Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis
28 september 2012
Hier presenteren we een methode voor de fotogeactiveerde omschakeling van fotoconverteerbare fluorescente eiwitten (PCFP's) in het levende zebravis-embryo en verder volgen van fotogeconverteerd eiwit op specifieke tijdstippen tijdens de ontwikkeling. Deze methodologie maakt het mogelijk om celbiologische gebeurtenissen die ten grondslag liggen aan verschillende ontwikkelingsprocessen in een levend gewerveld organisme te monitoren.
Het algemene doel van deze procedure is om foto omgeschakelde cellen in een levend zebravis embryo te volgen. Dit wordt bereikt door eerst een embryo in te bedden, dat een weefselspecifiek foto-omkeerbaar fluorescerend eiwit met een lage smelttemperatuur in aros tot expressie brengt. Vervolgens wordt het eiwit binnen het gebied van belang volledig foto omgezet.
Vervolgens wordt het embryo voorzichtig uit aros verwijderd en in eiwater op 28,5 graden Celsius bewaard tot latere stadia. Uiteindelijk wordt het foto omgezette embryo weer in aros met lage smelttemperatuur ingebed. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen die laten zien dat foto omgezette cellen in latere stadia nauwkeurig kunnen worden gedetecteerd vanwege de stabiele aanwezigheid van het foto omgezette eiwit door middel van confocale microscopie.
Dus we denken dat de methode die we vandaag zullen presenteren, behoorlijk nuttig zal zijn in de context van cel- en ontwikkelingsbiologie. Dus we denken dat het gebruik van deze methodologie in de context van celmigratie, weefseldynamica en andere celgedragingen behoorlijk nuttig zal zijn. De procedure zal worden gedemonstreerd door Veronica Lombardo, een postdoc uit mijn lab Na het kruisen van transgene zebravissen, die een foto-omkeerbaar fluorescerend eiwit tot expressie brengen.
Kies de helderste embryo's die homozygoot zijn en kweek ze op 28,5 graden Celsius wanneer ze de gewenste fase hebben bereikt. Gebruik een pincet om ze te decoaten in een glazen container met eiwater om de embryo's te verdoven. Gebruik een glazen pipet of een afgesneden pipettip om ze één voor één in trica over te brengen.
Breng een verdoofde embryo over op het deksel van een kweekschaal en houd het embryo binnen het kleinst mogelijke volume medium. Breng het embryo over in aros door het met 1% aros met lage smelttemperatuur met trica bij 30 graden Celsius te pipetten en plaats het in een kweekschaal met een glazen bodem. Gebruik een gladde plastic tip om het embryo te oriënteren wanneer de aros is gepolymeriseerd.
Bedek het met Trica-oplossing op een omgekeerde confocale microscoop uitgerust met 405 488 en 561 nanometer laserbronnen en een 20 x objectief. Gebruik de 488 en 561 nanometer lasers om een Z-stack van de gehele structuur van het specimen te genereren, inclusief het gebied van belang. Selecteer de tijdreeksentool en stel in voor twee cycli zonder interval, één voor pre en één voor post foto-conversie.
Selecteer het regio's-gereedschap en definieer een of meer gebieden van belang voor fotoconversie. Selecteer vervolgens het verblekingsgereedschap en stel in om te beginnen met verbleken na scan. Een van de twee hier gebruikte is een 30 milliwatt 405 nanometer diodelaser.
Zorgvuldig geoptimaliseerd voor de minimale hoeveelheid laserlicht die nodig is voor volledige fotoconversie, wat wordt bereikt door de intensiteit van het laserlicht, de scaniteraties van het gebied van belang en de scansnelheid te variëren. Scan het monster met de 488 nanometer en 561 nanometer lasers om eventuele resterende groene en de foto omgezette rode fluorescentie van het foto-omkeerbaar fluorescerend eiwit te visualiseren. Na fotoconversie, gooi de oplossing weg en verwijder het embryo voorzichtig uit de aros met behulp van een naald of gladde plastic tip.
Houd het embryo in eiwater in het donker op 28,5 graden Celsius tot het gewenste ontwikkelingsstadium. Bedenk het embryo een tweede keer, genereer vervolgens een Zack van het specimen, inclusief het gebied van belang, opnieuw met behulp van de 488 en 561 nanometer lasers. Omdat dit protocol de normale ontwikkeling niet beïnvloedt, is het mogelijk om het foto omgezette embryo in latere stadia te observeren.
Hier is een voorbeeld van een fotoconversie-assay. Endotheelcellen werden gevolgd tijdens de ontwikkeling van zebravissen van 48 tot 72 uur na bevruchting met behulp van een transgene reporterlijn die kick G tot expressie brengt binnen endotheelkernen zoals hier getoond voor fotoconversie. Kick G werd tot expressie gebracht binnen endotheelweefsel en was alleen detecteerbaar als groene fluorescentie met behulp van een 488 nanometer argonlaser controle-scans met een 561 nanometer laser voor rode fluorescentie. Er werd geen foto omgezette kick GR gedetecteerd vóór de fotoconversie.
Vervolgens werd het gebied van belang volledig foto omgezet met behulp van een 405 nanometer diodelaser met 10% intensiteit, 20 iteraties en de hoofdvaten werden opnieuw gescand met behulp van de 488 nanometer en 561 nanometer lasers. In dit paneel was groen kick G volledig omgeschakeld naar rood binnen het gebied van belang om de foto omgezette endotheelcellen in latere stadia te volgen. Het embryo werd waargenomen op 24 uur na fotoconversie, wat ongeveer 72 uur na bevruchting is binnen endotheelweefsels die voortkomen uit het foto omgezette gebied van belang.
Zowel niet-foto omgezette als foto omgezette kick G-eiwitten werden waargenomen vanwege de stabiliteit van het rode fluorescerende foto omgezette kick g en de synthese van nieuw groen niet-geconverteerd kick G Na zijn ontwikkeling. Deze techniek heeft de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van ontwikkelingsbiologie om celbiologie en weefselremodellering in verschillende vissen te verkennen.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een methode voor het volgen van foto-geschakelde cellen in levende zebravis-embryo's met behulp van fotoconvernte fluorescente eiwitten. De techniek maakt het mogelijk om celbiologische gebeurtenissen tijdens de ontwikkeling te monitoren door middel van confocale microscopie.
Belangrijke onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Celbiologie
- Ontwikkelingsbiologie
Achtergrond
- Fotoconvernte fluorescente eiwitten (PCFP's) maken visualisatie van specifieke cellen mogelijk.
- Het volgen van cellulaire gebeurtenissen in levende organismen is cruciaal voor het begrijpen van ontwikkeling.
- Zebravis-embryo's zijn een modelorganisme voor het bestuderen van de ontwikkeling van gewervelden.
- Confocale microscopie biedt beeldvorming met hoge resolutie van biologische monsters.
Doel van het onderzoek
- Om een methode te ontwikkelen voor het volgen van foto-geschakelde cellen in zebravis-embryo's.
- Om de stabiliteit van fotogeconverteerde eiwitten tijdens de ontwikkeling te monitoren.
- Om het begrip van ontwikkelingsprocessen in levende gewervelden te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Inbedding van zebravis-embryo's in agarose met lage smelttemperatuur.
- Expressie van weefselspecifiek fotoconvernte fluorescente eiwitten.
- Fotoconversie van eiwitten in het gebied van belang.
- Onderhoud van embryo's in eiwater bij 28,5 graden Celsius voor ontwikkeling.
Belangrijkste resultaten
- Foto-geconverteerde cellen kunnen worden gedetecteerd in latere ontwikkelingsstadia.
- De stabiele aanwezigheid van fotogeconverteerde eiwitten maakt nauwkeurig volgen mogelijk.
- Confocale microscopie visualiseert effectief de foto-geschakelde cellen.
- De methodologie kan worden toegepast op verschillende ontwikkelingsstudies.
Conclusies
- De gepresenteerde methode is effectief voor het volgen van cellulaire gebeurtenissen in levende zebravis-embryo's.
- Het biedt inzichten in ontwikkelingsprocessen en celbiologie.
- Deze aanpak kan worden gebruikt in toekomstige studies van de ontwikkeling van gewervelden.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Cell tracking using photoconvertible proteins enables precise monitoring of cellular dynamics in vivo, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides quantitative, reproducible data on cell fate and tissue remodeling, enhancing predictive confidence in preclinical models. The method’s applicability to zebrafish—a disease-relevant system—facilitates translational biomarker alignment and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by tracking specific cell populations during morphogenesis.
- Operational Value: Supports biological de-risking through direct visualization of protein fate changes in intact organisms.
- Predictive Value: Generates stable, quantifiable readouts for assessing target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, fluorescent outputs compatible with confocal imaging for high-content screening.
- Reproducibility: Ensures consistent photoconversion efficiency via controlled laser parameters and embedding protocols.
- Scalability: Compatible with multi-well formats and automated microscopy for longitudinal studies.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Tracks endothelial and other cell types in zebrafish models of vascular and developmental disorders.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation by monitoring cellular events across developmental stages.
- Risk-Adjusted Decisions: Provides mechanistic insights that inform go/no-go criteria for target advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis-driven cell tracking, supporting assay development for phenotypic screening, and informing translational research through longitudinal fate mapping.
- Discovery Biology: Facilitates pathway clarification and target validation by isolating cellular contributions to morphogenetic processes.
- Screening: Generates quantitative fluorescence readouts for compound effect assessment in live embryos.
- Analytics: Delivers stable red/green signal ratios for objective comparison of photoconversion efficiency and protein turnover.
- Translational Research: Supports biomarker alignment by linking cellular dynamics to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for tracking multiple cell types across diverse zebrafish transgenic lines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing ambiguity in cellular mechanism and target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized embedding, photoconversion, and imaging protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets via direct cell fate observation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on quantitative, mechanism-linked cellular phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, transgenic line maintenance, and confocal microscopy operation.
- Dependent on access to UV/blue laser sources (405 nm) and compatible photoconvertible protein expression systems.
- Necessitates standardization of laser intensity, scan speed, and iteration counts for reproducible photoconversion.
- Requires optimization across tissue types and developmental stages to avoid phototoxicity and ensure signal stability.
- Limited by the need for genetic accessibility and embryonic viability during prolonged imaging sessions.
