Plaque assay voor Murine Norovirus

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van infectieuze neuron norovirusdeeltjes. Dit wordt bereikt door eerst een tienvoudige verdunningsreeks van het virusinoculum voor te bereiden. De tweede stap is het overbrengen van de verdunningen van het virusinoculum naar een raw 2 6 4 0.7 monolaag en het incuberen van de platen onder schudomstandigheden bij kamertemperatuur gedurende één uur.

Aspireer vervolgens het inoculum en breng een overlay aan met een verhouding van één-op-één C plaque agarose en twee XMEM, en incubeer de platen gedurende 48 uur in een weefselkweekincubator. De laatste stap is het aanbrengen van een overlay met neutraalrode kleuringsoplossing en het incubeeren van de platen gedurende één tot drie uur in een weefselkweekincubator. Ten slotte wordt de neutraalrode kleuringsoplossing voorzichtig geaspireerd zonder de agarose-overlay te verwijderen en worden de plaques geteld met behulp van een lichtbak.

Deze methode voor het kwantificeren van infectieuze virusdeeltjes kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het norovirusonderzoek, zoals de hoeveelheid infectieuze deeltjes die via de feces worden uitgescheiden, of welke weefsels infecties ondersteunen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het behouden van gezonde, levensvatbare cellen gedurende de gehele assay. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de plaque-assay voor het mirror-norovirus moeilijk te begrijpen kan zijn voor mensen zonder voorafgaande ervaring.

De succesvolle voltooiing van deze assay is een cumulatieve reeks stappen die de juiste hoeveelheid cellen, de correcte temperatuur en nauwkeurige hantering vereisen om plaques gemakkelijk waar te kunnen nemen. Controleer eerst de cellaag onder een lichtmicroscoop om de morfologie van de cellen te beoordelen. De meeste cellen moeten er rond uitzien.

Zorg ervoor dat de cellen niet overgroeien, aangezien ze dan doorgaans geen plaques vormen. Om een bijna confluente 175 cm² weefselkweekfles met raw 2 6 4 0.7 cellen voor te bereiden voor de murn neurovirus plaque-assay, wordt het medium uit de fles geaspireerd en worden 10 mL verse DMEM 10 aan de cellen toegevoegd. Schraap vervolgens de cellen met een celscraper van de bodem van de fles en gebruik een 10 mL pipette om de celsuspensie op te zuigen en vervolgens tegen de bodem van de fles uit te stoten. Herhaal deze handeling minstens drie keer om eventuele celklonten op te breken.

Om een voorraadkolf te vullen: verwijder één tot twee milliliters cel suspensie en breng dit over in een schone kolf van 175 vierkante centimeter die 33 tot 34 milliliters DMEM 10 bevat. Incubeer de kolf in een weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende twee tot drie dagen en herhaal het proces.

Zodra het complement klaar is om de platen voor de assay in te zaaien, wordt de dichtheid van de celsuspensie aangepast naar 1 x 10⁶ levensvatbare cellen per milliliter in DMEM 10 en worden twee milliliter van deze suspensie aan elke well van een 3,5 centimeter diameter zes-wellplaat toegevoegd; dek de plaat af. Schud de plaat vervolgens onmiddellijk 10 keer met de hand om de cellen gelijkmatig over de wells te verdelen.

Zorg dat de plaat niet bol staat, omdat dit ertoe zal leiden dat de cellen in het midden van de put clusteren. Plaats de plaat vervolgens gedurende minimaal vier uur, of idealiter overnacht, in een weefselkweekincubator om de cellen te laten hechten. Het virusinoculum kan worden verkregen uit MNV-geïnfecteerde gehomogeniseerde weefsels of uit fecesmonsters van MNV-geïnfecteerde muizen. Indien weefselmonsters worden gebruikt, plaats dan een erwtgroot stukje weefsel in een schroefdopbuisje van twee milliliter met steriele silicakralen en één milliliter DMEM 10 en homogeniseer dit.

Een magnetiseerder wordt gebruikt bij 6 000 RPM gedurende één minuut. Indien fecale monsters worden gebruikt, homogeniseer dan niet meer dan drie fecale pellets op dezelfde wijze, vries de gehomogeniseerde monsters in bij minus 80 graden Celsius en ontdooi het inoculum op de dag van de plaque-assay. Gebruik een repeat-pipet om 1,35 milliliter DMEM vijf in elke put van een 24-wells plaat te dispenseren en pipetteer vervolgens 0,15 milliliter van het derde virusinoculum in de eerste put van de plaat.

Voer tienvoudige seriële verdunningen uit door 0,15 milliliter van de eerste 10⁻¹ verdunning op te zuigen en over te brengen naar de tweede well van de plaat voor een verdunning van 10⁻². Herhaal dit proces vervolgens met de verdunning uit de tweede well om te verdunnen tot 10⁻³. Let op dat, afhankelijk van het monster, verdere verdunningen tot 10⁻⁹ noodzakelijk kunnen zijn.

Zodra de seriële verdunningen zijn voorbereid, labelt u de platen met 60 tot 80% confluente raw, 2 64 0.7 cellen met de monsternamen en de gebruikte verdunning. Verwijder vervolgens al het medium uit een van de platen door middel van aspiratie of door deze leeg te schudden en voeg 0.5 milliliters van een verdund monster toe aan een well. Herhaal dit met een dubbele well en ga vervolgens over naar de volgende lagere verdunning.

Zodra alle drie de verdunningen in dubbeltoevoeging aan één plaat zijn toegevoegd, wordt de plaat heen en weer gekanteld om ervoor te zorgen dat alle cellen bedekt zijn. Herhaal de procedure met de volgende plaat cellen. Wanneer alle platen zijn behandeld, worden deze gedurende één uur bij kamertemperatuur op een schudapparaat geplaatst dat is ingesteld op ongeveer 18 oscillaties per minuut; verwarm een fles vooraf bereide en/of geautoclaveerde agar in de magnetron tot deze gesmolten is.

Plaats vervolgens de gesmolten agarose in een waterbad van 42 °C om de temperatuur te equilibreren. Meng daarna de gesmolten agarose in een steriele fles in een verhouding van één-op-één met steriel 2X MEM-medium. Plaats de fles met deze overlay-oplossing in een waterbad van 37 °C tot gebruik.

Aspireren na het einde van de incubatie van één uur het inoculum uit elke put en voeg langzaam twee milliliters van de overlay-oplossing toe aan elke put, waarbij wordt gewaarborgd dat de pipetpunt tegen de wand van elke put is geplaatst. Om te voorkomen dat de cellen loslaten, worden de platen afgedekt en krijgt de overlay ongeveer 10 minuten de tijd om te stollen bij kamertemperatuur. Plaats de platen vervolgens gedurende 48 uur in de weefselkweekincubator.

Controleer de platen na de incubatieperiode op de aanwezigheid van plaques. Als er geen plaques zichtbaar zijn, plaats de platen dan terug in de incubator en controleer ze na vier uur opnieuw. Herhaal deze procedure indien nodig, maar de incubatietijd mag 72 uur niet overschrijden.

Bereid eerst de neutraalrood-kleuringsoplossing. Voeg vervolgens twee milliliters neutraalrood-oplossing toe aan elke put; voor dit protocol hoeft de aros-plug niet te worden verwijderd. Incubeer de platen gedurende één uur bij 37 °C.

Nadat de incubatietijd is verstreken, controleert u de platen op de aanwezigheid van plaques terwijl de neutrale rode oplossing in de putjes blijft. Als er geen kleuring zichtbaar is, incubeert u de platen nog een uur, tot een maximum van drie uur. Zodra de plaques zichtbaar zijn, aspireert u de neutrale rode oplossing, waarbij u erop let dat de plug niet wordt verstoord, en gaat u vervolgens over tot het tellen van de plaques.

Inspecteer de platen en bepaal de verdunning waarbij de plaques duidelijk gescheiden zijn. Plaats de plaat op een lichtbak en tel de plaques, waarbij u een stip plaatst op de getelde plaques om dubbeltellingen te voorkomen.

Herhaal vervolgens de telling in een put met een andere verdunning van het virus en bereken de virustiter in plaque-vormende eenheden per milliliter. Conform de instructies in het schriftelijke protocol toont deze representatieve afbeelding een monolaag vóór infectie. De ruwe 2 6 4 0.7 cellen werden gedurende de nacht gekweekt en gefotografeerd onder een lichtmicroscoop bij een 20-voudige vergroting.

Deze afbeelding toont dezelfde monoclaag na de vorming van plaques. Cellen werden na 48 uur infectie gekleurd met een 0,01% neutrale rode oplossing en gevisualiseerd onder een lichtmicroscoop bij een viervoudige vergroting. De Romeinse cijfers één, twee en drie duiden drie zichtbare plaques aan.

Deze afbeelding toont een plaat aan het einde van het plaque-assay-protocol met dubbele putjes van drie tienvoudige verdunningsstappen, aangeduid met Romeinse cijfers. Eén en vier komen overeen met de 10⁻¹ verdunning, twee en vijf komen overeen met de 10⁻² verdunning en drie en zes komen overeen met de 10⁻³ verdunning.

De virustiter van het monster staat hieronder aangegeven. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de pipetpunten tussen de verdunningen te wisselen om kruiscontaminatie tussen monsters te voorkomen, de oplossingen te equilibreren naar de juiste temperatuur en te voorkomen dat cellagen uitdrogen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een plaque-assay uitvoert en infectieuze mi neurovirus-partikels kwantificeert.

Vergeet niet dat er bij het werken met Mira Norovirus in een biologische veiligheidskabinet altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en een laboratoriumjas tijdens het uitvoeren van deze procedure, en dat afval correct moet worden afgevoerd volgens de richtlijnen die zijn vastgesteld door uw lokale commissie voor biologische veiligheid.