (ChIP-seq)

Door de combinatie van inheemse en verknopen van chromatine immunoprecipitatie met een hoge-resolutie massaspectrometrie, ChroP benadering stelt aan de samengestelde proteomics architectuur van histonmodificaties, varianten en niet-histonic eiwitten synergizing op functioneel verschillende chromatinedomeinen ontleden.

De ChroP aanpak combineert chip en massaspectrometrie te ontleden Locus-specifieke Proteomic Landschappen van Chromatin

Sequentiële zout winning van chromatine gebonden eiwitten is een nuttig instrument voor het bepalen van de bindende eigenschappen van grote eiwitcomplexen. Deze methode kan worden gebruikt om te evalueren van de rol van individuele subeenheden of domeinen in de algehele affiniteit van een eiwit complex om te bulk chromatine.

Sequentiële zout extracties uit te voeren voor de analyse van Bulk chromatine bindende eigenschappen van chromatine complexen wijzigen

Hier beschrijven we een chromatine immunoprecipitation (ChIP) en ChIP-seq de protocol van de voorbereiding van de bibliotheek voor het genereren van wereldwijde epigenomic profielen van lage-overvloed kip embryonale monsters.

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde high-throughput ChIP-sequencing protocol en computationele analyses pijpleiding voor de bepaling van genoom-brede chromatine staat patronen uit bevroren tumor weefsels en cellijnen.

Een geïntegreerd Platform voor het toewijzen van de genoom-brede van chromatine Staten met behulp van High-throughput ChIP-sequencing in Tumor weefsels

Dit is een methode om nieuwe DNA-interactie eiwitten op specifieke doelgroep loci, afhankelijk van de volgorde-specifieke inname van kruisverwijzende chromatine voor latere proteomic analyses identificeren. Geen voorkennis vereist over potentiële bindende proteïnen, noch cel wijzigingen zijn vereist. In eerste instantie ontwikkeld voor gist, is de technologie inmiddels aangepast voor zoogdiercellen.

Aanpassing van hybridisatie inname van chromatine-geassocieerde eiwitten voor Proteomics op zoogdiercellen

We presenteren een protocol voor het identificeren van functionele implicaties van niet-Codeer varianten geïdentificeerd door genoom-brede associatie studies (GWAS) met behulp van driedimensionale chromatine interacties.

In kaart brengen van de ziekte van Alzheimer varianten op hun doel genen met behulp van computationele analyse van Chromatin configuratie

Dit protocol richt zich op chromatinepreparatie uit snap bevroren weefsels en is geschikt voor Crosslinking Chromatin Immunoprecipitation (X-ChIP) gevolgd door kwantitatieve PCR-analyse (X-ChIP-qPCR) of next generation sequencing-benaderingen (X-ChIP-seq).

Chromatine-extractie uit bevroren chimere leverweefsel voor chromatine-immunoprecipitatieanalyse

Met behulp van kwantitatieve PCR, we zien hoe de gevestigde chick CAM-model kan worden gebruikt om kwantitatief analyseren van de uitzaaiing van menselijke tumorcellen naar verre organen.

Kwantitatieve analyse van kanker metastase met behulp van een Avian Embryo Model

Leer chromatine-eiwitisolatie uit muizenhartweefsel voor cardiovasculair onderzoek met sucrose-dichtheidsgradiënt en kwantitatieve massaspectrometrie. Deze methode onthult nucleaire proteoomdynamiek.

Kwantitatieve analyse van chromatine proteomen in de ziekte van

Meer video's verkennen