Snelle en efficiënte generatie van de neuronen van menselijke pluripotente stamcellen in een Multititre Plate Format

Het algemene doel van het volgende experiment is om humane pluripotente stamcellen of H PSC's te differentiëren in neuronen met behulp van een multi titer plate formaat. Dit wordt bereikt door een enkele cel suspensie van H PSC's te oogsten en te plateren in V-vormige 96-welplaten om embryolichaampjes of EBS 's nachts te vormen.

Vervolgens worden de EBS overgebracht naar U-vormige ultra-lage hechtingsplaten die differentiatiemedium bevatten om de vorming van neuroectoderm te induceren. Vervolgens worden de EBS geplaatst op met matrigel beklede schalen om de uitgroei van neuronen te bevorderen. Resultaten kunnen worden verkregen die de aanwezigheid van typische neuronale markeren rond dag acht laten zien door immunofluorescence.

Kleurprotocollen voor het differentiëren van humane pre potentieel stamcellen in neuronen zijn vaak ingewikkeld en vervelend. Enigszins per ongeluk. We kwamen een zeer eenvoudige procedure tegen voor het maken van neuronen uit humane pre potentieel stamcellen.

Vanuit technisch oogpunt is het grote voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden dat het eenvoudig uit te voeren, snel en kosteneffectief is. Tegelijkertijd zal het proces worden gepresenteerd door Dr. MI Z van het lab. Bereid EB-vormingsmedium en differentiatiemedium voor zoals beschreven in het geschreven protocol.

Laat h PSC's groeien onder feeder-vrije omstandigheden, zoals een met meth geconditioneerd medium op matrigel gecoate platen, of met behulp van chemisch gedefinieerde kweeksystemen onder sub-confluent actief groeiende omstandigheden. Gebruik een stereomicroscoop met een steriele plastic pipettip om spontaan gedifferentieerde kolonies mechanisch te verwijderen. Was resterende ongedifferentieerde kolonies met PBS en gebruik Accutane met één x rock-inhibitor om tot enkele cellen te verteren.

Pellet de enkele cellen door centrifugatie bij 200 G gedurende twee minuten en resuspendeer in een klein volume van EB-vormingsmedium. Gebruik een hemo cytometer om de celtiter te bepalen. Voeg extra cellen toe aan het resterende EB-vormingsmedium om een titer tussen 40.000 en 80.000 cellen per milliliter te bereiken.

Gebruik een multi-kanaals pipet om 100 microliter per putje over te brengen naar een 96 V-bodemplaat, wat resulteert in 4.000 tot 8.000 cellen per.Putje. Draai de plaat in een swing up plate centrifuge bij 400 G gedurende één minuut om alle cellen op de bodem van de putjes te verzamelen. Breng de cellen over naar een incubator en laat EBS de volgende dag gedurende de nacht vormen onder de stereomicroscoop.

Verzamel EBS en breng ze in een klein volume over naar een bacteriële schaal van 3,5 centimeter met twee milliliter differentiatiemedium. Was de cellen door de schaal voorzichtig te draaien. Voeg 100 microliter differentiatiemedium toe aan elke put van een ultra lage hechting.

96-welplaat onder een stereomicroscoop. Breng EBS in kleine volumes over van de wasschaal naar de 96 U-putjes. Incubeer de EBS gedurende vier dagen om de vorming van neuroectoderm op de vierde dag mogelijk te maken.

Was de cellen in differentiatiemedium en zaai ze een voor een in de putjes van een met matrigel beklede multi titer plaat, zoals een 12-welplaat. De cellen moeten gelijkmatig over de putjes worden verdeeld om een ongestoord uitgroeien van neuronen mogelijk te maken. Laat de EBS ongeveer 10 minuten losjes aan de matrigel hechten bij kamertemperatuur.

Breng de plaat vervolgens voorzichtig naar de incubator. Neuronen zullen in de komende vier dagen uit de geplateerde EBS in radiale richting groeien. Eerder toonden we aan dat, in overeenstemming met vele anderen, EBS van H PSC's eenvoudig konden worden gegenereerd door te replateren, aggregaten bij routinematig splitsen van H HPC's in laag hechtende schalen.

Dit resulteert meestal in een brede verdeling van celgrootten. Een ander probleem is dat EBS die in suspensie worden gehouden, de neiging hebben om met elkaar te aggregaten, wat leidt tot nog hogere heterogeniteit in grootte. Om dit te omzeilen, werden enkele H PSC's in laag hechtende putjes geplaatst, wat resulteerde in geen EB-vorming en celdood. Het combineren van het celoverlevingsmolecuul, Y 2 7 6 3 2 met polyvinylalcohol, waarvan is aangetoond dat het de EB-vorming van HSC's bevordert, maakte het mogelijk dat EBS uit enkele cel HESC-suspensies 's nachts vormden.

Gemakkelijk kunnen EB-groottes in dit multi titer plate formaat strak worden gecontroleerd door verschillende aantallen cellen per putje te plaatsen. In tegenstelling tot het gebruik van conventionele technieken, werd na overdracht van EBS naar ultra-lage hechting 96 U platen, neuroectoderm vorming geïnduceerd met behulp van een kleine molecuulcocktail bestaande uit F-G-F-E-R-K-T-G, TGF beta SMA twee en BP SMA één remmers, waardoor de cellen vervolgens op matrigel konden worden geplaatst om neuronen te geven. Het initiëren van EB-vorming vanaf ongeveer 8.000 cellen leverde de beste neuronale differentiatiecapaciteit op, die wordt gekenmerkt door uitgesproken neuronale uitgroei uit de geplateerde ebs.

Verminderde necrotische EB-centra na plateren en hoge expressie van sensorische en pan-neuronale markeren zoals B rrn drie A en beta drie tubuline. De algehele neuronale differentiatie-efficiënties lijken vergelijkbaar te zijn met de oorspronkelijke procedure, die tot nu toe van toepassing is op zowel HSC's als HI PSC's. Drie onafhankelijke HPSC-lijnen, HES en HIPS-cellen zijn met succes getest in de multi-well procedure, terwijl cellijnafhankelijke variabiliteit en differentiatie-efficiënties over het algemeen niet kunnen worden uitgesloten.

Deze figuur toont gedissocieerde enkeldaagse neuroectodermale cellen die als enkele cellen zijn geplaatst en met succes zijn gedifferentieerd bij ongeveer 60% efficiëntie. Het hanteren van EBS in de multi titter platform vereist in het begin wat training, maar na enige tijd zul je zien dat het vrij eenvoudig is.