Gelijktijdig Elektro, Real-time meting van lactaatconcentratie en Optogenetic Manipulatie van neuronale activiteit in de Rodent Cerebral Cortex

Het algemene doel van deze procedure is om EEG-gedefinieerde slaap en lactaatconcentratie te meten tijdens optogenetische stimulatie op precieze stereotaxische coördinaten. Implanteer chirurgisch de noodzakelijke elektro-encefalografische leads en canules voor een lactaatsensor en een glasvezelkabel. Breng vervolgens de glasvezelkabel en de vooraf gekalibreerde lactaatsensor in hun geleidecanules in de schedel van het dier.

Pas vervolgens de intensiteit van het blauwe lichtstimulus aan om het gewenste elektrofysiologische antwoord te bereiken. Verzamel vervolgens de elektro-encefalografische, elektromyografische en lactaatconcentratiegegevens terwijl het dier spontaan mag bewegen en/of slapen. In vergelijking met andere methoden zoals farmacologische studies van het EEG, heeft deze experimentele aanpak het voordeel dat de hersenbiochemie en elektrofysiologie worden gemonitord terwijl de activiteit van neuronen in real-time op een sub-seconden tijdschaal wordt gemanipuleerd.

Er is dus een groot potentieel om nieuwe inzichten op te leveren voor het slaaponderzoeksveld. Bijvoorbeeld, men kan metabole en elektrofysiologische bijkomstigheid van langzamegolfslaap identificeren. Dit type experiment kan ook worden toegepast in andere gebieden van de neurowetenschappen, zoals leren en geheugen, synaptische plasticiteit of epileptische stoornissen.

De chirurgische techniek is technisch uitdagend. Het vereist een goede dosis handigheid, maar dat kan worden bereikt door oefening. In deze visuele demonstratie zal ik de cruciale stappen van enkele ingewikkelde chirurgische procedures itereren die de geschreven beschrijving zullen aanvullen.

Zodra een dier is hersteld van de operatie, is de uitdaging om de lactaatsensor en de glasvezelkabel correct in te brengen. Jonathan en ik zullen demonstreren hoe je een stevige hand moet gebruiken bij het vasthouden van het dier om deze twee delicate stukken apparatuur in te brengen. Ten slotte zullen we laten zien hoe je de EEG-respons optimaliseert door de intensiteit van het stimulus in real-time aan te passen.

Gebruik voor dit experiment transgene muizen die het blauwlichtgevoelige kationenkanaal tot expressie brengen. Het kanaal neemt op in twee in cerebrale corticale neuronen. Anesthesier eerst de muis met 5% isoflurine, 95% zuurstof voor inductie terwijl de anesthesie wordt gehandhaafd met 3% isoflurine, 97% zuurstof.

Maak een mediale incisie op de bovenkant van de schedel van tussen de ogen tot aan de achterkant van de schedel. Reinig de schedel met waterstofperoxide en steriel zoutoplossing. Localiseer en markeer B en Lambda voor het bepalen van stereotaxische coördinaten voor elektrode optogenetische stimulusconfiguraties. Prime schroefgaten met een hoogsnelheids tandborstel met een balfrezen met een diameter van 0,5 millimeter gevolgd door een balfrezen met een diameter van 0,7 millimeter.

Breng de elektrode kelo gram schroeven in de gaten met een schroefdraadhandschroevendraaier. Drijf ze in ongeveer vier tot vijf omwentelingen om de gewenste diepte te verkrijgen. Houd de geleidecanules op hun plaats met een stereotaxische canule en bevestig ze vervolgens aan de schedel en ankers met acrylcement. Om de doorlaatbaarheid te behouden, zou elke geleidecanule een dummy canule of stylest moeten bevatten vanaf het moment van de operatie tot het moment van experimenteren.

Zodra EEG's en geleidecanules in de schedel zijn gepositioneerd, bind ze samen met een dunne laag tandheelkundig acrylcement. Nadat het cement is uitgehard, plaats je de kunststof connector boven de opgedroogde cementheuvel die aan de uiteinden van de draden die uit de EEG-leidingen naar de contacten op de kunststof connector lopen, is verkocht, voor het geval de draadleidingen in het cement terechtkomen. Trek vervolgens de elektromyogramdraden door de nucle-spieren door ze in de schacht van een naald met een diameter van 21 gauge te schuiven.

Boor door het spierweefsel en maak een dubbele chirurgische knoop met een vijf nul nylonnaald rond deze draden net distaal van waar ze uit het spierweefsel komen. Naai de huid die is teruggetrokken om toegang tot het spierweefsel te krijgen, samen met enkele onderbroken chirurgische knopen met behulp van een omkeerbaar snijdende P drie naald en vijf nul nylonnaald. Zodra de mc stimulus unit is geprogrammeerd, gebruik hem als een standalone signaalgenerator als een vijf volt binair on-off signaal. Verbind de mc stimulus unit met de TTL-ingeschakelde voedingseenheid van de laser met BNC-connectoren.

Verbind de laservoedingseenheid met de laser via een lintkabel. Verbind ook de laser met de mannelijke FC-connector op de oorspronkelijke glasvezelpatchkabel. Verbind de oorspronkelijke glasvezelkabel met de draaibare verbinding.

De commutator Glasvezel draaibare verbinding dient als een commutator. Terwijl het dier zich in zijn kooi beweegt, draait de draaibare verbinding om breuk van de glasvezelkabels te voorkomen als gevolg van rotatietorque. Bevestig de commutator met plastic kabelbinders aan een metalen standaard die boven de cilindrische kooi is geplaatst waarin het dier is gehuisvest.

Beperk de muis door één hand te gebruiken om de muis onder een holle handpalm te pinnen. Orienteer het hoofd tussen de middelste en wijsvinger van de experimentator. Maak nu de geleidecanule schoon van puin, puin met behulp van een steriele 25 gauge naald.

Breng vervolgens de glasvezelkabel met de hand in en bevestig deze aan de glasvezelgeleidecanule met een schroefdopmok. Beheer de invoegdiepte van de glasvezelkabel in de hersenen door een hechtknop op de glasvezelkabel op een vaste afstand van het platte gekloven uiteinde. De sensor is e quatief in fosfaatgebufferde zoutoplossing en wordt in stapsgewijze wijze blootgesteld aan drie concentraties L-lactaat.

Volgens de protocollen van de fabrikant, breng de vooraf gekalibreerde sensor in de op de schedel gemonteerde lactaatgeleidecanule op een identieke manier in als de inbrengprocedure van de glasvezelkabel. Verbind de lactaatsensor met de pre-versterker van de Pinnacle 8, 400 biosensor met bipolaire plugconnectoren. Bevestig vervolgens deze pre-versterker aan de achtpinsconnector op de chirurgisch geïmplanteerde hoofdmontage.

Voordat je gegevens verzamelt,