Name: Plaque assay voor Murine Norovirus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Leer een plaque-assay voor kwantificering van infectieuze Murine Norovirus-deeltjes met behulp van RAW 264.7-cellen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar norovirusinfecties en transmissiedynamiek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de leden van de Wobus laboratorium voor kritische opmerkingen en suggesties. Werken in het laboratorium van CEW werd gefinancierd door het opstarten fondsen van de Universiteit van Michigan, een loopbaanontwikkeling subsidie ​​van de NIH / NIAID Regional Center of Excellence voor Bio-verdediging en Emerging Infectious Diseases Research (RCE) Programma, Regio V &#39;Grote Meren &#39;RCE (NIH award 1-U54-AI-057153) en NIH R01 AI080611. MBG-H. werd gefinancierd door de Experimentele Immunologie (NIH T32 A1007413-16) en de moleculaire mechanismen in Microbiële Pathogenese (NIH T32 A1007528) opleiding subsidies aan de Universiteit van Michigan. JBC werd gefinancierd door Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nivel Superior (CAPES), Brasilia, Brazilië.

1. Kweken van de macrofaagcellijn RAW 264.7 <ol><li> Handhaven RAW 264.7 cellen (ATCC, catalogus # TIB-71) in DMEM-10 media, die hoge glucose DMEM bestaat met 10% (v / v) laag-endotoxine foetaal bovine serum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES , 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 1 mM niet-essentiële aminozuren, 2 mM L-glutamine. Cellen worden kenmerkend gehandhaafd in 175 cm2 weefselkweek kolven met 35 ml per kolf van media en geïncubeerd bij 37 ° C en 5% CO2 in een weefselcultuurincubator. Echter, elke grootte kolf worden gebruikt met een volume van media die geschikt is voor de grootte van de kolf. </li><li> Om cellen te splitsen: zuigen van de oude media, 10 ml vers DMEM-10 medium aan de cellen en schraap de cellen van de bodem van de kolf met een celschraper. Vervolgens resuspendeer de cellen in een homogene oplossing door het opstellen van cellen in een 10 ml pipet en krachtig knijpen de cellen door de pipetpunt prEssed tegen de bodem van de kolf. Herhaal deze actie minstens 3 keer zodat de cellen niet meer samenklonteren. Controleren door lichtmicroscopie dat een enkele celsuspensie werd gegenereerd. Vervolgens over 1 ml (1:10 verdunning of 1x10 ~ 7-cellen) - 2 ml (1:5 verdunning of 2x10 ~ 7-cellen) van de celsuspensie in nieuw 175 cm2 kolf en breng het eindvolume van media tot 35 ml. </li><li> Split cellen wanneer ze bijna confluent (~ 1x10 8 cellen total/175 cm 2 flessen): om de drie dagen als te beginnen met een 1:10 verdunning, of om de twee dagen als te beginnen met een 1:5 verdunning. Gebruik lichtmicroscopie naar cel morfologie te controleren voordat splitsen cellen. Meeste cellen moet er rond en niet geactiveerd. Geactiveerde cellen hebben korrels en / of uitgebreid, spichtige morfologie met aanhangsels. Laat geen cellen overwoekeren als die cellen meestal niet vormen plaques. Blijf op de hoogte van de passage aantal en vaak opnieuw te beginnen door het ontdooien van een lagere passage aliquot van cellen. (Wij gebruiken doorgang 30 als cut-off). </li></ol> 2. Infect RAW 264.7 cellen met MNV Inoculum <ol><li> Seed RAW 264.7 cellen in 6-well platen (3,5 cm diameter) bij een dichtheid van 1x10 6 levensvatbare cellen / ml in DMEM-10 medium en voeg 2 ml van deze suspensie aan elk putje. Het is belangrijk om cellen gelijkmatig te verdelen in wells platen hetzij door schommelen hand minstens 10 keer of te keren inrichting voor ~ 10 min. Niet werveling de platen omdat dit de cellen veroorzaken cluster in het midden van de put. Plaats de platen in een weefselcultuurincubator (bij 37 ° C en 5% CO2). Toestaan ​​cellen overnacht of ten minste 4 uur hechten bij 37 ° C. Cellen moeten 60 - 80% confluent de plaque assay en gelijkmatig verdeeld over de put. </li><li> De volgende dag bereiden virus inoculum, die kan bestaan ​​uit MNV-geïnfecteerde cellen in weefselkweek of uit gehomogeniseerde weefsels of fecale monsters van MNV-geïnfecteerde muizen. Bij het gebruik van weefselmonsters, grootte van een erwt pieces weefsel worden gehomogeniseerd in 2 ml buizen met schroefdop met steriele silicapareltjes in 1 ml DMEM-10 met een tissue homogenisator (bijvoorbeeld MagnaLyser, Roche). Voor fecale monsters moeten niet meer dan 3 fecale pellets worden gehomogeniseerd in 1 ml media. Alle monsters worden vervolgens ingevroren (bij -80 ° C) en eenmaal ontdooid alvorens de plaque assay. </li><li> Bereid 10-voudige verdunningen van het virus inoculum in volledig DMEM-5 medium, dat bestaat uit DMEM / hoge glucose, 5% (v / v) laag-endotoxine foetaal bovine serum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 1 mM niet-essentiële aminozuren, 2 mM L-glutamine. </li><li> Tienvoudige seriële verdunningen bereid in 24-well platen: een repeater pipet wordt gebruikt om 1,35 ml media afvullen in meerdere putjes, wordt de 10 -1 verdunning gemaakt door het mengen van 1,35 ml media en 0,15 ml virus-bevattend monster, en dan 0,15 ml van de 10 -1 verdunning toegevoegd aan 1,35 ml van de media 10 -2 dilutio makenn enzovoort. Het is belangrijk om te veranderen tips elke keer dat u een nieuwe verdunning. Een meerkanaalspipet kan worden gebruikt om de verdunningen van meerdere monsters tegelijkertijd maken met twee uiteinden passen in een putje van een plaat met 24 putjes overbrengen van een totaal volume van 0,15 ml per putje (zie Figuur 3A). </li><li> Een typische verdunningsreeks van weefselhomogenaten en fecale inhoud is 10 -1-10 -3. Echter plaques uit deze monsters meestal kleiner in vergelijking met die van weefselkweek monsters. Bovendien zijn in sommige gevallen een 1:100 verdunning van fecale monsters nodig om voldoende verdunnen van toxische componenten van de ontlasting die de celmonolaag kunnen verstoren worden, waardoor het vermogen om plaques tellen. De verdunningsreeks van weefselkweek lysaten hangt af van het tijdstip van de rente tijdens de virale levenscyclus. Verdunningen die oplopen tot 10 -9 kan nodig op het hoogtepunt van infectie. </li><li> Nadat de seriële verdunningen worden bereid, op het etiket van 6-well plaats met RAW 264,7 monolagen (uit sectie 2.1) met het monster naam en verdunningen zijn verguld. Een plaat op een moment, verwijder dan alle media door de knop het uit of opzuigen het. Onmiddellijk daarna voeg 0,5 ml van een verdunde monster tot een goed, dan herhalen met een duplicaat goed, alvorens over te gaan naar de volgende verdunning. Zodra alle 3 verdunningen worden toegevoegd aan een plaat, kantel de plaat heen en weer met de hand om ervoor te zorgen alle cellen zijn afgedekt. Behandel een plaat op een moment om ervoor te zorgen dat de cellen niet zal uitdrogen. </li><li> Na toevoegen van 0,5 ml van de verdunningen aan elk putje opstaande stapel platen en incubeer ze 1 uur bij kamertemperatuur. Omdat het volume aan elk putje toegevoegd is niet voldoende om de monolaag volledig te bedekken, de platen moeten voorzichtig worden heen en weer bewogen hand elke 10-15 minuten of op een schommelende inrichting (~ 18 trillingen per min). Dit voorkomt dat cellen uitdrogen. </li></ol> 3. Low Melting Point Agarose (SeaPlaque) Bereiding Overlay <ol><li> Bereken de hoeveelheid overlay benodigd voor het totale volume van platen voor 1 uur incubatie is voltooid. De benodigde volume is 2 ml / putje of 12 ml/6-well plaat. Bereid agarose (zie paragraaf 3.2) en de media (zie paragraaf 3.3) afzonderlijk. </li><li> De agarose bereiden schorsen 3 g SeaPlaque agarose in een totaal volume van 100 ml gedestilleerd water (3% w / v) in een glazen fles. Autoclaaf gedurende 20-30 min. (Als agarose reeds tevoren bereid, re-melt agarose in magnetron.) Het is belangrijk SeaPlaque agarose equilibreren tot 42 ° C in een waterbad voor gebruik want als de agarose te heet, zal doden cellen. Zorg ervoor dat het waterpeil gelijk is aan of boven het niveau van de agarose om ongewenste stolling te voorkomen. </li><li> De media bereiden: maak 100 ml 2x MEM media, bestaande uit2x MEM, 10% (v / v) laag-endotoxine foetaal bovine serum (&lt;10 EU / ml), 10 mM HEPES, 100 U / ml penicilline, 100 ug / ml streptomycine, 4 mM L-glutamine. Equilibreren media tot 37 ° C in een waterbad. </li><li> Meng beide SeaPlaque agarose en 2x MEM media samen in een steriele fles van 1:1 vlak voor die over de geïnfecteerde celmonolagen. Indien meer dan 200 ml overlay nodig, split verdelen in meerdere flessen en houden 37 ° C waterbad tot gebruik. </li><li> Aan het einde van de een uur incubatie (zie paragraaf 2.7), zuig de inoculum off van elk putje. Voeg langzaam 2 ml overlay aan de rand van elk putje Door de pipetpunt tegen de wand van elk putje. Tot 5 platen kunnen parallel worden verwerkt zonder cellen drogen. </li><li> Laat de overlay ongeveer 10 minuten bij kamertemperatuur stollen voordat platen rechtop in de weefselkweekincubator. Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Nade incubatietijd, plaques zijn vaag zichtbaar met het blote oog, dus check ongekleurde platen op de aanwezigheid van plaques. Als er geen plaques zichtbaar zijn, incubeer voor een extra 4 uur en controleer opnieuw. Evenwel de maximale incubatietijd niet langer dan 72 uur. </li></ol> 4. Visualisatie van Plaques door Neutral Red kleuring <ol><li> Om plaques te visualiseren, is de neutrale rode kleuring bereid door toevoeging van 3 ml neutraalrood (0,33% w / v in DPBS, Sigma, catalogus # N2889) elk 97 ml van 1x PBS (weefselkweek bestemde, Mg2 + -, Ca 2 + - gratis; Gibco, catalogus # 10010). Bereken de hoeveelheid neutraal rood kleuring oplossing nodig voor het experiment: 12 ml neutraalrood kleuroplossing nodig zijn voor elke 6-well plaat. Voeg vervolgens 2 ml in elk putje. Hoewel sommige plaque assay protocollen vereisen agarose plug te verwijderen uit de putjes, in dit protocol de neutrale rode kleuring oplossing wordt rechtstreeks toegevoegd aan de overlay. </li><li> Na een uur incubation bij 37 ° C, controleren of plaques zichtbaar met neutraal rood kleuroplossing nog in putten. Als plaques niet zondermeer duidelijk is, zodat de kleuring nog voor een uur. Ga verder incuberen tot plaques zichtbaar zijn. (Opmerking:. Kleuring voor meer dan 3 uur niet optimaal is en als er geen plaques zichtbaar in de positieve controle monster na 3 uur kleuring van de plaque assay werkte niet goed) na de kleuring is voltooid, zuig de neutrale rode kleuroplossing , het waarborgen van de agarose stekker is niet gestoord, en ga verder met het tellen van de plaques. </li><li> Count plaques door het plaatsen van bord ondersteboven op een lichtbak en het markeren van een stip op gerekend plaques om dubbele tellingen te vermijden. Kies de verdunning tot plaques tellen in putten waar plaques duidelijk gescheiden zijn (samen dus geen visueel bewijs van plaques fusing). Indien mogelijk, telt plaques op twee verdunningen. Het is belangrijk op te merken dat plaque kan variëren tussen MNV stammen, virusinoculum en afhankelijk van deconditie van de RAW 264.7 cellen gedurende de plaque assay. </li><li> Als er geen plaques zichtbaar in een put, hetzij er geen virus in het monster of de hoeveelheid virus was onder de detectiegrens van de plaque assay. In dit geval de putjes vlek rood met dezelfde kleur als andere plaque bevattende wells. Als alternatief wordt het ontbreken van plaques ook waargenomen wanneer er te veel virale deeltjes in een bepaalde verdunning. Dit leidt tot lysis van de hele monolaag en putten weergegeven oranje / geel. </li><li> Bereken virale titers. Voeg het aantal plaques in beide putten bij een enkele verdunning en vermenigvuldigen met de verdunningsfactor (dwz 1 ml als 2 waterputten besmet zijn met 0,5 ml). Dit levert de hoeveelheid plaque vormende eenheden (PFU) in inoculum volume van 1 ml. Bijvoorbeeld, in figuur 4 aan het 10 -2 verdunning, een putje (aangeduid met &quot;II&quot;) heeft 14 plaques en andere goed (gemarkeerd &quot;V&quot;) heeft 17 plaques. Zo zal de virale titer te 14x10 2 + 2 = 17x10 3100 (3.1x10 3) pfu / ml. </li></ol> 5. Representatieve resultaten MNV-1 infectieuze deeltjes kunnen worden gekwantificeerd met een plaque assay zoals schematisch in figuur 1. Figuur 2A toont een put met een monolaag van RAW 264.7 cellen vlak voor infectie, terwijl Figuur 2B toont drie zichtbare plaques aangeduid door Romeinse cijfers I, II en III in een put. Individuele stappen van de bepaling worden weergegeven in Figuren 3A tot F. Figuur 3A toont de bereiding van de 10-voudige verdunningsreeks van een virus-bevattend monster. Figuur 3B toont de overdracht van verdunningen aan putjes van een 6-wells plaat dupliceren. Figuur 3C toont de rocking apparatuur voor RAW 264.7 cellen incuberen met het inoculum bij kamertemperatuur gedurende 1 uur Figuur 3D toont cellen wordt bedekt met een SeaPlaque:. MEMmengsel. Figuur 3E toont een plaat bij kamertemperatuur om de overlay te stollen, terwijl figuur 3F toont cellen worden gekleurd met een 0,01% neutraal rood oplossing 48 uur later. Na gekleurde cellen gedurende 1-3 uur en afzuigen van het neutraal rood kleuroplossing, plaques zichtbaar en kunnen worden geteld (figuur 4). <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig1.jpg" /> Figuur 1. Schema van de MNV plaque assay protocol. <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig2.jpg" /> Figuur 2. Representatieve beelden van een putje van een monolaag voorafgaand aan infectie en na de vorming van plaques. A) RAW 264.7 cellen werden overnacht gekweekt en afgebeeld onder een lichtmicroscoop bij 20x vergroting. B) Cellen werden gekleurd met een 0,01% neutraal rode oplossing na 48 uurr van infectie en gevisualiseerd onder een lichtmicroscoop met 4x vergroting. Romeinse cijfers I, II, en III geven drie zichtbare plaques. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig3.jpg" /> Figuur 3. Representatieve beelden van de verschillende plaque assay stappen. A) MNV-1 inoculum bereid in 10-voudige verdunningen. B) Inoculum toegevoegd aan celmonolagen in duplo. C) Cellen en inoculum worden door tuimelen geïncubeerd gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. D) cellen bedekt met een 1:1 mengsel van SeaPlaque agarose en 2x MEM media. E) De platen worden gedurende 10 min bij kamertemperatuur om de overlay te stollen. F) kleuring van cellen met de neutrale rode kleuroplossing 48 uur na infectie. <img alt="Figuur 4" src="/files/ftp_upload/4297/4297fig4.jpg" /> Figuur 4. MNV-1 vormen plaques in cellen monolayers. Hier is een representatieve plaque assay plaat 48 uur na infectie met plaques gekleurd met neutraal rood kleuroplossing na 1 uur incubatie. De plaat toont duplo van drie 10-voudige verdunningen. Wells gemerkt met Romeinse cijfers I en IV overeenkomen met de 10-1 verdunning; II en V overeen met de 10-2 verdunning; III en VI overeenkomen met de 10-3 verdunning. De virale titer van het monster wordt hieronder aangegeven (zie rubriek 4.5 voor meer informatie over de berekening).

<ol><li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432(2004).</li>
<li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+norovirus%3A+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li>
<li>Condit, R. C. Ch. 2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCondit%2C+RC+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. 1, Lippincott Williams & Wilkins. 25-58 (2007).</li>
<li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li>
<li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+estimating+50%25+endpoints%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Hygiene%22%5BJournal%5D)">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li>
<li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li>
<li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435(2011).</li>
<li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Virology+journal%22%5BJournal%5D)">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196(2009).</li>
<li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plaque+assay+of+animal+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Virus+Res%22%5BJournal%5D)">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li>
<li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li>
<li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

De plaque assay methode voor het MNV-1 hier gepresenteerde is een manier van kwantificeren besmettelijke MNV deeltjes. Door de assay stappen in fig. 3 verkrijgt men reproduceerbaar virale titers. De detectiegrens van de test afhankelijk van de gebruikte uitgangsmaterialen verdunning. Bij het ​​starten met een 1:10 verdunning van monster zoals hierboven beschreven, de detectiegrens van de plaque assay is 10 pfu (dwz 1 plaque zichtbaar op 10 -1 verdunning). Aangezien elke plaque vertegenwoordigt een virus kan de plaque assay worden gebruikt om klonale populaties van MNV zuiveren door plukken geïsoleerde plaques en teeltmateriaal ze als eerder beschreven 1. Daarnaast kan plaquezuiveringen ook worden gebruikt om een ​​individueel viruspopulatie scheiden van gemengde populaties virus. Een beperking van het gebruik van een plaque assay voor de detectie van MNV infectie is dat niet alle stammen MNV vormen plaques 4. Het kan echter mogelijk zijn de inabili overwinnenty van sommige MNV stammen, geïsoleerd uit dieren, tot plaques te vormen door serieel passage deze virussen in weefselkweek 7. Een alternatief voor de plaque assay is het meten van infectieuze deeltjes via de TCID50 techniek 3, 4. Deze assay kwantificeert de hoeveelheid virus vereist om CPE in 50% produceren voedingsbodem weefselkweekcellen na eindpunt verdunningen en duurt 1 week te vullen voor MNV 4. Naast het feit dat langzamer dan een plaque assay, de TCID 50 assay is niet zo gevoelig (detectielimiet = 200 TCID50 / ml) door de toxiciteit van weefselmonsters te RAW 264.7 cellen 4. Hoewel kritische stappen in het protocol zijn beschreven in heel het protocol worden de volgende sectie vindt u een overzicht aan trouble shooting vergemakkelijken. De belangrijkste stap in het protocol is dat RAW 264.7 cellen levensvatbaar blijven gedurende de test om virusreplicatie te ondersteunen. Dit kanworden gecontroleerd in elk stadium van de assay via lichtmicroscopie. Levensvatbaarheid van de cellen is gewaarborgd twee manieren. Ten eerste moet erop worden gelet niet te laten cellen uitdrogen tijdens het hanteren van platen. Aldus worden de platen geënt met een tegelijk, geschud gedurende infectie periode en blijven gesloten wanneer ze niet worden behandeld. Tweede oplossingen toegevoegd aan cellen moet geëquilibreerd tot ~ 37 ° C. Verder is het van vitaal belang voor de algehele gezondheid van de RAW 264.7 cellen om ze te handhaven in media die lage endotoxine serum (&lt;10 EU / ml), die de activering van cellen beperkt. Bovendien hebben we waargenomen een hoger percentage mislukkingen van de plaque assay bij gebruik van cellen van passage 30 of hoger. Hoewel dit zal waarschijnlijk variëren van lab tot lab, is het belangrijk om een positieve controle omvatten (bijvoorbeeld een monster met een bekende virale titer) reproduceerbaar titers waarborgen, met name bij gebruik van hogere passage RAW 264.7 cellen. Beperken van hogere passage cellen, is het raadzaam om bevriezing flacons eerste passage cellen na ontvangst van RAW 264.7 cellen en start een nieuwe cultuur uit de bevroren flesjes vaak. Starting over met een lage doorgang celculturen zal ook nuttig zijn wanneer de cellen vertonen veranderde kenmerken, zoals het niet in acht, veranderingen in cel morfologie (bijv. van rond tot spichtig en verspreid), of wanneer mycoplasma besmetting is aangetroffen. Een ander belangrijk punt om aandacht te besteden aan is ervoor te zorgen dat de pipetpunten worden gewijzigd tussen monsters en tijdens de verdunningen. Dit zal zorgen voor nauwkeurige seriële verdunningen en het voorkomen van kruisbesmetting tussen de monsters. De een stap in de protocol waarin dezelfde pipetpunt opnieuw kan worden gebruikt wanneer seriële verdunningen van hetzelfde monster worden toegevoegd aan putjes. In dat geval moet worden uitgegaan van de meest verdunde inoculum op zijn zachtst, en krachtig pipetteren op en neer bij het opstellen van een nieuwe verdunning. De plaque assay protocol is amendeerbaar verschillende wijzigingen. Een wijziging kan worden gemaakt wanneer thier niet genoeg cellen voor enten putjes in duplo is slechts een goed inoculeren voor elke verdunning. Aangezien het inoculum volume is 0,5 ml, het aantal plaques Vervolgens moet worden vermenigvuldigd met een factor 2 tot normaliseren pfu / ml. De plaque assay kan ook worden aangepast voor gebruik met andere hechtende cellijn die in staat is om replicatie van MNV ondersteunen, en dit is beschreven voor de murine microgliacellen BV-2 cellijn 8. Andere modificaties die kunnen worden toegepast zijn aanpassingen die zijn beschreven voor plaque assay protocollen ontwikkeld voor andere virussen. Bij MNV zijn de volgende wijzigingen reeds met succes toegepast, het gebruik van methylcellulose plaats van Sea Plaque agarose 9 en kleuring van cellen met kristalviolet of methyleenblauw in plaats van neutraal rood 10, 11. Overall, dit protocol gemakkelijk worden aangepast zoals nodig om andere plaquevormende virussen kwantificeren of voor other virussen die lytische infecties in RAW 264.7 cellen veroorzaken, waardoor het een nuttig instrument om infectieuze virale deeltjes in het algemeen te kwantificeren.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> DMEM / Hoge glucose </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2x MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100x penicilline en streptomycine </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 mM niet-essentiële aminozuren </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 mM (100x) L-glutamine </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum </td><td> Gibco, Hyclone </td><td> 10437, SH30070.02 </td></tr><tr><td> Sea Plaque Agarose </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> Neutraal rood 0,33% </td><td> Sigma </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1x PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1,0 mm Zirconia / silicapareltjes </td><td> Biospec Producten </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> Model 35 Speed ​​Rocker </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> Magna Lyser Instrument </td><td> Roche </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> Raw 264,7 cellijn </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> Weefselkweek incubator </td><td> Sanyo </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay voor murine norovirus

Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine Norovirus (MNV) is het enige lid van de Norovirus geslacht die efficiënt groeit in weefselkweek 1, 2. Cellysis en cytopathische effect (CPE) worden waargenomen tijdens MNV-1 infectie van murine dendritische cellen of macrofagen 1. Deze eigenschap van MNV-1 kan worden gebruikt om het aantal van infectieuze deeltjes in een monster te kwantificeren door het uitvoeren van een plaque assay 1. De plaque assay gebaseerd op het vermogen van MNV-1 cellen te lyseren en gaten vormen in een confluente monolaag van cellen, de zogenaamde plaques 3. Meerdere technieken kunnen worden gebruikt om virale infecties te detecteren in weefselkweek, geoogst weefsel, klinische en milieumonsters, maar niet alle meten het aantal infectieuze deeltjes (bijvoorbeeld qRT-PCR). Een manier om infectieuze virusdeeltjes kwantificeren is via een plaque assay 3, die hieronder zal worden beschreven in detail. Een variatie op de MNV plaque assay is de fluorescent nadruk assay, waarbij MNV antigeen immunogekleurd in celmonolagen 4. Deze test kan sneller, omdat viraal antigeen expressie voorafgaat plaquevorming. Het is ook nuttig voor titreren virussen geen plaques vormen. De nadruk fluorescent assay vereist aanvullende middelen dan die van de plaque assay, zoals antilichamen en een microscoop voor focus-vormende eenheden telt. Infectieuze MNV kan ook worden gekwantificeerd door bepaling van de 50% Tissue Culture infectieuze dosis (TCID50) 3. Deze test meet de hoeveelheid virus vereist om CPE in 50% produceren voedingsbodem weefselkweekcellen door titratie eindpunt 5. Echter, de detectiegrens is hoger dan een plaque assay 4. In dit artikel beschrijven we een plaque assay protocol dat gebruikt kan worden om feite het aantal infectieuze MNV deeltjes aanwezig in biologische of milieumonsters 1, 4, 6. Deze methode is based de bereiding van 10-voudige seriële verdunningen van MNV bevattende monsters, die gebruikt worden om een ​​monolaag van permissieve cellen (RAW 264.7 muis macrofaagcellen) te inoculeren. Virus mag aan de celmonolaag hechten gedurende een bepaalde tijd en vervolgens afgezogen voor die cellen met een mengsel van agarose en celkweekmedia. De agar maakt de verspreiding van virale nakomelingen naar naburige cellen terwijl het beperken van verspreiding naar de verte gelegen cellen. Bijgevolg worden geïnfecteerde cellen gelyseerd en vorm gaten in de monolaag plaques genoemd. Bij voldoende spreiding van virus, plaques zichtbaar volgende kleuring van cellen met kleurstoffen, zoals neutraal rood, methyleenblauw of kristalviolet. Bij lage verdunningen, elke plaque afkomstig is van een besmettelijke virale deeltje en zijn nakomelingen, die verspreid naar naburige cellen. Zo tellen van het aantal plaques kan men berekenen plaque-vormende eenheden (PFU) in het onverdunde monster 3.

Hier beschrijven we een methode om infectieuze deeltjes van murine norovirus (MNV), de enige norovirus die efficiënt repliceert in celkweek kwantificeren. De plaque assay maakt gebruik van tropisme MNV voor murine macrofagen en kan worden aangepast voor gebruik met biologische of milieumonsters met MNV.

Plaque assay voor Murine Norovirus

Muisnorovirus (MNV) is het enige lid van het genus Norovirus dat efficiënt groeit in weefselkweek 1, 2. Cellysis en cytopathisch effect (CPE) zijn ...

Het algemene doel van deze procedure is het kwantificeren van infectieuze neuron norovirusdeeltjes. Dit wordt bereikt door eerst een tienvoudige verdunningsreeks van het virusinoculum voor te bereiden. De tweede stap is het overbrengen van de verdunningen van het virusinoculum naar een raw 2 6 4 0.7 monolaag en het incuberen van de platen onder schudomstandigheden bij kamertemperatuur gedurende één uur.Aspireer vervolgens het inoculum en breng een overlay aan met een verhouding van één-op-één C plaque agarose en twee XMEM, en incubeer de platen gedurende 48 uur in een weefselkweekincubator. De laatste stap is het aanbrengen van een overlay met neutraalrode kleuringsoplossing en het incubeeren van de platen gedurende één tot drie uur in een weefselkweekincubator. Ten slotte wordt de neutraalrode kleuringsoplossing voorzichtig geaspireerd zonder de agarose-overlay te verwijderen en worden de plaques geteld met behulp van een lichtbak.Deze methode voor het kwantificeren van infectieuze virusdeeltjes kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen binnen het norovirusonderzoek, zoals de hoeveelheid infectieuze deeltjes die via de feces worden uitgescheiden, of welke weefsels infecties ondersteunen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode moeite hebben met het behouden van gezonde, levensvatbare cellen gedurende de gehele assay. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de plaque-assay voor het mirror-norovirus moeilijk te begrijpen kan zijn voor mensen zonder voorafgaande ervaring.De succesvolle voltooiing van deze assay is een cumulatieve reeks stappen die de juiste hoeveelheid cellen, de correcte temperatuur en nauwkeurige hantering vereisen om plaques gemakkelijk waar te kunnen nemen. Controleer eerst de cellaag onder een lichtmicroscoop om de morfologie van de cellen te beoordelen. De meeste cellen moeten er rond uitzien.Zorg ervoor dat de cellen niet overgroeien, aangezien ze dan doorgaans geen plaques vormen. Om een bijna confluente 175 cm² weefselkweekfles met raw 2 6 4 0.7 cellen voor te bereiden voor de murn neurovirus plaque-assay, wordt het medium uit de fles geaspireerd en worden 10 mL verse DMEM 10 aan de cellen toegevoegd. Schraap vervolgens de cellen met een celscraper van de bodem van de fles en gebruik een 10 mL pipette om de celsuspensie op te zuigen en vervolgens tegen de bodem van de fles uit te stoten. Herhaal deze handeling minstens drie keer om eventuele celklonten op te breken.Om een voorraadkolf te vullen: verwijder één tot twee milliliters cel suspensie en breng dit over in een schone kolf van 175 vierkante centimeter die 33 tot 34 milliliters DMEM 10 bevat. Incubeer de kolf in een weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2 gedurende twee tot drie dagen en herhaal het proces.Zodra het complement klaar is om de platen voor de assay in te zaaien, wordt de dichtheid van de celsuspensie aangepast naar 1 x 10⁶ levensvatbare cellen per milliliter in DMEM 10 en worden twee milliliter van deze suspensie aan elke well van een 3,5 centimeter diameter zes-wellplaat toegevoegd; dek de plaat af. Schud de plaat vervolgens onmiddellijk 10 keer met de hand om de cellen gelijkmatig over de wells te verdelen.Zorg dat de plaat niet bol staat, omdat dit ertoe zal leiden dat de cellen in het midden van de put clusteren. Plaats de plaat vervolgens gedurende minimaal vier uur, of idealiter overnacht, in een weefselkweekincubator om de cellen te laten hechten. Het virusinoculum kan worden verkregen uit MNV-geïnfecteerde gehomogeniseerde weefsels of uit fecesmonsters van MNV-geïnfecteerde muizen. Indien weefselmonsters worden gebruikt, plaats dan een erwtgroot stukje weefsel in een schroefdopbuisje van twee milliliter met steriele silicakralen en één milliliter DMEM 10 en homogeniseer dit.Een magnetiseerder wordt gebruikt bij 6 000 RPM gedurende één minuut. Indien fecale monsters worden gebruikt, homogeniseer dan niet meer dan drie fecale pellets op dezelfde wijze, vries de gehomogeniseerde monsters in bij minus 80 graden Celsius en ontdooi het inoculum op de dag van de plaque-assay. Gebruik een repeat-pipet om 1,35 milliliter DMEM vijf in elke put van een 24-wells plaat te dispenseren en pipetteer vervolgens 0,15 milliliter van het derde virusinoculum in de eerste put van de plaat.Voer tienvoudige seriële verdunningen uit door 0,15 milliliter van de eerste 10⁻¹ verdunning op te zuigen en over te brengen naar de tweede well van de plaat voor een verdunning van 10⁻². Herhaal dit proces vervolgens met de verdunning uit de tweede well om te verdunnen tot 10⁻³. Let op dat, afhankelijk van het monster, verdere verdunningen tot 10⁻⁹ noodzakelijk kunnen zijn.Zodra de seriële verdunningen zijn voorbereid, labelt u de platen met 60 tot 80% confluente raw, 2 64 0.7 cellen met de monsternamen en de gebruikte verdunning. Verwijder vervolgens al het medium uit een van de platen door middel van aspiratie of door deze leeg te schudden en voeg 0.5 milliliters van een verdund monster toe aan een well. Herhaal dit met een dubbele well en ga vervolgens over naar de volgende lagere verdunning.Zodra alle drie de verdunningen in dubbeltoevoeging aan één plaat zijn toegevoegd, wordt de plaat heen en weer gekanteld om ervoor te zorgen dat alle cellen bedekt zijn. Herhaal de procedure met de volgende plaat cellen. Wanneer alle platen zijn behandeld, worden deze gedurende één uur bij kamertemperatuur op een schudapparaat geplaatst dat is ingesteld op ongeveer 18 oscillaties per minuut; verwarm een fles vooraf bereide en/of geautoclaveerde agar in de magnetron tot deze gesmolten is.Plaats vervolgens de gesmolten agarose in een waterbad van 42 °C om de temperatuur te equilibreren. Meng daarna de gesmolten agarose in een steriele fles in een verhouding van één-op-één met steriel 2X MEM-medium. Plaats de fles met deze overlay-oplossing in een waterbad van 37 °C tot gebruik.Aspireren na het einde van de incubatie van één uur het inoculum uit elke put en voeg langzaam twee milliliters van de overlay-oplossing toe aan elke put, waarbij wordt gewaarborgd dat de pipetpunt tegen de wand van elke put is geplaatst. Om te voorkomen dat de cellen loslaten, worden de platen afgedekt en krijgt de overlay ongeveer 10 minuten de tijd om te stollen bij kamertemperatuur. Plaats de platen vervolgens gedurende 48 uur in de weefselkweekincubator.Controleer de platen na de incubatieperiode op de aanwezigheid van plaques. Als er geen plaques zichtbaar zijn, plaats de platen dan terug in de incubator en controleer ze na vier uur opnieuw. Herhaal deze procedure indien nodig, maar de incubatietijd mag 72 uur niet overschrijden.Bereid eerst de neutraalrood-kleuringsoplossing. Voeg vervolgens twee milliliters neutraalrood-oplossing toe aan elke put; voor dit protocol hoeft de aros-plug niet te worden verwijderd. Incubeer de platen gedurende één uur bij 37 °C.Nadat de incubatietijd is verstreken, controleert u de platen op de aanwezigheid van plaques terwijl de neutrale rode oplossing in de putjes blijft. Als er geen kleuring zichtbaar is, incubeert u de platen nog een uur, tot een maximum van drie uur. Zodra de plaques zichtbaar zijn, aspireert u de neutrale rode oplossing, waarbij u erop let dat de plug niet wordt verstoord, en gaat u vervolgens over tot het tellen van de plaques.Inspecteer de platen en bepaal de verdunning waarbij de plaques duidelijk gescheiden zijn. Plaats de plaat op een lichtbak en tel de plaques, waarbij u een stip plaatst op de getelde plaques om dubbeltellingen te voorkomen.Herhaal vervolgens de telling in een put met een andere verdunning van het virus en bereken de virustiter in plaque-vormende eenheden per milliliter. Conform de instructies in het schriftelijke protocol toont deze representatieve afbeelding een monolaag vóór infectie. De ruwe 2 6 4 0.7 cellen werden gedurende de nacht gekweekt en gefotografeerd onder een lichtmicroscoop bij een 20-voudige vergroting.Deze afbeelding toont dezelfde monoclaag na de vorming van plaques. Cellen werden na 48 uur infectie gekleurd met een 0,01% neutrale rode oplossing en gevisualiseerd onder een lichtmicroscoop bij een viervoudige vergroting. De Romeinse cijfers één, twee en drie duiden drie zichtbare plaques aan.Deze afbeelding toont een plaat aan het einde van het plaque-assay-protocol met dubbele putjes van drie tienvoudige verdunningsstappen, aangeduid met Romeinse cijfers. Eén en vier komen overeen met de 10⁻¹ verdunning, twee en vijf komen overeen met de 10⁻² verdunning en drie en zes komen overeen met de 10⁻³ verdunning.De virustiter van het monster staat hieronder aangegeven. Tijdens het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden de pipetpunten tussen de verdunningen te wisselen om kruiscontaminatie tussen monsters te voorkomen, de oplossingen te equilibreren naar de juiste temperatuur en te voorkomen dat cellagen uitdrogen. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een plaque-assay uitvoert en infectieuze mi neurovirus-partikels kwantificeert.Vergeet niet dat er bij het werken met Mira Norovirus in een biologische veiligheidskabinet altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van handschoenen en een laboratoriumjas tijdens het uitvoeren van deze procedure, en dat afval correct moet worden afgevoerd volgens de richtlijnen die zijn vastgesteld door uw lokale commissie voor biologische veiligheid.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Norovirussen zijn een belangrijke oorzaak van gastro-enteritis nog moleculaire technieken voor de karakterisering zijn nog relatief nieuw. Hier rapporteren wij twee verschillende reverse genetics benaderingen voor de doeltreffende inning van murine norovirus (MNV), het enige lid van dit geslacht die kunnen worden gekweekt in celcultuur.

Reverse genetics Mediated Herstel van infectieuze Murine Norovirus

Source: Morales Vasquez, D., et al. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the protocol for carrying out plaque assay–based viral titration for quantifying infectious virus levels in tissue sample collected from a virus–infected mouse model.

Plaque Assay–Based Quantification of Viral Load in an Infected Mouse Tissue Sample

Source: Kadoya, S., Sano, D. Assays for the Specific Growth Rate and Cell-binding Ability of Rotavirus. J. Vis. Exp. (2019).This video demonstrates the use of a plaque assay to assess the rotavirus growth curve. The method involves infecting host cells with diluted virus, overlaying with agarose to restrict spread, and staining to visualize plaques formed by viral replication. By counting plaque-forming units at defined time points, the resulting growth curve reveals the lag, exponential, and...

Assessing Rotavirus Growth Curve by Plaque Assay

This video demonstrates an assay for quantifying human norovirus virus-like particles (VLPs) binding to human intestinal bacteria. The bacterial suspensions are mixed with the VLPs and incubated to allow the formation of VLP-bacteria complexes. The complexes are then labeled with fluorophore-tagged VLP-specific antibodies, followed by flow cytometry-based visualization and quantification to identify the percentage of VLP-bound bacteria.

An Assay to Quantify the Binding of Human Norovirus VLPs to Intestinal Bacteria

Plaque-assays zijn de gouden standaard voor virale kwantificering, waarbij overdekken met gevangenisoverlagen op hostcellulaire monolagen worden gebruikt om virale titers te bepalen. Hoewel traditioneel verschillende semi-solide overlagen zijn gebruikt, tonen we hier plaque-technieken die semi-solide overlagen vergelijken met een nieuwe vloeibare microkristallijne cellulose onder verschillende families van virussen.

Virale Concentratie Bepaling Door Plaque Testen: met behulp van traditionele en Novel Overlay System

Hier presenteren we een procedure om enterovirus en norovirus in milieu- en drinkwater te kwantificeren met behulp van reverse transcriptie-kwantitatieve PCR. De gemiddelde virusterugwinning uit grondwater met deze gestandaardiseerde procedure van EPA-methode 1615 was 20% voor poliovirus en 30% voor muur-norovirus.

EPA Method 1615. Meting van Enterovirus en Norovirus Voorkomen in water per cultuur en RT-qPCR. Deel III. Virus Detectie door RT-qPCR

Deze studie beschrijft een   -Imaging gebaseerde micro-neutralisatietest de antigene relaties tussen virussen te analyseren. Het protocol maakt gebruik van een flatbed scanner en heeft vier stappen, waaronder titratie titratie kwantificering, neutralisatie, en neutralisatie kwantificering. De test werkt goed met de huidige circulerende influenza A (H1N1) pdm09, A (H3N2) en B-virussen.

Optimalisatie van een kwantitatieve micro-neutralisatie assay

Een op macrofoam gebaseerde bemonsteringsmethodologie werd ontwikkeld en geëvalueerd voor de detectie en kwantificering van norovirus op harde oppervlakken in het milieu.

Swab Sampling Methode voor de detectie van humane Norovirus op oppervlakken

Hier presenteren we twee protocollen, één voor het meten van de specifieke groeisnelheid en de andere voor het vermogen van de cel-bindende van rotavirus met behulp van de plaque assay en RT-qPCR. Deze protocollen zijn beschikbaar voor het bevestigen van de verschillen in fenotypen rotavirus stammen.

Tests voor de specifieke groeisnelheid en cel-bindend vermogen van Rotavirus

Het doel van dit protocol is het kwantificeren van binding van de eukaryotische pathogene menselijke norovirus aan bacteriën. Na het uitvoeren van een eerste virus-bacterie gehechtheid test, flow cytometrie wordt gebruikt om viraal gebonden bacteriën te detecteren binnen de bevolking.

Kwantificeren van menselijke Norovirus Virus-achtige deeltjes binding aan commensale bacteriën met behulp van Flow Cytometrie

Leer een plaque-assay voor kwantificering van infectieuze Murine Norovirus-deeltjes met behulp van RAW 264.7-cellen. Deze methode ondersteunt onderzoek naar norovirusinfecties en transmissiedynamiek.

Plaque assay voor Murine Norovirus

Meer video's verkennen