Synthese van Phase-shift Nanoemulsions met smalle Grootte Uitkeringen voor akoestische Droplet-verdamping en Bubble-enhanced Ultrasound-gemedieerde Ablation

Het algemene doel van het volgende experiment is om het effect van bellen, die akoestisch worden gegenereerd door het verdampen van lipide-gecoate nano-emulsies, op ultrasone ablatie te observeren. Dit wordt bereikt door eerst lipide-gecoate nano-emulsies te dispergeren door albumine-geladen polyacrylamide-hydrogels. In een tweede stap zendt een gefocuste transducer korte pulsen met een hoge amplitude uit in de hydrogel, waardoor nano-emulsies lokaal bij de focus verdampen; vervolgens worden de resulterende bellen continu door ultrasoon geluid aangestuurd, waarbij de door de bellen uitgestraalde akoestische energie snel door de hydrogel wordt geabsorbeerd, wat de snelheid van de ultrasone opwarming versnelt.

De resultaten tonen aan dat de aanwezigheid van bellen de tijd en energie die nodig zijn om de hydrogel boven de drempeltemperatuur voor proteïnedenaturatie te verhitten drastisch vermindert, wat resulteert in een snellere en efficiëntere echogeleide ablatie. De grootte van de faseverschuivende nano-emulsie is een kritische bepalende factor voor de drukdrempel. Voor akoestische vaporisatie hebben we een protocol ontwikkeld voor het produceren van stabiele faseverschuivende nano-emulsies met smalle grootteverdelingen en goed gedefinieerde vaporisatiedrempels, evenals een in vitro systeem voor het evalueren van de impact op echogeleide ablatie.

Hoewel er een in vitro-systeem wordt beschreven, zijn de fase-verschuivende nano-emulsies ontworpen om extravasculair weefsel en solide tumoren te bereiken met deeltjes die akoestisch kunnen worden vervluchtigd. De gevormde bellen kunnen vervolgens worden gebruikt voor diagnostische of therapeutische toepassingen bij de behandeling van kanker. Om te beginnen met de procedure voor het bereiden van een fase-verschuivende nano-emulsie of PSNE, mengt u eerst de lipiden door 11 mg DPPC en 1,7 mg DSPE op te lossen.

Peg 2000 in chloroform in een glazen rondbodemkolf. Plaats de rondbodemkolf in een waterbad van 50 °C in de zuurkast en gebruik een stroom argongas om het organische oplosmiddel te verdampen. Om een droge lipidefilm te vormen, plaatst u de kolf in een vacuümexsiccator en laat u deze overnight onder vacuüm staan om de lipidefilm de volgende ochtend te laten drogen.

Rehydrateer de lipidefilm met 5,5 milliliters PBS. Verwarm de oplossing in een waterbad van 45 degree Celsius totdat de lipidefilm is opgelost. Breng de lipideoplossing vervolgens over in een flacon van zeven milliliter en sonicatiseer deze gedurende twee minuten met een probe-sonicator bij 20% amplitude.

Verdeel de oplossing over twee vials van elk 2,5 milliliters. De overige 0,5 milliliters wordt weggegooid. Voeg 2,5 milliliters PBS toe aan elke vial en plaats vervolgens beide vials in een ijswaterbad van nul graden Celsius.

Voeg 50 µL docafluoro-pentaan, of DDFP, toe aan elk bestand. Soniceer het DDFP-lipidmengsel. Een ijswaterbad is het meest kritische onderdeel van deze procedure.

Het ijswaterbad wordt gebruikt om verdamping van het vloeibare perfluorcarbon te voorkomen. Sonicate tijdens dit proces elke vial in het ijswaterbad met de volgende instellingen: 25% amplitude gepulseerde modus en een totale tijd van 60 seconden. Draag na sonificatie de PSNE-oplossing over naar scintillatievials van 20 milliliter, waarbij vijf milliliter PBS aan elke vial wordt toegevoegd, wat resulteert in een eindvolume van 10 milliliter per vial.

Stel de extruder samen volgens de instructies van de fabrikant om de extruder te primen. Pipetteer 10 milliliters gedeïoniseerd water in de bovenste monsterpoort. Sluit de opening af en draai het ontluchtingsventiel vast.

Open langzaam de stikstofgaslijn om de druk te verhogen, waardoor het monster door de membranen wordt geperst. Verzamel het monster vanuit de uitlaatleiding en extrudeer de PSNE 16 keer door een filter van 100 nanometer of 200 nanometer om een smalle grootteverdeling te verkrijgen. Begin deze procedure door een polyacrylamide-hydrogel voor te bereiden die PSNE bevat.

Bereid eerst een 24% bovine serumalbumine- of BSA-oplossing door 2,4 gram BSA-poeder op te lossen in 10 milliliters gedeïoniseerd water. Bereid vervolgens een 10% ammoniumpersulfaat- of PS-oplossing door één gram PS-poeder te verdunnen in 10 milliliters gedeïoniseerd water. Meng deze reagentia in een plastic mal in de volgende volgorde: 2,1 milliliters acrylamide-oplossing, 1,2 milliliters tris-buffer, 0,1 milliliters 10% PS, 4,5 milliliters 24% BSA-oplossing en 3,6 milliliters gedeïoniseerd water. Verwarm de oplossing tot 40 °C in een waterbad en plaats deze vervolgens gedurende één uur onder vacuüm om de vloeistof te ontgassen.

Dit is nodig om ongewenste belvorming in de hydrogel na een uur te voorkomen. Haal de kamer uit het vacuüm, voeg 480 µL PSNE-suspensie toe en meng grondig door de plastic kamer voorzichtig te zwenken. Voeg in een zuurkast 12 µL tetraethylendiamine of TEMED toe om het acrylamide te polymeriseren en plaats de kamer gedurende twee uur in een waterbad van 12 °C.

Polymerisatie is exotherm, dus is een koelbad nodig om verdamping van PSE tijdens de polymerisatie te voorkomen. Zodra het acrylamide is gepolymeriseerd, wordt een gefocuste vermogenstransducer en een beeldvormingssonde geplaatst in een acrylbeker gevuld met DGAs gedeïoniseerd water, zodat het beeldvlak overlapt met het focale volume van de transducer. Plaats vervolgens de met PSNE geladen polyacrylamide-hydrogel in het brandpunt van de vermogenstransducer; verdamp de PSNE binnen de hydrogel met korte akoestische pulsen, gevolgd door een continue golfexpositie van 15 seconden voor door bellen versterkte ablatie.

Naarmate de BSA denatureert, wordt de hydrogel ondoorzichtig door de absorptie van ultrasone golven en warmteontwikkeling, wat leidt tot vaporisatie en belvorming die met een diagnostische echografie-scanner kunnen worden gemonitord. In deze voorbeeldafbeelding geeft de pijl het brandpunt aan waar een belwolk werd gevormd door PSNE-vaporisatie. Herhaal de akoestische blootstelling op een nieuwe locatie in de hydrogel zonder de PSNE te verhogen om de ablatietijd en het volume te vergelijken.

Dit protocol resulteert in met lipiden gecoate perfluorcarbon-druppels met een nauwe grootteverdeling. De met dynamische lichtverstrooiing gemeten grootteverdeling wordt hier getoond voor PSNE die zijn geëxtrudeerd met filters van 100 en 200 nanometer. De eenheden van de ordinaat-assen zijn gebaseerd op de intensiteit van het verstrooide licht van deeltjes van een bepaalde grootte ten opzichte van de totale intensiteit van het verstrooide licht van het monster.

Wanneer de gemiddelde diameter en standaarddeviatie van PSNE na één en zeven dagen na extrusie met 100 en 200 nanometer filters worden gemeten met dynamische lichtverstrooiing, tonen de resultaten aan dat PSNE gedurende ten minste een week stabiel zijn. Deze figuur toont B-modusbeelden van PSNE vóór en na vaporisatie. In een polyacrylamide-hydrogel geeft de pijl de focale regio aan waar een bellenwolk is gevormd door vaporisatie van PSNE.

Dit zijn afbeeldingen van een polyacrylamide-hydrogel die albumine en PSNE bevat, vóór en na vaporisatie en sonicatie met high-intensity focused ultrasound of HiFu. Een laesie is gevormd door 15 seconden HiFu-gemedieerde verhitting. De asymmetrische vorm van de laesie is het resultaat van prefocale verhitting die optreedt door de aanwezigheid van de bellenwolk in het pad van het ultrageleid. Prefocale verhitting en laesievorming door verstrooiing vanuit bellen kunnen worden geminimaliseerd door het uitgezonden akoestische vermogen na de ontwikkeling ervan te verminderen.

Deze methode voor het produceren van stabiele faseverschuivende nano-emulsies zal de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van ultrasone therapie om bubbelversterkte HIFU-ablatie in solide tumoren te onderzoeken. Na het bekijken van deze video moet u een goed begrip hebben van hoe u stabiele faseverschuivende nano-emulsies met smalle grootteverdelingen produceert en hoe u bubbelnucleatie en versterkte ultrasone ablatie bestudeert.