Gelijktijdig Intracellulaire opnemen van een lumbale motoneuron en de kracht die door de motor in de volwassen muis

Het algemene doel van deze procedure is om de elektrofysiologische en contractiele eigenschappen van een enkele motorische eenheid bij de muis te bestuderen door in vivo intracellulaire registraties van motorneuronen uit te voeren. Dit wordt bereikt door eerst het ruggenmerg en de betreffende spier bloot te leggen. Vervolgens wordt een krachttransducer aan de pees van de spier bevestigd.

Vervolgens wordt het motorneuron gestimuleerd met een intracellulaire elektrode, waardoor de contractie van de geregistreerde motorische eenheid wordt veroorzaakt. Uiteindelijk kunnen de elektrofysiologische eigenschappen van het motorneuron gelijktijdig met de contractiele eigenschappen van de bijbehorende motorische eenheid worden gekenmerkt. Een visuele demonstratie van deze techniek is essentieel, omdat de microsurgische stappen zeer moeilijk aan te leren zijn vanwege de geringe omvang van het dier.

Om de procedure te starten, wordt een muis geanestheseerd door intraperitoneaal pentobarbitalnatrium of een mengsel van ketamine en xylazine te injecteren. Controleer of de muis geen teenknijpreflex meer vertoont. Maak vervolgens met een stomp schaartje een incisie over de trachea en trek de huid aan beide zijden weg.

Scheur vervolgens de speekselklier open met een stomp pincet. Om de twee dunne spieren die de trachea bedekken bloot te leggen, scheidt u de twee spieren zodat de trachea zichtbaar wordt. Gebruik hiervoor een Dumont seven pincet.

Schuif twee draden van vier 0 aut zijden hechtdraad onder de trachea. Maak vervolgens een transversale insnijding in de trachea tussen twee kraakbeenringen. Let er wel op dat de trachea niet volledig wordt doorgesneden.

Voer nu de trachealtube in de trachea in. Zet beide zijden van de insertieopening vast door de hechtingen eroverheen te knopen. Sluit de trachealtube daarna aan op een muizenventilator en een capnograaf.

Sluit vervolgens de ventilator via een compliance bag aan op zuivere zuurstof. Stel de parameters van de ventilator zo in dat de muis niet vecht tegen de kunstmatige beademing en de end-tidale koolstofdioxidedruk stabiel blijft tussen 4% en 5%. Leg in deze stap de vena jugularis aan één zijde van de nek vrij met behulp van botte dissectietechnieken.

De vena jugularis splitst zich in twee hoofdtakken, de vena facialis anterior en posterior. Scheid de ader voorzichtig van het omringende bindweefsel. Schuif vervolgens twee draden van 6-0 zijden hechtdraad onder de ader en zorg dat deze zo ver mogelijk van elkaar gescheiden zijn over de lengte van de ader.

Plaats vervolgens een kleine vaatklem aan de proximale zijde van de ader en knoop de distale zijde van de ader af. Maak met een zeer fijne irisschaar een kleine transversale incisie in de ader. Wees zeer voorzichtig om de ader niet volledig door te snijden.

Plaats daarna een vooraf gevulde Franse katheter in de opening tot aan de vaatclip die de ader en de katheter samen houdt. Verwijder de vaatclip voorzichtig. Schuif de katheter vervolgens nog enkele millimeters verder de ader in. Bevestig de katheter door deze aan beide zijden van de insteekplaats met de hechtingen vast te knopen.

Sluit vervolgens een van de katheters aan op een spuit of een spuitpomp om aanvullende doses anesthetica, zoals pentobarbital-natrium of ketamine-xylazine, toe te dienen. Herhaal de procedure voor een andere vene en sluit de andere katheter aan op een spuitpomp voor een langzame intraveneuze infusie van een 4%glucose-oplossing bevatten 1%natriumbicarbonaat en 14%plasmon. Sluit tot slot de huid van de nek met een naald en hechtdraad.

Breng de muis daarna terug in buikligging. Maak nu een incisie van de bovenkant van het dijbeen tot aan de achillespees. Scheid de huid van de onderliggende spieren en zorg ervoor dat de bloedvaten niet beschadigd raken.

Identificeer vervolgens de anterieure rand van de biceps femoris, die zichtbaar is als een witte lijn die over het dijbeen loopt. Open daarna voorzichtig langs de lijn vanaf de knie tot aan het heupbeen. Scheid de spieren om de nervus ischiadicus onder de biceps femoris bloot te leggen.

Dissekeer voorzichtig de biceps femoris en verwijder deze. Om de nervus ischiadicus en de m. triceps surae bloot te leggen, identificeert u de nervus tibialis tussen de nervus peroneus communis en de nervus suralis. Identificeer tussen de verschillende takken van de nervus tibialis de takken die de m. triceps surae innerveren en onderscheid deze van de takken die dieper lopen.

Bind alle vertakkingen van de nervus tibialis samen met acht OTT-zijdegaar, terwijl de vertakkingen die de mus triceps surae innerveren intact blijven. Knip de nervus tibialis zo ver mogelijk van de knoop door. Identificeer wervels T13 en L1, waarbij T13 de laatste wervel is waaraan ribben zijn bevestigd.

Immobiliseer vervolgens de wervelkolom met de Cunningham-wervelklemmen voor het ruggenmerg aan weerszijden van T 13 en L 1. Let erop dat het ruggenmerg niet wordt gecomprimeerd, maar breng een lichte spanning aan op de longitudinale as. Zorg ervoor dat de wervelkolom goed is vastgezet door deze voorzichtig met een pincet naar beneden te drukken.

Verwijder met de fijne R-rondeurs de doornuitsteeksels en vervolgens de laminae over T 13 en L 1 om het ruggenmerg bloot te leggen. Plaats daarna een op maat gemaakt plastic bad om het ruggenmerg heen. Bevestig vervolgens het bad op zijn plaats met een zijden draad van maat 4-0.

Zorg tot slot dat het bad waterdicht is door het af te dichten met een snelhardende kit. Zodra de kit is uitgehard, verwijdert u het katoen dat het ruggenmerg bedekt en vult u het bad met minerale olie. Gebruik een andere wervelklem om een doornuitsteeksel van de sacrale regio vast te klemmen.

Om de rugregio van het dier te ondersteunen, wordt een derde klem gebruikt om het rechterachterpoot en de enkel te immobiliseren, waarbij de knie en de enkel in een hoek van 90 graden gebogen zijn. Verwijder het gaas dat over het gebied van de achterpoot ligt. Dissekeer de achillespees uit het omliggende weefsel.

Snijd de triceps met een gebogen naald zo veel mogelijk los van het omliggende weefsel. Haal een zijden hechtdraad van maat 6-0 door de achillespees en maak een drievoudige knoop rond de pees. Plaats vervolgens de krachttransducer dicht bij de knoop.

Bevestig daarna de pees met de zijden draad aan de krachttransducer en snijd het distale deel van de pees af. Plaats vervolgens twee roestvrijstalen draden onder de fascia van de m. triceps surae. Deze draden zijn verbonden met een extracellulaire AC-versterker.

Voor de EMG-registratie wordt de nervus triceps surae geplaatst op de kathode van een haakelektrode, waarbij de anode een nabijgelegen spier raakt. Stimuleer vervolgens de nervus triceps surae met een vierkante puls van 50 microseconden met een toenemende intensiteit bij een lage frequentie totdat de maximale twitch-amplitude wordt waargenomen. Stimuleer vervolgens de nervus triceps surae met een vierkante puls van 50 microseconden met een toenemende intensiteit bij een lage frequentie totdat de maximale twitch-amplitude wordt waargenomen.

Deze figuren laten zien hoe een motorneuron uit de mus triceps surae groep kan worden geïdentificeerd. Na penetratie is bij een lage stimulatie-intensiteit alleen een monosynaptische EPSP waarneembaar bij een hogere intensiteit. De EPSP kan groot genoeg zijn om bij een nog hogere stimulatie-intensiteit een orthotrope spike uit te lokken, volgens het alles-of-niets-principe.

De antidrome spike verschijnt met een kortere latentie dan de monosynaptische EPSP. Als er voldoende stroom via de micro-elektrode wordt geïnjecteerd om een spike te triggeren, kan er na een korte vertraging EMG-activiteit in de spier worden geregistreerd, gevolgd door een spiertrek.

Na de identificatie van het motorneuron kunnen de elektrofysiologische eigenschappen ervan worden gekarakteriseerd. Deze figuur illustreert bijvoorbeeld hoe de inputweerstand kan worden gemeten door gebruik te maken van hyperpolariserende en depolariserende stroompulsen en het uitzetten van de variaties in het membraanpotentiaal tegenover de hoeveelheid geïnjecteerde stroom. De contractiele eigenschappen van de motorische eenheid kunnen ook worden bestudeerd met behulp van verschillende stimulatieprotocollen.

Bijvoorbeeld kan de kracht-frequentierelatie worden bepaald door korte stroompulsen met verschillende frequenties in het motorneuron te injecteren. De steady-state kracht kan vervolgens worden uitgezet tegen de frequentie van de stroompulsen om een sigmoïdale kracht-frequentiecurve te verkrijgen. Zodra de chirurgische ingreep onder de knie is, kan een deel van deze techniek in drie uur worden uitgevoerd indien dit correct gebeurt.