Name: Opfok en Injectie van Manduca sexta Larven naar bacteriële virulentie beoordelen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Leer bacteriële virulentie beoordelen in Manduca sexta larven via directe injectie in het hemocoel. Deze methode maakt precieze analyse van gastheer-pathogeen interacties mogelijk voor microbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen het verleden leden van de Goodrich-Blair lab bedanken: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard, en Youngjin Park voor hun bijdragen aan de ontwikkeling van dit protocol. Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation subsidie ​​IOS-0950873 en de National Institutes of Health NRSA gemeenschap FAI084441Z.

1. Insect Egg Sterilisatie en grootbrengen <ol><li> Bereid voeding door eerst autoclaaf 15 g van de ontvangen agar in 900-1,000 ml H 2 O. Onmiddellijk na behandeling in een autoclaaf, meng met 166 g tarwekiemen dieet en mix goed in een laboratorium blender. Giet het mengsel in een schaal (of gerechten) om af te koelen, vervolgens overbrengen dieet om aluminiumfolie, strak wikkelen, en bewaar bij 4 ° C. </li><li> Bij aankomst, steriliseren M. sexta eieren met 250 ml 0,6% bleekmiddeloplossing gedurende 2-3 minuten in een glazen filterhouder en vacuumfles inrichting met een 90 mm ​​filter papier roeren. </li><li> Schakel vacuüm bleekoplossing en wassen eieren 3-4 keer afvoer met 250 ml steriel gedestilleerd H 2 O per wasbeurt. </li><li> Overdracht eieren in de frisse 90 mm filtreerpapier geplaatst in een Petri plaat deksel en laat ze drogen tot ze niet meer bij elkaar blijven (ongeveer 20-30 min). </li><li> Breng eieren op de bodem van plastic containers met insect dieet, het ongeveer 40 eieren per container(Figuur 1A). Eieren worden gescheiden van dieet vocht veroorzaakte schimmelbesmetting te voorkomen. Handhaven eieren bij 26 ° C met 16 uur licht: 8 uur donker fotoperiode. Eieren voorafgaand verlichten op een geel-witte kleur aan het uitkomen. </li><li> Wanneer broedeieren voltooid, voorzichtig overbrengen ongeveer 25 larven elke nieuwe containers met voeding op de bodem (Figuur 1B). Het is belangrijk op te halen elke larve door de lange zwarte hoorn behulp van een tang om te vermijden dat ze tijdens hun kwetsbare vroege ontwikkelingsstadia. Incubeer gedurende 2 dagen zoals hierboven. Terwijl larvale dood is ongebruikelijk in dit stadium, kan een aantal dode of, meer waarschijnlijk, ontwikkelingsachterstand onvolgroeide larven worden waargenomen. Dergelijke insecten moeten worden uitgesloten van verdere studie en geofferd door bevriezing. </li><li> Om kannibalistische gedrag, transfer larven aan individuele containers met kleine stukjes voedsel (figuur 1C) te vermijden en incubeer als hierboven. Monitor insect opgericht ter vervanging van voedsel en schoonmaken uitwerpselen out van containers om de andere dag totdat ze ondergaat het derde larvale vervelling (meestal 6-9 dagen na het uitkomen). Dit is het 4e instar larvale stadium, gekenmerkt door het verschijnen van zwarte haakvormige crochets op elke proleg en grotere bekendheid van strepen langs de insect lichaam (Figuur 1D). De larven kunnen aanzienlijk variëren in grootte, maar meestal 0.15-0,4 g zou wegen bij het ​​betreden van de 4 e instar stadium. Larven van vergelijkbare grootte worden gekozen voor injectie. </li></ol> 2. Bereiding van bacteriën voor Injectie <ol><li> Groeien de bacteriestam (s) wordt getest volgens standaard procedures de groeifase u testen. </li><li> Pellet 500 pi van elke bacteriële stam die getest door het draaien gedurende 2 minuten in een microcentrifuge bij 13.000 rpm bij kamertemperatuur. </li><li> Resuspendeer cellen in 1 ml steriele 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en pellet opnieuw zoals hierboven. </li><li> Resuspendeer cellen in 0,5 ml 1x PBS en meaof de optische dichtheid (OD) van de suspensie. Verdun alle suspensies dezelfde OD, indien nodig. Steriele groeimedia kunnen eveneens worden gebruikt voor mobiele resuspenderen en te verdunnen in plaats van 1x PBS, indien gewenst. </li></ol> 3. Injectie van 4 e instar larven <ol><li> Bereid serial 10-voudige verdunningen van de eerste bacteriestam in 6 wells van een 96-well microtiterplaat in steriele 1x PBS, met een verse pipetpunt voor elke verdunning (figuur 2A). Het eindvolume van celsuspensie in elk putje groter zijn dan de vereiste volume voor injectie (10 ul per insect) plus 20 pi aan de plaat inoculum (zie stap 3.2 en 3.7). </li><li> Spot 10 pi telkens 5 verdunningen (10 -2 tot 10 -6) boven aan een Petri plaat met een geschikt groeimedium. Kantel de plaat, zodat de spots verspreid naar de (Figuur 2B). </li><li> Verwijder insecten dieet en uitwerpselen en plaats insecten in containers op ijsongeveer 5 min. </li><li> Steriliseer de naald door spoelen 3 maal elk in 2 tubes van 70-100% ethanol, gevolgd door een buis van steriele H 2 O (figuur 2C). De hoeveelheid vloeistof moet voldoende onderdompelen naald. </li><li> Kwantificeren van de verdunde celsuspensies onder een microscoop met een hemocytometer. Afhankelijk van de gewenste inoculum opneming 10 ul van de juiste microtiterputje (Figuur 2D). </li><li> Swab het insect oppervlak met 95% ethanol en injecteer de 10 ml celsuspensie in het insect een hoek (kleiner dan 45 °) achter een van de buikpoten. Zorg ervoor dat u doorboren de darm en injecteer de inhoud net onder de epidermale laag (figuur 2E). Terwijl sommige verlies van hemolymfe (helder, groen-blauwe vloeistof) is normaal, fijn stof en gele vloeistof die uit de injectieplaats zijn een indicatie van darm punctie. Als dit gebeurt, offeren het insect en het verkrijgen van een nieuwe larve opnieuwplaatsen. </li><li> Herhaal stap 3.6 voor elke resterende insect in de eerste injectie groep. Naald sterilisatie niet noodzakelijk is tussen de insect geïnjecteerd met dezelfde verdunning en bacteriestam tenzij vuil. Als alternatief kan een herhalende dispenser worden gebruikt voor grotere consistentie in injectievolume tussen monsters. </li><li> Na injecteren van elk insect met de eerste bacterie, herhaal stap 3.2, nu spotten celsuspensies in het midden van de plaat en te laten stromen naar beneden (figuur 2F). Incubeer de platen op de juiste temperatuur en tel kolonies aan het inoculum te sommen. Deze tweede stap plating wordt gebruikt om te verifiëren dat de monsters niet zijn die tijdens het injectieproces, aangezien dit zou leiden tot uiteenlopende kolonie getallen tussen de eerste en tweede platings. </li><li> Herhaal stap 3.1 tot 3.8 voor elke bacterie in het experiment. Tot slot, injecteren drie-vijf insecten met steriele PBS 1x met een sterile naald als negatieve controlegroep. Incubeer insecten bij 26 ° C met 16 uur licht: 8 uur donker fotoperiode. </li><li> Monitor insecten overleven in de tijd na de injectie. Insect dood wordt gekenmerkt als een gebrek aan vrijwillige beweging na stimulatie. Insecten vertonen vaak verlies van eetlust, diarree (waterig, geel uitwerpselen), en / of verlies van water (&quot;zweten&quot;) tijdens besmetting die voorafging aan de dood; deze kenmerken kunnen zijn vermeldenswaard ook. </li></ol>

<ol><li>Bintrim, S. B., Ensign, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+inactivation+of+genes+encoding+the+crystalline+inclusion+proteins+of+Photorhabdus+luminescens+results+in+mutants+with+pleiotropic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Insertional inactivation of genes encoding the crystalline inclusion proteins of Photorhabdus luminescens results in mutants with pleiotropic phenotypes.</a> J. Bacteriol. 180, 1261-1269 (1998).</li>
<li>Schesser, J. H., Kramer, K. J., Bulla, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioassay+for+homogeneous+parasporal+crystal+of+Bacillus+thuringiensis+using+the+tobacco+hornworm%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bioassay for homogeneous parasporal crystal of Bacillus thuringiensis using the tobacco hornworm, Manduca sexta.</a> Appl. Environ. Microbiol. 33, 878-880 (1977).</li>
<li>Péchy-Tarr, M., Bruck, D. J., Maurhofer, M., Fischer, E., Vogne, C., Henkels, M. D., Donahue, K. M., Grunder, J., Loper, J. E., Keel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+a+novel+gene+cluster+encoding+an+insect+toxin+in+plant-associated+strains+of+Pseudomonas+fluorescens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of a novel gene cluster encoding an insect toxin in plant-associated strains of Pseudomonas fluorescens.</a> Environ. Microbiol. 10, 2368-2386 (2008).</li>
<li>Nuñez-Valdez, M. E., Calderón, M. A., Aranda, E., Hernández, L., Ramírez-Gama, R. M., Lina, L., Rodríguez-Segura, Z., Gutiérrez Mdel, C., Villalobos, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+putative+Mexican+strain+of+Serratia+entomophila+pathogenic+against+root-damaging+larvae+of+Scarabaeidae+%28Coleoptera%29%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of a putative Mexican strain of Serratia entomophila pathogenic against root-damaging larvae of Scarabaeidae (Coleoptera).</a> Appl. Environ. Microbiol. 74, 802-810 (2008).</li>
<li>Forst, S. A., Tabatabai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+histidine+kinase%2C+EnvZ%2C+in+the+production+of+outer+membrane+proteins+in+the+symbiotic-pathogenic+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of the histidine kinase, EnvZ, in the production of outer membrane proteins in the symbiotic-pathogenic bacterium Xenorhabdus nematophilus.</a> Appl. Environ. Microbiol. 63, 962-968 (1997).</li>
<li>Kanost, M. R., Jiang, H., Yu, X. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+responses+of+a+lepidopteran+insect%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Innate immune responses of a lepidopteran insect, Manduca sexta.</a> Immunol. Rev. 198, 97-105 (2004).</li>
<li>Yu, X. Q., Zhu, Y. F., Ma, C., Fabrick, J. A., Kanost, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+recognition+proteins+in+Manduca+sexta+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Pattern recognition proteins in Manduca sexta plasma.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1287-1293 (2002).</li>
<li>Eleftherianos, I., ffrench-Constant, R. H., Clarke, D. J., Dowling, A. J., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+immune+response+to+the+entomopathogen+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Dissecting the immune response to the entomopathogen Photorhabdus.</a> Trends Microbiol. 18, 552-560 (2010).</li>
<li>Tobacco Hornworm Genome Project [Internet]. , Baylor College of Medicine. Houston, TX. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project">http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/content/tobacco-hornworm-genome-project</a> (2012).</li>
<li>Herbert, E. E., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friend+and+foe%3A+the+two+faces+of+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Friend and foe: the two faces of Xenorhabdus nematophila.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 634-646 (2007).</li>
<li>D'Argenio, D. A., Gallagher, L. A., Berg, C. A., Manoil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+host+for+Pseudomonas+aeruginosa+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model host for Pseudomonas aeruginosa Infection.</a> J. Bacteriol. 183, 1466-1471 (2001).</li>
<li>Waterfield, N., Dowling, A., Sharma, S., Daborn, P. J., Potter, U., Ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oral+toxicity+of+Photorhabdus+luminescens+W14+toxin+complexes+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Oral toxicity of Photorhabdus luminescens W14 toxin complexes in Escherichia coli.</a> Appl. Environ. Microbiol. 67, 5017-5024 (2001).</li>
<li>Park, Y., Herbert, E. E., Cowles, C. E., Cowles, K. N., Menard, M. L., Orchard, S. S., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+variation+in+Xenorhabdus+nematophila+virulence+and+suppression+of+Manduca+sexta+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Clonal variation in Xenorhabdus nematophila virulence and suppression of Manduca sexta immunity.</a> Cell. Microbiol. 9, 645-656 (2007).</li>
<li>Park, Y., Kim, Y., Putnam, S. M., Stanley, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterium+Xenorhabdus+nematophilus+depresses+nodulation+reactions+to+infection+by+inhibiting+eicosanoid+biosynthesis+in+tobacco+hornworms%2C+Manduca+sexta%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Insect+Biochem.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The bacterium Xenorhabdus nematophilus depresses nodulation reactions to infection by inhibiting eicosanoid biosynthesis in tobacco hornworms, Manduca sexta.</a> Arch. Insect Biochem. Physiol. 52, 71-80 (2003).</li>
<li>Cowles, K. N., Cowles, C. E., Richards, G. R., Martens, E. C., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+regulator+Lrp+contributes+to+mutualism%2C+pathogenesis+and+phenotypic+variation+in+the+bacterium+Xenorhabdus+nematophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The global regulator Lrp contributes to mutualism, pathogenesis and phenotypic variation in the bacterium Xenorhabdus nematophila.</a> Cell. Microbiol. 9, 1311-1323 (2007).</li>
<li>Cowles, K. N., Goodrich-Blair, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+activity+of+a+Xenorhabdus+nematophila+haemolysin+required+for+full+virulence+towards+Manduca+sexta+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Expression and activity of a Xenorhabdus nematophila haemolysin required for full virulence towards Manduca sexta insects.</a> Cell. Microbiol. 7, 209-219 (2005).</li>
<li>Goodrich-Blair, H., Clarke, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutualism+and+pathogenesis+in+Xenorhabdus+and+Photorhabdus%3A+two+roads+to+the+same+destination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mutualism and pathogenesis in Xenorhabdus and Photorhabdus: two roads to the same destination.</a> Mol. Microbiol. 64, 260-268 (2007).</li>
<li>Eleftherianos, I., Baldwin, H., ffrench-Constant, R. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+modulation+of+immunity%3A+changes+within+the+feeding+period+of+the+fifth+larval+stage+in+the+defence+reactions+of+Manduca+sexta+to+infection+by+Photorhabdus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Insect+Physiol%22%5BJournal%5D)">Developmental modulation of immunity: changes within the feeding period of the fifth larval stage in the defence reactions of Manduca sexta to infection by Photorhabdus.</a> J. Insect Physiol. 54, 309-318 (2008).</li>
<li>Kavanagh, K., Reeves, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+potential+of+insects+for+in+vivo+pathogenicity+testing+of+microbial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Exploiting the potential of insects for in vivo pathogenicity testing of microbial pathogens.</a> FEMS Microbiol. Rev. 28, 101-112 (2004).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De directe injectie van M. sexta larven met entomopathogene bacteriën, zoals hier beschreven, dient als een eenvoudig en effectief middel om bacteriële virulentie analyseren. De methode is ook zeer aanpasbaar aan te passen verschillende proefpersonen en / of voorwaarden. Bacteriën kunnen op diverse manieren bereid voor injectie. Bij X. nematophila, wild type cellen gekweekt in voedselrijke Luria-Bertani (LB) medium tot mid-log fase zijn typisch de meest virulente, doden meeste of alle insecten binnen 3...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td> 90 mm filterpapier </td><td> Whatman papier </td><td> 1001 090 </td><td></td></tr><tr><td> Glazen filterhouder </td><td> Millipore </td><td> XX1004700 </td><td></td></tr><tr><td> Manduca sexta eieren </td><td> Carolina Biological Supply </td><td> 143880 </td><td></td></tr><tr><td> Gypsy Moth Dieet + agar </td><td> MP Biomedicals </td><td> 0296029301 </td><td></td></tr><tr><td> 5,5 oz. plastic containers en deksels </td><td> Solo Cup Company </td><td> URC55-0090 PL4-0090 </td><td></td></tr><tr><td> 1 oz. plastic containers en deksels </td><td> DART Container Corporation </td><td> 100PC 100PCL25 </td><td></td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td></td&gt; <td></td><td> 137 mm NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4, 1,46 mM KH 2PO 4, pH 7,4 </td></tr><tr><td> Injectiespuit </td><td> Hamilton </td><td> 80208 </td><td> 30 gauge, 0,375 &quot;lengte, punt stijl 2 </td></tr></tbody></table>

opfok en injectie van<em&gt; manduca sexta</em&gt; larven naar bacteriële virulentie beoordelen

Rearing and Injection of Manduca sexta Larvae to Assess Bacterial Virulence

Manduca sexta, algemeen bekend als de tabak hornworm, wordt beschouwd als een belangrijke en tuinbouw en daarbuiten, het voeden op Solanaceae planten, met inbegrip van tabak en tomaat. De gevoeligheid van M. sexta larven van verschillende bacteriesoorten entomopathogene 1-5, evenals de rijkdom aan informatie beschikbaar over het insect immuunsysteem van 6-8 en de hangende genoomsequentie 9 het een goede modelorganisme voor gebruik bij het ​​bestuderen gastheer-microbe interacties tijdens pathogenese. Bovendien M. sexta larven zijn relatief groot en gemakkelijk te manipuleren en te behouden in het laboratorium opzichte van andere gevoelige insectensoorten. Hun grote formaat maakt het ook efficiënt weefsel / hemolymfe extractie voor de analyse van de gastheer respons op infectie. Werkwijze hier gepresenteerde beschrijft de directe injectie van bacteriën in de hemocoel (bloedholte) van M. Sexta larven. Deze benaderingkunnen worden geanalyseerd en de virulentie kenmerken van verschillende bacteriesoorten, stammen, of mutanten vergelijken eenvoudig bewaken van de tijd insect dood na injectie. Deze methode is ontwikkeld om de pathogeniteit van Xenorhabdus en Photorhabdus species die typisch associëren met nematode vectoren als middel om toegang tot het insect krijgen bestuderen. Entomopathogene nematoden meestal besmetten larven via natuurlijke spijsvertering of respiratoire openingen, en laat hun symbiotische bacteriën inhoud in het insect hemolymfe (bloed) kort daarna 10. De injectiemethode hier beschreven omzeilt de noodzaak van een nematode vector, waardoor het loskoppelen van de effecten van bacteriën en nematode op het insect. Deze methode zorgt voor nauwkeurige kwantificering van besmet materiaal (cellen of eiwit) in de inoculum, wat niet mogelijk is met andere bestaande methodes voor het analyseren entomopathogenesis, zoals knikken 11 en 12 assays orale toxiciteit <em&gt;. Ook orale toxiciteit assays betrekking op de virulentie van toxines uitgescheiden ingebracht in het spijsverteringsstelsel van larven, terwijl de directe injectiewerkwijze richt de virulentie van gehele cellen inocula. Het nut van de directe injectie methode zoals hier beschreven bacteriële pathogenese analyseren bewaken insect mortaliteit. Echter, deze werkwijze eenvoudig worden uitgebreid voor het bestuderen van de effecten van besmetting van het M. sexta immuunsysteem. Het insect reageert op infectie via zowel humorale als cellulaire responsen. De humorale respons omvat herkenning van bacterieel geassocieerde patronen en daaropvolgende productie van diverse antimicrobiële peptiden 7, de expressie van genen die coderen voor deze peptiden kunnen worden bewaakt na directe infectie via RNA extractie en kwantitatieve PCR 13. De cellulaire respons op infectie omvat nodulatie, inkapselen en fagocytose van ziekteverwekkers door hemocyten 6 </sup&gt;. Om deze reacties te analyseren, kan geïnjecteerd insecten worden ontleed en gevisualiseerd door microscopie 13, 14.

Een representatief voorbeeld van een insect mortaliteit assay is weergegeven in figuur 3. In dit experiment werden insecten geïnjecteerd met ongeveer 50 kolonievormende eenheden (CFU) van hetzij wild type (ATCC19061) of een verzwakte mutante stam (LRP 13) van Xenorhabdus nematophila gekweekt tot mid-log fase (n = 6 insecten per stam). Insecten waargenomen ongeveer 72 uur en het percentage geïnjecteerde insecten nog in leven elk tijdpunt opgenomen. In dit geval is de verzwakt...

De hier beschreven methode maakt gebruik van directe injectie van entomopathogene bacteriën in de hemocoel van<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Insectenlarven.<em&gt; M. Sexta</em&gt; Is een commercieel verkrijgbaar en goed bestudeerde insect. Aldus is deze methode een eenvoudige benadering voor het analyseren gastheer-bacteriële interacties vanuit een of beide partners.

Opfok en Injectie van<em&gt; Manduca sexta</em&gt; Larven naar bacteriële virulentie beoordelen

*Manduca sexta*, algemeen bekend als de tabakshoriespijlstaart, wordt beschouwd als een belangrijke agrarische plaag die zich voedt met nachtschadefamilie-planten, waaronder tabak en ...

Het algemene doel van deze procedure is om de bacteriële pathogeniciteit tegen insectenlarven te beoordelen met behulp van manduka seca als modelorganisme. Dit wordt bereikt door eerst de insectenlarven op te kweken vanuit gesteriliseerde eieren tot de vierde instar-fase van de ontwikkeling. In de tweede stap worden de bacteriële monsters voorbereid voor injectie.Vervolgens worden de bacteriën geïnjecteerd in de larven van het vierde stadium van Manduka seca. In de laatste stap wordt de sterfte van de insecten in de loop van de tijd na injectie gemonitord. Uiteindelijk wordt de tijd tot de dood van het insect geregistreerd en gebruikt om de bacteriële virulentie te beoordelen.Deze methode kan helpen bij het adresseren van kernaspecten binnen het veld van symbiose, waaronder de ontdekking van nieuwe insectpathogenen en het bepalen van verschillen in virulentie tussen bacteriële soorten of stammen. Begin eerst met het autoclaveren van 15 gram auger in 900 tot 1000 milliliters water. Direct na het autoclaveren.Meng de boor met 166 gram tarwekiemdieet. Giet het gemengde insectendieet in een laboratoriumblender in een schaal. Wanneer het is afgekoeld, wordt het dieet vanuit de schaal overgebracht naar een stuk aluminiumfolie.Wikkel het stevig in en bewaar het bij vier graden Celsius. Plaats bij aankomst de M sex to-eieren in een glazen filterhouder en vacuümflesapparaat met filterpapier van 90 millimeter. Giet vervolgens 250 milliliter 0,6% bleekoplossing over de eieren gedurende twee tot drie minuten, terwijl u af en toe roert.Zet nu het vacuüm aan om de bleekoplossing af te voeren en was de gesteriliseerde eitjes vervolgens drie tot vier keer met 250 milliliters steriel gedestilleerd water per wasbeurt. Plaats daarna een nieuw stuk filterpapier van 90 millimeter in het deksel van een Petrischaal en breng de eitjes over naar het filterpapier om ze in een laminaire flowkast te laten drogen totdat ze niet meer aan elkaar kleven. Plaats nu het onlangs bereide insectendieet op een vastgezet rubberen stopje in verschillende plastic bakjes en breng ongeveer 40 eitjes over naar elk bakje, waarbij de eitjes van het dieet worden gescheiden om schimmelinfecties door vochtigheid te voorkomen.Houd de eieren op 26 °C met een fotoperiode van 16 uur licht en acht uur donker. De eieren zullen lichter worden en een geelwitte kleur krijgen voordat ze uitkomen; zodra het uitkomen voltooid is, kunnen ze worden overgeplaatst. Gebruik een pincet om elke larve bij de lange zwarte hoorn op te pakken en breng voorzichtig ongeveer 25 larven per stuk over naar nieuwe containers met voeding op de bodem.Incubeer de larven gedurende twee dagen onder dezelfde condities als voor de eieren; hoewel larvale sterfte in dit stadium ongebruikelijk is, kunnen sommige dode of waarschijnlijker ontwikkelingsachterstand vertonende larven worden waargenomen. Verplaats de larven nu naar individuele containers met kleine stukjes voedsel om kannibalistisch gedrag te voorkomen en incubeer ze opnieuw. Vervang het voedsel en verwijder de feces uit de containers om de dag totdat de insecten de derde larvale vervelling ondergaan.De derde larvale vervelling is het vierde larvale stadium, dat wordt gekenmerkt door de verschijning van zwarte haakvormige crochets op elke proleg en door een toegenomen prominentie van de strepen langs het lichaam van het insect. Nadat de gewenste te testen bacteriële stammen zijn opgekweekt, worden 500 µL van elke bacteriestam gedurende twee minuten gecentrifugeerd in een microcentrifuge bij 17.000 ×g bij kamertemperatuur. Was vervolgens de pellets in 1 mL steriele PBS onder dezelfde omstandigheden.Na het resuspenderen van de cellen in nog eens een halve milliliter steriele PBS, wordt de optische dichtheid van de suspensies gemeten voordat de injecties beginnen. Bereid, met behulp van een nieuwe pipetpunt voor elke verdunning, zes seriële tienvoudige verdunningen van de eerste bacteriële stam in steriele PBS in een 96-wells microtiterplaat. Breng vervolgens 10 µL van elke verdunning, van 10⁻² tot 10⁻⁶, aan langs de bovenrand van een Petrischaal met het geschikte groeimedium. Kantel daarna de plaat zodanig dat de vlekken naar het centrum verspreiden.Verwijder vervolgens het insectenvoer en de uitwerpselen en plaats de insectencontainers gedurende ongeveer vijf minuten op ijs om de insecten af te koelen. Spoel een spuitnaald driemaal in elk van de twee buisjes met 70 tot 100% ethanol, gevolgd door één buisje steriel water. Gebruik daarna een hemocytometer om de verdunde cel-suspensies onder een microscoop te kwantificeren.Afhankelijk van het gewenste inoculum, neem 10 µL uit de betreffende microtiterput. Veeg vervolgens het oppervlak van het insect dat geïnjecteerd moet worden af met 95% ethanol. Het is het meest uitdagend om het insect in de juiste positie voor injectie te houden, terwijl de naald wordt gemanipuleerd en erop wordt gelet dat het darmkanaal van het insect niet wordt doorprikt.Werk daarnaast snel, zodat het insect niet opwarmt en begint te bewegen terwijl u het vasthoudt voor de injectie. Injecteer de 10 µL cel-suspensie in het insect onder een hoek van minder dan 45 graden achter een van de pro-poten van het abdomen. Injecteer de inhoud net onder de epidermale laag, waarbij u er zorg voor draagt dat de darm niet wordt doorboord.Nadat elk insect is geïnjecteerd met de eerste bacteriestam, worden de verdunningen van 10⁻² tot 10⁻⁶ opnieuw op de plaat geplaatst, ditmaal in het midden van de plaat. Laat ze naar de onderkant van de plaat vloeien. Incubeer de platen vervolgens bij de juiste temperatuur en tel daarna de koloniën om het inoculum te bepalen.Nadat het verdunnings-, uitplaat- en injectieproces voor elke bacteriestam is herhaald, worden drie tot vijf insecten geïnjecteerd met steriele PBS voor de negatieve controlegroep. Incubeer vervolgens alle insecten bij 26 °C met een fotoperiode van 16 uur licht en 8 uur donker. Monitor tot slot de overleving van de insecten na de injecties; tijdens de infectie vertonen de insecten vaak verlies van eetlust, waterige, gele diarree, uitwerpselen en/of vochtverlies voorafgaand aan de dood.De dood van insecten wordt gekenmerkt door een gebrek aan vrijwillige beweging na stimulatie. In deze assay werden de insecten geïnjecteerd met ongeveer 50 colony forming units van óf het wild-type óf een geattenueerde mutante stam van Xer Haus NLA, opgekweekt tot de midden-logfase. De insecten werden gedurende ongeveer 72 uur geobserveerd en het percentage geïnjecteerde insecten dat op elk tijdstip nog in leven was, werd genoteerd.In dit experiment vertoonde de geattenueerde stam een duidelijke vertraging in het doden van de insecten, terwijl de wild-type stam alle zes de larven binnen 30 uur na injectie doodde, nog voordat een van de geïnfecteerde mutante larven stierf. De gegevens zijn statistisch significant na deze procedure. Andere methoden, zoals RNA-extractie en kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie, kunnen worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het bepalen of de bacterie in staat is om de immuunrespons van het insect te manipuleren.

rearing-injection-manduca-sexta-larvae-to-assess-bacterial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Transparante zebravis embryo's hebben hun nut bewezen model hosts te visualiseren en functioneel onderzoek naar interacties tussen aangeboren immuunsysteem cellen en intracellulaire bacteriële pathogenen,...

Infectie van zebravis embryo&#39;s met intracellulaire bacteriële pathogenen

Mondelinge en intra haemocolic infectie van larven van de grotere...

Het Insect<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Als een krachtige Infectie model te Bacteriële Pathogenese Onderzoek

Source: Bernut, A., et al., Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a protocol for isolating and quantifying Mycobacterium abscessus from an infected zebrafish embryo. The procedure involves embryo euthanasia, tissue lysis, and homogenization to release the bacteria, followed by centrifugation and resuspension in a surfactant buffer. Finally, the bacterial suspension is serially diluted, plated...

Isolation and Cultivation of Bacteria from Zebrafish Embryos to Assess Infection Load

This video demonstrates a method to establish a Mycobacterium bovis infection model in the larvae of the greater wax moth, Galleria mellonella. A bioluminescent strain of Mycobacterium bovis BCG is injected into the hemolymph of the larva to establish infection, and the bioluminescence is measured at predefined intervals to study the progress of infection.

A Technique to Establish a Bacterial Infection Model in Insect Larvae

This video showcases the in vivo bacterial burden measurement using Bacillus Calmette-Guérin, BCG, lux-infected insect larvae. The process involves larval homogenization, treatment with a luciferase substrate, and bioluminescence measurement to determine relative light units that correlate with bacterial burden.

Measurement of the In Vivo Burden of Bacteria Expressing Luciferase in an Insect Larva

Hier bieden wij een gedetailleerd protocol voor een model van de orale toediening met behulp van de larven van de wasmot en hoe te karakteriseren geïnduceerde aangeboren immuunresponsen. Met behulp van dit protocol, zal onderzoekers zonder praktische ervaring kunnen gebruiken de G. mellonella dwangvoeding methode.

Een mondelinge beheermodel voor wasmot te Study Commensal-Induced aangeboren immuunresponsen

Hier presenteren we een protocol om Cricket eieren te injecteren, een techniek die als basismethode dient in vele experimenten in de cricket, inclusief, maar niet beperkt tot, RNA-interferentie en genomische manipulatie.

Het injecteren van gryllus krekel eieren

Dit artikel presenteert een protocol om het effect van individuele muggendarmbacteriën te onderzoeken, inclusief isolatie en identificatie van muggenmuisculivable microben, uitputting van muggendarmen en herintroduceren van een specifieke bacteriesoort.

Een bacteriële orale voedingstest met met antibiotica behandelde muggen

Dit protocol beschrijft micro-injectieprocedures voor Culex quinquefasciatus embryo's die zijn geoptimaliseerd om te werken met CRISPR/Cas9 genbewerkingstools. Deze techniek kan efficiënt site-specifieke, erfelijke, kiembaanmutaties genereren die kunnen worden gebruikt voor het bouwen van genetische technologieën in deze onderbelichte ziektevector.

Embryo micro-injection technieken voor efficiënte site-specifieke mutagenese in Culex quinquefasciatus

Drosophila melanogaster volwassen vliegen zijn uitgebreid gebruikt als modelorganismen om de moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan antimicrobiële aangeboren immuunresponsen van de gastheer en microbiële infectiestrategieën. Om het D. melanogaster larvestadium als aanvullend of alternatief modelsysteem te promoten, wordt een larvale injectietechniek beschreven.

Drosophila melanogaster Larva Injection Protocol

Leer bacteriële virulentie beoordelen in Manduca sexta larven via directe injectie in het hemocoel. Deze methode maakt precieze analyse van gastheer-pathogeen interacties mogelijk voor microbiologisch onderzoek.

Opfok en Injectie van

Meer video's verkennen