Name: Opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor Multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed Fenotypering Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 45 s
Description: Leer een gestandaardiseerde fenotyperingsmethode voor leukocyten in vers bloed voor multicenter klinische trials met flowcytometrie. Deze procedure zorgt voor nauwkeurige immunologische monitoring.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Jessica Jones, Erica Clark, Constance Ducar, Donna Smith, Roy Lewis, Lily Apedaile, Joanne Wiesner, Devin Adams, Corey McBain en Stephen Voght voor hun hulp bij de ontwikkeling van deze methode, manuscript en video. Dit werk werd ondersteund door de Bill en Melinda Gates Foundation CAVD subsidie ​​38.645 (MJM) en National Institutes of Health subsidies UM1 AI068618 en U01 AI069481 (MJM). EA-N. wordt ondersteund door NIH Grant T32 AI007140. Wij danken de James B. Pendleton Charitable Trust voor hun genereuze uitrusting donatie.

Opmerking: Om de fluorofoor-geconjugeerde antilichamen beschermen tegen licht, voert u alle stappen in een bio-safety kast met het licht uit. 1. Antilichaamkleuring Panel Voorbereiding <ol><li> Het antilichaam kleuring panel vindt in tabel 1. Antilichaamconcentratie worden bepaald door titratie met volbloed en dezelfde flowcytometrie apparatuur en procedures die worden gebruikt om de gekleurde monsters fenotypering verwerven. </li><li> Zodra geschikte kleuring titers worden bepaald, combineren antilichamen in een mengsel in een lock-cap tube. Toevoegen stroom wasbuffer (Dulbecco&#39;s PBS met 2% door hitte geïnactiveerd foetaal runderserum) het totale volume op 100 pl brengen. Schaal het mengsel voor het aantal monsters gekleurd. Dit mengsel kan worden opgeslagen bij 4 ° C tot acht weken. </li></ol> 2. Kleuring <ol><li> Als het opgevangen bloed wordt gebruikt voor andere doeleinden in advoorwaarde deze assay stel een aliquot leggen terwijl meer tijdgevoelige procedures worden uitgevoerd op het resterende bloed. De hoeveelheid kan worden opgeslagen bij kamertemperatuur tot 4 uur na venapunctie zonder significant celverlies. </li><li> Controleer of er een intact kraal pellet onderaan de Trucount buis en de buis label identificeren monster gekleurd. In HVTN klinische studies, het Laboratorium Data Management Systeem (Frontier Science and Technology Research Foundation, Amherst, NY) wordt gebruikt om te labelen en te volgen gekleurd monsters. </li><li> Noteer de lotnummers en vervaldata van alle reagentia. Noteer de Trucount buis kraal tellen nummer dat door de fabrikant op de zak van buizen, zorg ervoor dat het lotnummer op de zak overeenkomt met het lotnummer op de buis. </li><li> Gebruik reverse pipetteren tot 100 ul volbloed nauwkeurig pipetteren in de Trucount buis, net boven de metalen houder. Vermijd smeren bloed langs de zijkant van de buis. </li><li&gt; Behulp van reguliere (forward) pipetteertechniek, Pipetteer 100 ul van de gemengde antilichaamkleuring panel (zie tabel 1) in de Trucount buis. Doe het buisje en vortex bij lage snelheid gedurende ongeveer 15 sec te mengen. Inspecteer de buis zodat de kraal pellet volledig is opgelost. </li><li> Incubeer de Trucount buis gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (15-30 ° C) in het donker. </li><li> Indien nodig, Verdun een hoeveelheid van 10 × FACS lyserende oplossing voor 1X met DIH 2 O. Voeg 900 ul 1 x FACS lyserende oplossing aan de buis. </li><li> Grondig Doe het buisje dicht en vortex bij lage snelheid gedurende ongeveer 15 sec om te mengen. Druk de dop stevig in vergrendeling positie op de buis en afdichting met laboratorium film. </li><li> Bewaar het buisje bij -65 ° C tot -95 ° C totdat het monster gereed is voor verzending naar de centrale analytisch laboratorium of voor analyse in huis. Monsters stabiel in dit stadium gedurende ten minste vier weken. Indien verzending of het testen onmiddellijkdellijk kan deze stap worden weggelaten. </li></ol> 3. Scheepvaart Opmerking: De volgende instructies maken gebruik van een geïsoleerde verzendkosten systeem van Saf-T-Pak, Inc speciaal ontworpen voor de scheepvaart categorie B vrijgesteld biologische stoffen volgens de International Air and Transport Association (IATA) regelgeving. Als de analyse van de monsters op dezelfde locatie als de kleuring opgetreden, ga dan naar hoofdstuk 4. <ol><li> Monsters kunnen verzonden worden onmiddellijk na kleuring of nadat ze ingevroren bij -65 ° C tot -95 ° C. Volledig Wikkel elke buis in folie en plaats in de gekleurde monster box. Leg de gekleurde monster doos in een lekvrije poly-bag met absorberend materiaal. </li><li> Plaats de lekvrij poly-bag en de inhoud in een Tyvek zak en sluit met zo weinig mogelijk lucht in de zak. </li><li> Plaats het preparaat pakket (specimen in de secundaire verpakking) in de binnenste bruine doos. </li><li> Plaats de binnenste bruine bos in de piepschuim borst, vastzetten in de inkeping op de veranderende voorkomen. </li><li> Vul het piepschuim borst met droog ijs (circa 8 kg) en stevig leg het deksel op de borst. </li><li> Veilig tape de doos en het schip als biologische stof, categorie B (UN3373) met de juiste Dry Ice (UN1845) markeringen; volg IATA PI-650-instructies. </li><li> Na ontvangst monsters worden bewaard bij -65 ° C tot -95 ° C tot ze geanalyseerd. </li></ol> 4. Ontdooien en flowcytometrie-analyse <ol><li> Verwijder het gekleurde monster uit de diepvries bij kamertemperatuur in het donker ontdooien voor het verzamelen op de flowcytometer. Als het verzamelen van gegevens over meer dan een monster, standaardiseren van het proces voor alle buizen door spreiden ontdooien, zodat de buizen niet zitten bij kamertemperatuur gedurende meer dan 1 uur. </li><li> Monster wordt verkregen met een vier laser stromingscytometer uitgerust met geschikte filters, zoals BD LSRII. Gebruik standaard cytometer kalibratie en fluorescentie vergoeding methoden voor het verzamelen van gegevens 4. </li></ol> Opmerking: Gebruik geen vooruit gezet verstrooien of zijwaartse verstrooiing drempels tijdens het verzamelen 5. Trucount kralen kunnen beneden de laagste drempelwaarde voor deze parameters veroorzaken van een subset van kralen niet meegeteld tijdens de analyse. Indien vereist door het instrument op een drempel vast te stellen, stelt u de laagst mogelijke Am Cyan kanaal drempel. Omdat CD45 + leukocyten gekleurd met het panel zal worden Am Cyaan positief, en Trucount kralen ook fluoresceren in het Am Cyaan kanaal, moet dit zorgen voor alle relevante gegevens op passende wijze worden verzameld. <ol start="3"><li> Vortex het monster buis gedurende 5 sec voordat u op de flowcytometer. Trucount kralen fluoresceren zeer in veel kanalen. Poort de kralen tijdens het verzamelen door het vinden van de bevolking die sterk dubbel positief is voor PE Cy5 en APC (de twee colors dat het gemakkelijkst de kralen onderscheiden van de cellen is afhankelijk van instrumentatie). Selecteer de kraal poort als uw stoppen poort, en opnemen van gegevens tot ten minste 20.000 kralen zijn verworven. </li><li> Analyseren van de gegevens met behulp van geschikte software, zoals FlowJo (Treestar, Ashland, OR). Figuur 1 toont de gating systeem gebruikt voor analyse van verschillende leukocyt populaties zijn van een controle bloedafname. </li></ol> 5. Trucount Berekeningen <ol><li> Elke Trucount buis bevat een gevriesdroogd pellet van fluorescerende kralen. Na het toevoegen in de buis en vortexen moeten de korrels worden gelijkmatig verdeeld in het monster. Het aantal kralen in de pellet varieert enigszins door het lot nummer en is te vinden op de opbergzak voor de buizen. </li><li> Gate Trucount de kralen en celpopulaties zoals getoond in figuur 1 naar event tellingen te bepalen voor elke populatie. Vergelijken van het aantal events in de kraal gate het totale aantal kralen oorspronkelijk in de buis kunt u de verhouding van monster verzameld, die vervolgens kunnen worden gebruikt om de absolute concentratie (dwz cellen / pl) bepalen voor elke populatie te bepalen. De volgende vergelijking kan worden gebruikt voor dit doel: celconcentratie (# cellen / ul volbloed) = [# populatie events / (# bead events / # totaal beads in pellet)] / 100 pl. </li></ol> 6. Representatieve resultaten <img src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1.jpg" alt="Figuur 1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4302/4302fig1highres.jpg" /> Figuur 1. Gating regeling gebruikt voor de analyse van grote populaties leukocyten met representatieve gegevens van een gezonde vrijwilliger. A) Trucount kralen (i) zijn gated en uitgesloten van cellen. Granulocyten (ii) worden afgebakend en lympohcytes en monocyten zijn onderverdeeld in 3 popluations: CD14negatieve lymfocyten (iii) alle CD14 negatieve cellen (iv), en niet-lymfocyten (v). B) CD14 negatieve lymfocyten gated om CD4 + T-cellen (vi), CD8 + T-cellen (vii), B-cellen (viii), CD56 bright NK cellen (ix), CD56 dim NK cellen (x) en CD56 negatieve NK cellen onderscheiden (xi). C) Alle CD14 negatieve cellen te gated myeloïde (xii) en plasmacytoïde (xiii) dendritische cellen onderscheiden. D) niet-lympocytes zijn gated aan niet-klassieke (xiv), intermediair (xv), en klassieke (xvi) monocyten te onderscheiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4302/4302fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken</a> . Meer specifieke cel subsets die niet worden getoond in Figuur 1 (bijv. NKT cellen of neutrofielen) kan ook worden onderscheiden met het paneel we presenteren en de gating regeling kan worden uitgebreid of aangepast voor specifieke studie behoeften. Bepaalde stappen zijn weergegeven gating uniek voor deze methode. Van bijzonder belang, de opneming poort enuitsluiting gate getrokken rond de Trucount kralen en bovenop elkaar, een aan de gate korrels te tellen, en een aan de beads sluiten van de cellulaire analyse (Figuur 1A). Ook omdat lymfocyten, monocyten en granulocyten niet zo gemakkelijk onderscheiden in volbloed als in perifeer bloed mononucleaire cellen door voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing, gating deze cellen met CD45 expressie en zijwaartse verstrooiing vaak noodzakelijk (Figuur 1A). Verontreinigende granulocyten (omcirkeld) die niet konden worden gescheiden van lymfocyten en monocyten met CD45 en zijwaartse verstrooiing te onderscheiden in sommige plaatsen met hoge CD16 expressie (Figuur 1C en fig. 1D). Het aantal verontreinigende granulocyten meestal klein en ze niet interfereren met monocyt en NK cel gating.

<ol><li>Taylor, M. J., London, N. J., Thirdborough, S. M., Lake, S. P., James, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cryobiology+of+rat+and+human+dendritic+cells%3A+preservation+and+destruction+of+membrane+integrity+by+freezing%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">The cryobiology of rat and human dendritic cells: preservation and destruction of membrane integrity by freezing.</a> Cryobiology. 27, 269-278 (1990).</li>
<li>Reimann, K. A., Chernoff, M., Wilkening, C. L., Nickerson, C. E., Landay, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+lymphocyte+immunophenotype+and+proliferative+responses+in+cryopreserved+peripheral+blood+mononuclear+cells+from+human+immunodeficiency+virus+type+1-infected+donors%3A+implications+for+multicenter+clinical+trials.+The+ACTG+Immunology+Advanced+Technology+Laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Preservation of lymphocyte immunophenotype and proliferative responses in cryopreserved peripheral blood mononuclear cells from human immunodeficiency virus type 1-infected donors: implications for multicenter clinical trials. The ACTG Immunology Advanced Technology Laboratories.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 7, 352-359 (2000).</li>
<li>Boonlayangoor, P., Telischi, M., Boonlayangoor, S., Sinclair, T. F., Millhouse, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreservation+of+human+granulocytes%3A+study+of+granulocyte+function+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cryopreservation of human granulocytes: study of granulocyte function and ultrastructure.</a> Blood. 56, 237-245 (1980).</li>
<li>Perfetto, S. P., Ambrozak, D., Nguyen, R., Chattopadhyay, P., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quality+assurance+for+polychromatic+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quality assurance for polychromatic flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1522-1530 (2006).</li>
<li>Brando, B., Barnett, D., Janossy, G., Mandy, F., Autran, B., Rothe, G., Scarpati, B., D'Avanzo, G., D'Hautcourt, J. L., Lenkei, R., Schmitz, G., Kunkl, A., Chianese, R., Papa, S., Gratama, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+methods+for+assessing+absolute+numbers+of+cell+subsets+in+blood.+European+Working+Group+on+Clinical+Cell+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric methods for assessing absolute numbers of cell subsets in blood. European Working Group on Clinical Cell Analysis.</a> Cytometry. 42, 327-346 (2000).</li>
<li>Bull, M., Lee, D., Stucky, J., Chiu, Y. L., Rubin, A., Horton, H., McElrath, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+blood+processing+parameters+for+optimal+detection+of+cryopreserved+antigen-specific+responses+for+HIV+vaccine+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Defining blood processing parameters for optimal detection of cryopreserved antigen-specific responses for HIV vaccine trials.</a> J. Immunol Methods. 322, 57-69 (2007).</li>
<li>Kantor, A. B., Roederer, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKantor%2C+AB+%22The+handbook+of+Experimental+Immunology%22">The handbook of Experimental Immunology</a>. Herzenberg, L., Blackwell, C., Weir, D. 43, 1-49 (1996).</li>
<li>Hulspas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+the+stability+of+phycoerythrin-tandem+dye+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and the stability of phycoerythrin-tandem dye conjugates.</a> Cytometry A. 75, 966-972 (2009).</li>
<li>Le Roy, C., Varin-Blank, N., Ajchenbaum-Cymbalista, F., Letestu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+APC-tandem+dyes+are+degraded+through+a+cell-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry APC-tandem dyes are degraded through a cell-dependent mechanism.</a> Cytometry A. 75, 882-890 (2009).</li>
<li>Mandy, F., Brando, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+of+absolute+cell+counts+using+immunophenotypic+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Cytom%22%5BJournal%5D)">Enumeration of absolute cell counts using immunophenotypic techniques.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 6, Unit 6(2001).</li>
<li>Vuckovic, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+dendritic+cells+in+clinical+practice+using+a+new+whole+blood+single-platform+TruCOUNT+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Monitoring dendritic cells in clinical practice using a new whole blood single-platform TruCOUNT assay.</a> J. Immunol Methods. 284, 73-87 (2004).</li>
<li>Lichtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+dendritic+cells+and+interferon-alpha+production+in+patients+with+tuberculosis%3A+correlation+with+clinical+outcome+and+treatment+response%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Circulating dendritic cells and interferon-alpha production in patients with tuberculosis: correlation with clinical outcome and treatment response.</a> Clin. Exp. Immunol. 143, 329-337 (2006).</li>
<li>Hosmalin, A., Lichtner, M., Louis, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+analysis+of+dendritic+cell+subsets%3A+the+dendritogram%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Clinical analysis of dendritic cell subsets: the dendritogram.</a> Methods Mol. Biol. 415, 273-290 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

In dit rapport presenteren we een kraal-gebaseerde methode voor het opsommen van leukocyten populaties in vers volbloed door flowcytometrie en hebben betrekking op de parameters die nodig zijn voor het gebruik ervan in een multicenter klinische studie met gecentraliseerde monsteranalyse. Deze methode is gebaseerd op en optimaliseert de BD Trucount protocol en maakt het zijn betrouwbaar gebruik in een multicenter klinische studie setting. De kleuring test is eenvoudig en duurt ongeveer 45 minuten uit te voeren, waardoor ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagens Naam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td></tr><tr><td> Trucount Absolute telbuizen </td><td> BD Biosciences </td><td> 340334 </td></tr><tr><td> 10X FACS lyserende oplossing </td><td> BD Biosciences </td><td> 349202 </td></tr><tr><td> Categorie B &amp; Vrijgesteld Shipping Systeem, Geïsoleerde </td><td> Saf-T-Pak </td><td> STP-320 </td></tr><tr><td> CD45 monoklonaal antilichaam AmCyan </td><td> BD Biosciences </td><td> 339192 </td></tr><tr><td> CD3 FITC monoklonaal antilichaam </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td></tr><tr><td> PerCP CD8-Cy 5,5 monoklonaal antilichaam </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td></tr><tr><td> CD4 Alexa Fluor 700 monoklonale Antibody </td><td> BD Biosciences </td><td> 557922 </td></tr><tr><td> HLA-DR ECD monoklonaal antilichaam </td><td> Beckman Coulter </td><td> IM3636 </td></tr><tr><td> CD14 monoklonaal antilichaam V450 </td><td> BD Biosciences </td><td> 560349 </td></tr><tr><td> CD19 monoklonaal antilichaam PE </td><td> BD Biosciences </td><td> 555413 </td></tr><tr><td> CD16 APC-H7 monoklonaal antilichaam </td><td> BD Biosciences </td><td> 560195 </td></tr><tr><td> CD56 PE-Cy7 monoklonaal antilichaam </td><td> BD Biosciences </td><td> 335791 </td></tr><tr><td> CD11c APC monoklonaal antilichaam </td><td> BD Biosciences </td><td> 559877 </td></tr><tr><td> CD123 PE-Cy5 monoklonaal antilichaam </td><td> BD Biosciences </td><td> 551065 </td></tr></tbody></table>

opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed fenotypering assay

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservatie van perifeer bloed leukocyten wordt op grote schaal gebruikt om cellen voor immune reactie evaluaties te bewaren in klinische studies en biedt vele voordelen voor het gemak en de standaardisatie van immunologische evaluaties, maar nadelige effecten van dit proces zijn waargenomen op sommige cel subsets, zoals granulocyten, B-cellen en dendritische cellen 1-3. Analyseren verse leukocyten geeft een nauwkeuriger beeld van de in vivo toestand van de cellen, maar is vaak moeilijk uit te voeren in het kader van grote klinische studies. Verse cel assays zijn afhankelijk van vrijwilligers verplichtingen en termijnen, en zo tijdrovend, die toepassing niet kan onpraktisch zijn als gevolg van de werktijden nodig zijn van het laboratoriumpersoneel. Bovendien, als proeven worden uitgevoerd op meerdere centra, kunnen de laboratoria met de middelen en opleiding nodig zijn om de tests uit te voeren niet in voldoende nabijheid van klinische plaatsen. Om deze problemen aan te pakken, hebben we ontwikkeld een 11-kleurige antilichaamkleuring paneel dat kan met Trucount buizen (Becton Dickinson, San Jose, CA) gebruikt om fenotype en grote sommen leukocyt populaties in het perifere bloed, waardoor robuuster celtype specifieke informatie dan assays zoals complete bloedbeeld (CBC) of testen met de handel verkrijgbare panelen ontworpen voor Trucount buizen die vlek voor slechts een paar soorten cellen. De kleuring procedure is eenvoudig, vereist slechts 100 ul vers volbloed, en duurt ongeveer 45 minuten, waardoor het mogelijk is voor standaard bloed-processing laboratoria uit te voeren. Het is een bewerking van de BD Trucount buis technische fiche ( <a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">versie 8/2010</a> ). De kleuring antilichaam cocktail worden voorbereid in bulk in een centraal laboratorium assay en overgebracht naar de verwerking ter labs. Stained buizen kunnen worden vastgestelden ingevroren voor verzending naar de centrale test laboratorium voor veelkleurige flowcytometrie-analyse. De gegevens die uit deze kleuring paneel kan worden gebruikt om veranderingen in concentraties leukocyten tijd met betrekking tot interventie volgen en gemakkelijk verder worden ontwikkeld om activatie toestand van specifieke celtypen plaats beoordelen. In dit rapport tonen we de procedure die door bloed-processing laboranten om vlekken uit te voeren op vers volbloed en de stappen om deze gekleurde monsters te analyseren op een centrale test laboratorium ter ondersteuning van een multicenter klinische studie. De video beschrijft de procedure zoals deze wordt uitgevoerd in het kader van een klinische proef bloed trekken in de HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In dit rapport tonen we de kleuring en analyse stappen van een fenotypering test uitgevoerd op vers volbloed aan grote aangeboren en adaptieve leukocyten populaties te sommen. Wij benadrukken overwegingen voor het uitvoeren van deze procedures in het kader van een multicenter klinische studie.

Opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor Multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed Fenotypering Assay

Cryopreservatie van perifere bloedleukocyten wordt op grote schaal toegepast om cellen te bewaren voor evaluaties van de immuunrespons in klinische studies en biedt vele ...

Deze video beschrijft de procedure die is ontwikkeld door het HIV Vaccine Trials Network bij het Fred Hutchinson Cancer Research Center voor het kleuren van vers volbloed in multicentrische klinische studies om geanalyseerd te worden door een centraal laboratorium. De procedure maakt gebruik van tru count buizen van Becton Dickenson biosciences, waarvan elke buis een geliofiliseerd pellet bevat dat tijdens de monstervoorbereiding oplost om een bekend aantal fluorescerende beads vrij te geven. Fluorescerende antilichamen worden gebruikt om oppervlaktemarkers te kleuren die specifiek zijn voor verschillende celpopulaties.Het aantal cellen in deze verschillende populaties kan worden vergeleken met het aantal fluorescerende beads tijdens flowcytometrie-analyse, en absolute concentraties van verschillende leukocytenpopulaties in volbloed kunnen in de loop van de tijd in relatie tot de interventie worden gevolgd. Hallo, mijn naam is Erica Anderson Nissan en ik ben staff scientist bij het HIV Vaccine Trials Network. De procedure die u gaat zien, is een methode die we hebben ontwikkeld voor gebruik in onze multicentrische klinische studies.In deze studies ontvangen laboratoriumtechnici voor bloedverwerking verse monsters volbloed, kleuren deze met fluorescentie-gelabelde antilichamen en verzenden de monsters vervolgens naar een centraal laboratorium dat in staat is om deze te analyseren met een flowcytometer. Vers volbloed wordt in de context van klinische studies vaak niet geanalyseerd vanwege kosten en haalbaarheid, maar we hebben een enkelvoudig antilichaam-kleuringspanel ontwikkeld dat de belangrijkste leukocytenpopulaties in het perifere bloed kan identificeren. De kleuring van deze populaties duurt minder dan 45 minuten, waardoor het haalbaar is voor gebruik in klinische studies. Binnen het HVTN gebruiken we dit panel om de vroege gebeurtenissen te begrijpen die optreden na vaccinatie met HIV-vaccinkandidaten, maar dit PI-panel kan verder worden aangepast om zich te richten op celtypen die van belang zijn voor de individuele onderzoeker. Hartelijk dank voor het kijken en we hopen dat dit u in de toekomst van nut zal zijn.Tabel Een toont een 11-kleurig antilichaam-kleuringspaneel dat is ontwikkeld om de belangrijkste leukocytenpopulaties in het perifere bloed te fenotyperen en te tellen. De antilichaamcocktail wordt bereid door het centrale analyselaboratorium en verzonden naar de verwerkingslaboratoria om consistentie tussen de locaties te waarborgen en om de cocktails te kunnen testen op een controlebloedafname voordat ze worden gebruikt voor het kleuren van trial-monsters. Elk fluorescent geconjugeerd antilichaam wordt afzonderlijk getitreerd, waarna de antilichamen met de juiste titers worden gecombineerd in één mengsel met flow-wasbuffer bestaande uit delcos PBS met 2% verhit en geactiveerd foetaal runderserum.De antilichaamcocktail is voorzien van een batchnummer en een vervaldatum en wordt van het centrale analyselab naar de verwerkingslabs verzonden met een verpakkingssysteem dat tijdens het transport een temperatuur van vier graden Celsius handhaaft. Na ontvangst kan het antilichaamkleuringspaneel tot acht weken in het donker bij vier graden Celsius worden bewaard. BD fax slicing-oplossing wordt na de kleuring gebruikt om de rode bloedcellen te lyseren en de antilichaamkleuringen te fixeren, terwijl de leukocyten behouden blijven.De oplossing wordt in een 10 x concentratie van de fabrikant ontvangen en door het centrale analyselab één op 10 verdund met gedeïoniseerd water. De verdunde oplossing wordt vervolgens voorzien van een lotnummer en vervaldatum en na ontvangst op omgevingstemperatuur verzonden naar de verwerkingslaboratoria. Fax-lacing-oplossing wordt op kamertemperatuur tussen 15 en 30 °C bewaard voorafgaand aan de bloedafname voor true count-kleuring.Het verwerkingslaboratorium moet ervoor zorgen dat alle juiste reagentia zijn verkregen van het centrale assaylaboratorium. Deze omvatten BD TRU count-buizen, het gecombineerde antilichaam-kleuringspaneel en één fax-licentieoplossing. De HVTN maakt gebruik van een laboratoriumgegevensbeheersysteem om alle relevante informatie voor elk monster vast te leggen.Een unieke identificatiecode wordt geprint op een label dat op de true count-buis wordt geplaatst. Om het specimen gedurende het hele proces te kunnen volgen, labelt u een cryovial om het monster dat wordt gekleurd te identificeren. Dit bevat gewoonlijk een identificatiecode van de patiënt of vrijwilliger, een bezoekidentificatie en de datum van de bloedafname; aliquot het benodigde volume bloed in de gelabelde cryovial met behulp van aseptische technieken.De hoeveelheid bloed die voor de kleuring wordt gebruikt, is afhankelijk van het gebruikte kleuringspaneel, maar bedraagt gewoonlijk 50 of 100 µL per paneel. Het cryovial kan vervolgens tot vier uur bij kamertemperatuur worden bewaard voordat de kleuring plaatsvindt. In de tussentijd worden meer tijdgevoelige procedures uitgevoerd op het resterende bloed.Controleer of er een intacte kraalpellet onderin de buis aanwezig is en label de tru count-buis. Noteer de lotnummers en vervaldatums van alle reagentia samen met de relevante specimeninformatie. Werkbladen zijn nuttig voor het bijhouden van deze informatie gedurende een klinische studie.Het aantal kralen en het lotnummer van de tru count tube kunnen worden gevonden op de voorkant van de zak met tru count tubes. Wanneer u klaar bent om te beginnen met het tru Count-kleuringsproces, zorg er dan voor dat u alle materialen en reagentia klaar heeft voor gebruik in de biologische veiligheidskast. Deze omvatten de bloedaliquot gelabeld als tru count tube combined antibody staining panel tube, 1x fax lacing solution, 200 µL en 1000 µL micropipetten en pipetpuntjes, aluminiumfolie, laboratoriumfolie en een timer voor na de kleuring.U heeft ook een doos voor gekleurde preparaten nodig, maar deze hoeft niet in de zuurkast te staan. De hoeveelheid bloed en antilichaam die moet worden gebruikt, varieert afhankelijk van welke cellen door het panel worden onderscheiden en hoeveel cellen er nodig zijn voor een correcte analyse. Elk panel is getest op controlemonsters om de optimale hoeveelheid bloed voor kleuring te bepalen, en de hoeveelheid gebruikt antilichaam is gelijk aan de hoeveelheid bloed die wordt gebruikt voor het panel dat in deze video wordt getoond.Voor het pipetteren worden 100 µL bloed en 100 µL antilichaam gebruikt. Meng het bloed door de buis enkele keren voorzichtig om te keren en pipetteer vervolgens enkele keren voorzichtig op en neer om verder te waarborgen dat het bloed goed gemengd is.Gebruik vervolgens de reverse pipetteermethode om nauwkeurig volbloed uit het aliquot in de tru count-buis te pipetteren, net boven de metalen houder. Voorkom dat er bloed langs de wand van de buis wordt uitgesmeerd. Vervang de pipetpunt tussen elke tru count-buis.Nu is het tijd om het bloed te kleuren met het antilichaam-kleuringspanel voordat er gepipetteerd wordt. Meng het kleuringspanel door voorzichtig enkele keren op en neer te pipetteren. Voeg 100 µL van het antilichaammengsel toe aan het bloed in de true count-buis.Pas in deze stap geen reverse pipettering toe, omdat dit zou leiden tot verspilling van kostbare reagentia. Sluit de buis af en vortex deze op lage snelheid gedurende ongeveer 15 seconden om te mengen. Zorg ervoor dat de bead-pellet volledig is opgelost.Bedek de buis met folie en stel een timer in om het bloed 15 minuten te kleuren. De benodigde hoeveelheid 1x fax slicing-oplossing is negen keer de hoeveelheid bloed die in de assay wordt gebruikt; in dit voorbeeld wordt dus 900 µL 1x fax slicing-oplossing gebruikt. Voeg na de incubatie van 15 minuten 900 µL van de 1x fax slicing-oplossing toe aan het gekleurde bloed om de kleuring te fixeren en de rode bloedcellen te lyseren.Omgekeerd pipetteren is in deze stap niet nodig. Sluit de buis af en vortex op lage snelheid gedurende ongeveer 15 seconden om te mengen. Druk de dop stevig naar beneden in de vergrendelpositie en sluit deze af.Met laboratoriumfolie. Bewaar de buisjes in een donkere doos of volledig in folie gewikkeld bij minus 65 tot minus 95 °C totdat ze naar het centrale assaylaboratorium worden verzonden. Tot op heden is uit testen gebleken dat monsters tot vier weken stabiel zijn bij deze temperatuur; gekleurde monsters moeten worden verzonden als biologische stoffen categorie B volgens de richtlijnen van de International Air Transport Association of IATA.Overeenkomstig de regelgeving van het HVTN worden monsters wekelijks van de verwerkingslaboratoria naar het centrale analyselaboratorium verzonden met behulp van een geïsoleerd verzendsysteem van Safety Pack Inc., dat specifiek is ontworpen om aan deze eisen te voldoen. Plaats bij gebruik van dit systeem de binnenste bruine doos in de piepschuimkist en zet deze vast in de uitsparing om verschuiven te voorkomen. Vul de kist volledig met droogijs en wacht vijf tot 10 minuten zodat de doos kan afkoelen.Om monsters voor verzending voor te bereiden, moet elke buis en folie volledig worden ingepakt en in de doos voor gekleurde monsters worden geplaatst. Plaats absorberend materiaal samen met de doos voor gekleurde monsters in een lekvrije polybag. Verwijder overtollige lucht uit de zak en sluit deze stevig af.Plaats de lekvrije polyzak in een Tyvek-zak. Verwijder opnieuw alle lucht uit de zak voordat u deze afsluit. Plaats de verpakking met het specimen in de binnenste bruine doos en plaats het deksel stevig op de styrofoam-koelbox.Plak de verzenddoos stevig dicht en verzend deze als biologische stof categorie B met de juiste markeringen voor droogijs. Volg de IATA PI 650-instructies bij multicenter klinische studies. Het is belangrijk om monsters te volgen tijdens de fasen van kortstondige opslag, verzending en langdurige opslag.Het databeheersysteem dat door het HVTN wordt gebruikt, maakt het mogelijk om een verzendmanifest op te stellen dat kan worden geïmporteerd in de specimen-database van het centrale analyselab waar de monsters worden bewaard en geanalyseerd. Hierdoor ontstaat een verslag van wanneer de monsters zijn verzonden en ontvangen, waar ze definitief zijn opgeslagen en wanneer ze zijn verwijderd. Voor analyse wordt het gekleurde monster uit de vriezer gehaald om op kamertemperatuur te ontdooien in een donkere doos.Niet meer dan één uur voor het verzamelen op de flowcytometer. Indien gegevens van meer dan één monster worden verzameld, dient het ontdooien te worden gespreid, zodat de buisjes niet langer dan één uur bij kamertemperatuur staan. Elk monster moet worden geanalyseerd met een flowcytometer met vier lasers, uitgerust met geschikte filters zoals de BD LSR II. Gebruik voor de gegevensverzameling standaardkalibratie van de cytometer en methoden voor fluorescentiecompensatie indien het instrument dit vereist. Om een drempelwaarde in te stellen, stelt u de laagst mogelijke drempelwaarde voor het AmCyan-kanaal in. Vortex de monsterbuis vijf seconden voordat deze op de flowcytometer wordt geladen.Cytometer tru count beads fluoresceren sterk in veel kanalen. Gate de beads tijdens de collectie door de populatie te vinden die sterk dubbel positief is. Let op dat voor PE SCI five en a PC de twee kleuren die de beads het gemakkelijkst van de cellen onderscheiden, kunnen variëren afhankelijk van de instrumentatie.Selecteer de tru count bead-gate als stop-gate en registreer gegevens totdat er ten minste 20 000 beads zijn verzameld. Analyseer de gegevens met geschikte software zoals FlowJo. We zullen nu het gating-schema doorlopen dat wordt gebruikt voor de analyse van de belangrijkste leukocytenpopulaties, aan de hand van gegevens van een representatieve controle-bloedafname.Met behulp van het panel kunnen ook specifiekere celpopulaties worden onderscheiden, zoals NKT-cellen of neutrofielen, maar deze worden in dit voorbeeld niet getoond. Eerst worden een inclusie-gate en een exclusie-gate rond de tru count beads getekend en over elkaar heen geplaatst; één om de beads te selecteren voor het tellen en één om de beads uit te sluiten van de cellulaire analyse. Vervolgens wordt de cellulaire data, exclusief de beads, gegate om alleen enkelvoudige cellen te includeren door forward scatter height af te zetten tegen forward scatter area.Deze gate sluit ook klein debris uit. De CD 45-positieve cellen worden vervolgens gegated, waarbij de granulocyten worden gescheiden van de lymfocyten en monocyten aan de hand van side scatter. De lymfocyten en monocyten worden daarna onderverdeeld in drie afzonderlijke groepen met behulp van CD 14 en side scatter.Hiervan maken deel uit CD14-negatieve lymfocyten, alle CD14-negatieve cellen en niet-lymfocyten; vanuit de gate voor CD14-negatieve lymfocyten worden de cellen vervolgens onderverdeeld in drie groepen: CD3-positieve CD19-negatieve, CD3-negatieve CD19-positieve en CD3-negatieve CD19-negatieve cellen. T-cellen worden geselecteerd vanuit de CD3-positieve CD19-negatieve gate. Na uitsluiting van CD56-positieve en CD16-positieve cellen kunnen CD4-positieve en CD8-positieve T-cellen worden onderscheiden. B-cellen worden geselecteerd vanuit de CD3-negatieve CD19-positieve gate na uitsluiting van CD56-positieve en CD16-positieve cellen, en NK-cellen worden geselecteerd vanuit de CD3-negatieve CD19-negatieve gate.Na het uitsluiten van mogelijke contaminerende monocyten met behulp van CD 11 C and CD four, worden de NK-cellen verdeeld in CD 56 brite, CD 56 DM en CD 56 negatieve populaties. Om dendritische celpopulaties te onderscheiden, worden alle CD 14 negatieve cellen gegated om CD three positieve, CD 19 positieve, CD 56 positieve en CD 16 positieve cellen uit te sluiten. Van daaruit worden de HL A DR positieve cellen gegated, waarna myeloïde dendritische cellen en plasmacytoïde dendritische cellen kunnen worden onderscheiden op basis van hun CD 11 C en CD 1 23 expressie.Ten slotte worden, vanuit de non-lymfocyten-gate, monocyt-subsets gegated na het uitsluiten van mogelijke contaminerende CD 56 positieve CD three positieve en CD 19 positieve cellen. Non-klassieke, intermediaire en klassieke monocyten worden onderscheiden op basis van hun CD 16 en CD 14 expressie. Zodra de populaties van belang zijn gegated, kunnen de concentraties worden berekend.Door het aantal gebeurtenissen in de bead-gate te vergelijken met het totale aantal beads dat oorspronkelijk in de buis zat, kunt u de ratio van het verzamelde monster bepalen, wat vervolgens kan worden gebruikt om de absolute concentratie te bepalen. Ons aantal cellen per microliter voor elke populatie. De hier getoonde vergelijking kan voor dit doel worden gebruikt.In deze video hebben we de procedure gedemonstreerd die door laboranten voor bloedverwerking wordt gebruikt om kleuringen uit te voeren op vers volbloed, alsofmede de stappen om deze gekleurde monsters te analyseren in een centraal assaylaboratorium. In de context van een multicentrische klinische studie hebben we aangetoond dat de assay eenvoudig is en een relatief korte duur heeft, waardoor het haalbaar is voor laboranten voor bloedverwerking om deze uit te voeren en de monsters te vriezen en te verzenden naar het essentiële assaylaboratorium voor analyse. De sleutel tot het verkrijgen van nauwkeurige en consistente resultaten is het zorgvuldig standaardiseren van kritieke stappen in het protocol en het gebruik van een documentatiesysteem dat alle stappen bijhoudt, zodat eventuele ontdekte anomalieën kunnen worden teruggevoerd naar de bron van de fout.De gegevens die met dit kleuringspanel zijn gegenereerd, kunnen worden gebruikt om veranderingen in leukocytenconcentraties in de loop van de tijd te volgen en kunnen eenvoudig verder worden ontwikkeld om activatietoestanden van specifieke celtypen van belang te beoordelen.

enumeration-major-peripheral-blood-leukocyte-populations-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Een geautomatiseerde microfluïdische apparaat werd ontwikkeld voor het doen circuleren kernhoudende cel verrijking uit perifeer bloed via erythrocyten lysis dat de isolatie van hoge kwaliteit staal zorgt zonder cel verlies.

Geautomatiseerde Microfluïdische Blood Lysis Protocol voor de verrijking van circulerende cellen met een kern

Source: Xu, C., et al. An Efficient and Simple Method to Establish NK and T Cell Lines from Patients with Chronic Active Epstein-Barr Virus Infection. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the phenotyping of EBV-infected T and NK cell lines using flow cytometry, highlighting the preparation, antibody staining, and analysis steps to identify lineage-specific surface markers. It shows how marker profiles confirm distinct T-cell and NK-cell populations.

Phenotyping EBV-Infected Cell Lines Using Flow Cytometry

This video demonstrates a flow cytometry-based technique using two fluorochromes to identify CD4+ and CD8+ T cells, γδ T cells, B cells, natural killer (NK) cells, and monocytes in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Upon incubating the cells with fluorochrome-conjugated antibodies against the surface markers, the cell subsets are identified using an optimal flow cytometric gating strategy.

A Flow Cytometry Assay to Identify Immune Cell Subsets in Peripheral Blood Mononuclear Cells

Immunofenotypeer van vol bloed is onmisbaar voor het bewaken van het menselijk immuunsysteem. Echter, het aantal benodigde reagentia en de instabiliteit van specifieke fluorochromen in voorgemengde cocktails vereisen dagelijkse bereiding van reagentia. Hier laten we zien dat semi-geautomatiseerde bereiding van een kleuringsantilichaamcocktail helpt om betrouwbare immunofenotypering te vestigen door de variabiliteit in het doseren van reagentia te minimaliseren.

Een semi-automatische Aanpak Voorbereiding Antibody Cocktails voor Immunophenotypic Analyse van de humane perifere bloed

Detectie van minimale of meetbare residuele ziekte (MRD) is een belangrijke voorspellende biomarker voor risico-evaluatie te verfijnen en het voorspellen van herval in acute myeloïde leukemie (AML). Deze uitgebreide richtlijnen en aanbevelingen met de best practices voor consistente en accurate identificatie en opsporing van MRD, kan steun bij het maken van effectieve AML behandelingsbeslissingen.

Uitgebreide Protocol bij monster en proces beenmerg voor het meten van meetbare residuele ziekte en leukemische cellen van de stam in Acute myeloïde leukemie

Hier beschrijven we een eencellige proteomic aanpak om te evalueren van immuun fenotypische en functionele (intracellulaire cytokine inductie) veranderingen in het perifere bloedmonsters geanalyseerd via massale cytometry.

Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry

Hier presenteren we een protocol voor het karakteriseren van monocyt deelverzamelingen door volbloed stroom cytometry. Het gaat hierbij om overzichten hoe gate de subsets kunt weergeven en beoordelen van hun uitdrukking van oppervlakte markers en geven een voorbeeld van de beoordeling van de uitdrukking van de M1 (inflammatoire) en M2 markers (ontstekingsremmer).

Karakterisatie van menselijke monocyt deelverzamelingen door volbloed Stroom Cytometry analyse

Dit protocol beschrijft klinisch implementeerbare bereiding van hoogwaardige PBMC- en plasmabioamples op de klinische proeflocatie die kunnen worden gebruikt voor translationele biomarkeranalyse.

Voorbereiding van perifere bloedmononucleaire celkorrels en plasma uit een enkele bloedafname op klinische proeflocaties voor biomarkeranalyse

Een protocol voor het meten van perifere bloedleukocyten met behulp van een POCT-kaartgebaseerde leukocytenanalysator wordt hier gepresenteerd. Dezelfde bloedmonsters werden getest door twee geautomatiseerde hematologieanalysatoren om de consistentie en nauwkeurigheid van de resultaten te evalueren. De resultaten toonden aan dat de geëvalueerde analyzer een goede correlatie had met het referentiesysteem.

Evaluatie van een Point-of-Care Testing Analyzer voor het meten van perifere bloed leukocyten

Om effectief onderzoek naar de werking van het immuunsysteem celpopulaties hun zuivering vaak vereist is. Complement uitputting is een snelle en goedkope techniek voor de isolatie van het immuunsysteem van celpopulaties met hoge zuiverheid.

Uitputting van specifieke celpopulaties door Complement Uitputting

Leer een gestandaardiseerde fenotyperingsmethode voor leukocyten in vers bloed voor multicenter klinische trials met flowcytometrie. Deze procedure zorgt voor nauwkeurige immunologische monitoring.

Opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor Multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed Fenotypering Assay (Video) | JoVE Journal

Opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor Multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed Fenotypering Assay

Meer video's verkennen