Name: Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Leer celtracking met fotoconverteerbare eiwitten in levende zebravisembryo's via confocale microscopie. Deze methode maakt precieze monitoring van ontwikkelingsbiologische processen mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Ian C. Scott voor het vriendelijk ter beschikking stellen van de transgene zebravislijn Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 aan het Hospital for Sick Children, Toronto, Canada. Wij danken de Confocal and 2-Photon Microscopy Core Facility (Max-Delbrueck-Center for Molecular Medicine) en Dr. Zoltan Cseresnyes voor de uitstekende technische assistentie en algemene ondersteuning bij de beeldvorming. S.A.-S. wordt ondersteund door een Heisenberg-beurs van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Dit werk werd ondersteund door DFG-subsidie SE2016/7-1.

1. Verkrijgen van embryo's voor de photoconversie-assay
Na inteelt van transgene zebravis die een PCFP tot expressie brengen, worden de helderste embryo's (die homozygoot zijn) geselecteerd en gekweekt bij 28.5 °C tot het gewenste embryonale stadium15.
Opmerking 1: Deze preselectie maakt het mogelijk om embryo's te scannen met een laag laservermogen, waardoor fototoxiciteit en fotobleking worden voorkomen.
Opmerking 2: Wij raden aan om licht van lage intensiteit te gebruiken bij het visualiseren van embryo's en om deze in het donker te bewaren vanwege de hoge gevoeligheid van PCFP's, zoals Kaede en KikGR, voor lichtblootstelling, inclusief daglicht.
2. Inbedding
<ol>
	<li>Dechorioneer embryo's onder een stereomicroscoop met behulp van een pincet in een glazen bak met ei-water.</li>
	<li>Anestheseer embryo's door een gedechorioneerd embryo over te brengen naar een 0,16 mg/ml Tricaine (3-amino benzoic acidethylester, Sigma-Aldrich) oplossing (40 μl van een 4 mg/ml stockoplossing in 1 ml E3 medium 1X).</li>
</ol>
Opmerking 1: Verplaats de embryo's met een glazen pipet of een pipet met afgeknipt uiteinde (P1000) om het risico op beschadiging van de embryo's te minimaliseren.
Opmerking 2: Jonge gedechoreioneerde embryo's mogen niet aan de lucht worden blootgesteld of naar het water/lucht-grensvlak worden getild, aangezien de eieren gemakkelijk scheuren bij mechanische stress.
<ol start="3">
	<li>Verplaats het geanestheseerde embryo naar de overkapping van een kweekschaal en houd het embryo in het kleinst mogelijke volume medium.</li>
	<li>Transfer het embryo in agarose door het embryo te pipetteren met 1% agarose met een laag smeltpunt (LMA, Lonza) bij 30 °C bevatten 0,16 mg/ml Tricaine, en plaats het op het dekglas van een kweekschaal met een glazen bodem (MatTek Corp. Ashland MA USA). Orienteer het embryo vervolgens met behulp van een gladde plastic tip (bijv. een afgesneden Microloader Pipette Tip, Eppendorf) en bedek de agarose met 0,16 mg/ml Tricaine-oplossing zodra de LMA is gepolymeriseerd.</li>
</ol>
Opmerking 1: Smelt 1% LMA bij 60 °C en houd de gesmolten agarose op 30 °C.
3. Fotoconversie
<ol>
	<li>Visualiseer het monster op een geïnverteerde confocale microscoop uitgerust met een 405 nm, 488 nm en 561 nm laserbron, zoals de Zeiss LSM 710, door middel van een z-Stack scan die de gehele structuur van het specimen beslaat dat later zal worden gefotoconverteerd en gevolgd, gebruikmakend van de 488 nm laser (i.e., 30 mW Ar laser, bij 5-7 % intensiteit, detector ingesteld op 493-540 nm) en de 561 nm laser (i.e., 10 mW DPSS 561 laser, bij 7-9 % intensiteit, detector ingesteld op 587-651) om het weefsel/orgaan te scannen op respectievelijk groene en rode fluorescentie van de fotoconverteerbare eiwitten.</li>
</ol>
Opmerking 1: Voor de scan vóór fotoconversie hebben we een Plan Apochromat 20x/NA 0,8 objectief gebruikt.
Opmerking 2: Scan altijd voorafgaand aan het experiment op rode fluorescentie om uit te sluiten dat er per ongeluk gegenereerd rood geconverteerd PCFP aanwezig is.
<ol start="2">
	<li>Selecteer de tool Time series en stel deze in op 2 cycli zonder interval (één voor vóór en één voor na de photoconversie).</li>
	<li>Selecteer de tool Regions en definieer één of meer regio's van belang (ROI) voor de photoconversie.</li>
</ol>
Opmerking 1: Wij raden aan om eerst de precisie te bepalen waarmee het gebied dat daadwerkelijk door de scanlaser in de ROI is gefotoconverteerd overeenkomt met de in de software geselecteerde ROI, door het oppervlak van gefotoconverteerd weefsel/cellen in alle drie de richtingen (xy- en z-richting) te meten in een gefixeerd monster waarin geen cel- of eiwitbeweging wordt verwacht. Voor de instellingen die in deze applicatie worden beschreven, kwam de ROI met grote precisie overeen met het gefotoconverteerde gebied, maar dit is afhankelijk van het gebruikte objectief en de hoeveelheid laserlicht die voor fotoconversie is toegepast. De grootte van de ROI kan, afhankelijk van de numerieke apertuur van het objectief, de zoomfactor en de hoeveelheid laserlicht die voor fotoconversie wordt gebruikt, worden teruggebracht tot de grootte van een enkele cel.
<ol start="4">
	<li>Selecteer de Bleken instrumentarium en set voor het starten van het bleken na scan 1 van 2. We gebruikten een 405 nm diodelaser van 30 mW voor fotoconversie en optimaliseerden dit zorgvuldig voor de minimale hoeveelheid laserlicht die nodig is voor volledige fotoconversie, wat voornamelijk werd bereikt door de intensiteit van het laserlicht, de scaniteraties van de ROI en de pixeltijd te variëren (d.w.z., scansnelheid).</li>
</ol>
Opmerking 1: Voor fotoconversie hebben wij een Plan Apochromat 20x/NA 0,8 objectief gebruikt.
Opmerking 2: Het vermogen van de laser en het aantal iteraties moeten empirisch worden bepaald voor elke experimentele setting en moeten zorgen voor een volledige fotoconversie van groen naar rood PCFP binnen de ROI met de minimale benodigde hoeveelheid laserlicht om fototoxiciteit te verminderen. We raden aan om tests te starten met een laag laservermogen (bijv. 3 %, wat overeenkomt met 0,03 mW in het objectiefplan) in combinatie met een laag aantal iteraties (bijv. 20), en vervolgens het laservermogen te verhogen tot volledige fotoconversie is bereikt, wat in onze praktijk bij 10% laservermogen was (overeenkomend met 0,1 mW in het objectiefplan). Onder deze omstandigheden overleefden alle geteste embryo's het behandelingsplan. Desondanks hebben we waargenomen dat het eigeelmembraan gevoelig is voor laserpulsen en gemakkelijk beschadigd kan raken, wat leidt tot de dood van het embryo. Om deze reden kan embryoletaliteit na fotoconversie optreden als de positie van het doelweefsel dicht bij het eigeel lichaam ligt.
<ol start="5">
	<li>Scan het monster via een z-stack met lasers van 488 nm en 561 nm om eventuele resterende groene en de photoconverteerde rode fluorescentie van het PCFP te visualiseren.</li>
</ol>
Opmerking 1: Voor de scan na fotoconversie hebben we een Plan Apochromat 20x/NA 0.8 gebruikt.
4. Verwijder het embryo uit de agarose
<ol>
	<li>Gooi de oplossing weg en verwijder het embryo voorzichtig uit de 1% LMA met behulp van een naald of een gladde plastic tip.</li>
	<li>Houd het embryo in eitjeswater in het donker bij 28.5 °C tot het gewenste ontwikkelingsstadium is bereikt.</li>
</ol>
Opmerking 1: Het is belangrijk dat de embryo's hun ontwikkeling voortzetten in eiwater, met name tijdens de eerste dagen van de ontwikkeling tijdens de verlenging van het embryonale lichaam. Sommige embryonale weefsels/organen veranderen namelijk van positie tijdens de ontwikkeling en vereisen daarom specifieke oriëntaties tijdens het inbedden, afhankelijk van het betreffende weefsel/orgaan van belang en het gewenste ontwikkelingsstadium van de analyse.
5. Opnieuw inkapselen
<ol>
	<li>Ga te werk zoals beschreven onder punt 2.) van dit protocol.</li>
</ol>
6. Volgen van fotoconverterd weefsel in latere embryonale stadia
<ol>
	<li>Scan van het interessegebied (z-stack) met lasers voor 488 nm en 561 nm voor respectievelijk groene en rode fluorescentiesignalen.</li>
</ol>
Opmerking 1: Voor de scan x uur na photoconversie hebben we een Plan Apochromat 20x/NA 0,8 gebruikt.
Opmerking 2: Aangezien dit protocol de normale ontwikkeling van het embryo niet beïnvloedt, is het mogelijk om het fotogECONverteerde embryo in latere ontwikkelingsstadia te observeren (volg hiervoor de stappen zoals beschreven onder punten 4 - 6).
7. Representatieve resultaten
Een voorbeeld van een photoconversie-assay wordt getoond in Figuur 1. We hebben endotheelcellen gevolgd tijdens de ontwikkeling van de zebravis (zie16 voor een overzicht van de vasculaire anatomie van de ontwikkelende zebravis). Hiervoor hebben we een zebravis Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 reporterlijn gebruikt die KikGR tot expressie brengt in endotheelkernen17. Homozygote embryo's met een sterke expressie werden gekweekt bij 28,5 °C tot 48 uur na bevruchting (hpf). Na dechorionering werden de embryo's geanestheseerd en ingebed in LMA, waarbij de anterieur-dorsale zijde van het embryo naar het dekglas werd gericht voor een betere visualisatie van de vaten in de kop. We maken gebruik van een inverted confocale microscoop (Zeiss LSM 710 Meta) uitgerust met lasers die werken op 405 nm, 488 nm en 561 nm, en een Plan Apochromat 20x/NA 0,8 objectief voor de photoconversie-assay en het verdere volgen van het photoconverteerde eiwit. Zoals getoond in Figuur 1A, werd KikGR vóór de photoconversie tot expressie gebracht in endotheelweefsel en was dit alleen detecteerbaar als groene fluorescentie met behulp van een 488 nm Argon-laser. Controle-scans met een 561 nm DPSS 561-10 laser voor rode fluorescentie detecteerden geen photoconverteerde KikGR voorafgaand aan de photoconversie (Figuur 1A). Vervolgens werd de ROI volledig photoconverteerd met behulp van een 405 nm Diode-laser (bij 10% intensiteit, 20 iteraties) en werden de vaten in de kop opnieuw gescand met de 488 nm en 561 nm lasers (Figuur 1B). Zoals getoond in Figuur 1B, was groene KikGR binnen de ROI volledig overgegaan naar rood. Na de photoconversie-assay werd het embryo uit de agarose verwijderd en gekweekt bij 28,5 °C in eitjeswater. Tot slot werd het embryo 24 uur na de photoconversie opnieuw geobserveerd, rond 72 hpf, om de photoconverteerde endotheelcellen in latere stadia te volgen (Figuur 1C). Hiervoor werd het embryo opnieuw ingebed in LMA en werd het monster opnieuw gescand met de 488 nm en 561 nm lasers. Zoals getoond in Figuur 1C, werden binnen het endotheelweefsel dat voortkwam uit de photoconverteerde ROI zowel niet- als photoconverteerde KikGR-eiwitten waargenomen, vanwege de stabiliteit van het rood fluorescerende photoconverteerde KikGR en de resynthese van nieuwe groene niet-photoconverteerde KikGR.
<img alt="Fotoconversieproces in zebravissen; verandering van fluorescent eiwit in microscopiebeelden over tijd." src="/files/ftp_upload/4350/4350fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figuur 1"> 
Figuur 1. Fotoconversie van KikGR tijdens de ontwikkeling van de zebravis. (A,B) Een specifiek gebied van de endotheliale vaatstructuur in de kop werd gefotoconverteerd bij 48 hpf in Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 transgene embryo's en (C) opnieuw waargenomen 24 uur na fotoconversie (rond 72 hpf). De fluorescentie van KikGR (groen), gefotoconverteerde KikGR (rood) en samengevoegde kanalen worden getoond. Gestippelde cirkels geven de ROI aan vóór, tijdens en 24 uur na fotoconversie. De beelden zijn dorsale aanzichten van het zebravissenembryo, met de anterieure zijde onderaan. Schaalbalken: 50 μm.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr>
			<td>Proteïne (acroniem)</td>
			<td>Ex (nm)</td>
			<td>Em (nm)</td>
			<td>EC </td>
			<td>QY</td>
			<td>Quaternaire structuur</td>
			<td>Helderheid </td>
			<td>Toepassing</td>
			<td>Ref</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaede_G</td>
			<td>508</td>
			<td>518</td>
			<td>99</td>
			<td>0.9</td>
			<td>tetrameer</td>
			<td>259</td>
			<td rowspan="2">Celtracking</td>
			<td rowspan="2">2,6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kaede_R</td>
			<td>572</td>
			<td>580</td>
			<td>60</td>
			<td>0.3</td>
			<td>tetrameer</td>
			<td>59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KikGR_G</td>
			<td>507</td>
			<td>517</td>
			<td>54</td>
			<td>0.7</td>
			<td>tetrameer</td>
			<td>112</td>
			<td rowspan="2">Celtracking</td>
			<td rowspan="2">3,6,8-10 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KikGR_R</td>
			<td>583</td>
			<td>593</td>
			<td>35</td>
			<td>0.6</td>
			<td>tetrameer</td>
			<td>68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mKikGR_G</td>
			<td>505</td>
			<td>515</td>
			<td>49</td>
			<td>0.7</td>
			<td>monomeer</td>
			<td>101</td>
			<td rowspan="2">Dynamische tracking Superresolutiebeelden</td>
			<td rowspan="2">13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mKikGR_R</td>
			<td>580</td>
			<td>591</td>
			<td>28</td>
			<td>0.6</td>
			<td>monomeer</td>
			<td>53</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EosFP_G</td>
			<td>506</td>
			<td>516</td>
			<td>72</td>
			<td>0.7</td>
			<td>tetrameer</td>
			<td>150</td>
			<td rowspan="2">Celtracking</td>
			<td rowspan="2">5,20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EosFP_R</td>
			<td>571</td>
			<td>581</td>
			<td>41</td>
			<td>0.5</td>
			<td>tetrameer</td>
			<td>67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdEos_G</td>
			<td>506</td>
			<td>516</td>
			<td>34</td>
			<td>0.7</td>
			<td>tandem dimeer</td>
			<td>165</td>
			<td rowspan="2">Superresolutiebeelden</td>
			<td rowspan="2">12,14,21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tdEos_R</td>
			<td>569</td>
			<td>581</td>
			<td>33</td>
			<td>0.6</td>
			<td>tandem dimeer</td>
			<td>59</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEos2_G</td>
			<td>506</td>
			<td>519</td>
			<td>56</td>
			<td>0.7</td>
			<td>monomeer</td>
			<td>140</td>
			<td rowspan="2">Dynamische tracking Superresolutiebeelden</td>
			<td rowspan="2">11,18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mEos2_R</td>
			<td>573</td>
			<td>584</td>
			<td>46</td>
			<td>0.7</td>
			<td>monomeer</td>
			<td>90</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendra2_G</td>
			<td>490</td>
			<td>507</td>
			<td>45</td>
			<td>0.5</td>
			<td>monomeer</td>
			<td>67</td>
			<td rowspan="2">Dynamische tracking Superresolutiebeelden</td>
			<td rowspan="2">4,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dendra2_R</td>
			<td>553</td>
			<td>573</td>
			<td>35</td>
			<td>0.55</td>
			<td>monomeer</td>
			<td>57</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabel I. Eigenschappen van photoconverteerbare fluorescerende eiwitten. Naast de gangbare naam en/of het acroniem voor elke PCFP worden in de tabel de piek-excitatie- (Ex) en emissiegolflengten (Em), molaire extinctiecoëfficiënten (EC, 10-3 M-1 cm-1 ), quantumopbrengst (QY), fysiologisch relevante quartaire structuur, relatieve helderheid (als % van EGFP), toepassing en referenties weergegeven. Tabel aangepast naar Day and Davidson, 20101.
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >PCFP</td>
			<td >Transgene zebravislijnen</td>
			<td >Bron</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="10">Kaede</td>
			<td >Tg(elavl3:Kaede)rw0130a</td>
			<td >Okamoto Lab</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede)</td>
			<td > </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(ins:Kaede)</td>
			<td > </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede)</td>
			<td > </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(lhx5:Kaede)b1204/+</td>
			<td >ZIRC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(myl7:kaede)</td>
			<td > </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(olig2:Kaede)</td>
			<td > </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t</td>
			<td >ZIRC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(UAS:Kaede)rk8</td>
			<td >ZIRC</td>
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(vsx2:Kaede)nns2</td>
			<td >Higashijima Lab</td>
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="5">KikGR</td>
			<td >Tg(kdrl:nlsKikGR)</td>
			<td > </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(krt4:NTR-KikGR)</td>
			<td > </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(myl7:nlsKikGR)</td>
			<td > </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(sox10:KikGR)</td>
			<td > </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(UAS:KikGR)</td>
			<td > </td >
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">EosFP</td>
			<td >Tg(sox10:EosFP)</td>
			<td > </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(sox10:nlsEosFP)</td>
			<td > </td >
		</tr >
		<tr >
			<td rowspan="2">Dendra</td>
			<td >Tg(-8mpx:Dendra2)</td>
			<td > </td >
		</tr >
		<tr >
			<td >Tg(UAS:Dendra-kras)</td>
			<td > </td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
Tabel II. Transgene zebravislijnen die PCFP tot expressie brengen. Gegevens verkregen uit de Zebrafish Model Organism Database (ZFIN, <a href="http://zfin.org/" target="_blank">http://zfin.org/</a>). De beschikbaarheid van lijnen in het Zebrafish International Resource Center (ZIRC, <a href="http://zebrafish.org/zirc/" target="_blank">http://zebrafish.org/zirc/</a>) is aangegeven.

<ol><li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescent+protein+palette%3A+tools+for+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem. Soc. Rev. 38, 2887-2921 (2009).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Tsutsui, H., Karasawa, S., Shimizu, H., Nukina, N., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-rational+engineering+of+a+coral+fluorescent+protein+into+an+efficient+highlighter%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Semi-rational engineering of a coral fluorescent protein into an efficient highlighter.</a> EMBO Rep. 6, 233-238 (2005).</li>
<li>Gurskaya, N. G., Verkhusha, V. V., Shcheglov, A. S., Staroverov, D. B., Chepurnykh, T. V., Fradkov, A. F., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat. Biotechnol. 24, 461-465 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J., Ivanchenko, S., Oswald, F., Schmitt, F., Rocker, C., Salih, A., Spindler, K. D., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Protoc. 1, 960-967 (2006).</li>
<li>Stark, D. A., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+comparison+of+photoactivatable+fluorescent+proteins+in+an+avian+embryo+model%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">An in vivo comparison of photoactivatable fluorescent proteins in an avian embryo model.</a> Dev. Dyn. 236, 1583-1594 (2007).</li>
<li>Kulesa, P. M., Teddy, J. M., Stark, D. A., Smith, S. E., McLennan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+invasion+is+a+spatially-ordered+progression+into+the+head+with+higher+cell+proliferation+at+the+migratory+front+as+revealed+by+the+photoactivatable+protein%2C+KikGR%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Neural crest invasion is a spatially-ordered progression into the head with higher cell proliferation at the migratory front as revealed by the photoactivatable protein, KikGR.</a> Dev. Biol. 316, 275-287 (2008).</li>
<li>Nowotschin, S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+KikGR+a+photoconvertible+green-to-red+fluorescent+protein+for+cell+labeling+and+lineage+analysis+in+ES+cells+and+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of KikGR a photoconvertible green-to-red fluorescent protein for cell labeling and lineage analysis in ES cells and mouse embryos.</a> BMC Dev. Biol. 9, 49(2009).</li>
<li>Griswold, S. L., Sajja, K. C., Jang, C. W., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+iUBC-KikGR+photoconvertible+transgenic+mice+for+live+time-lapse+imaging+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time-lapse imaging during development.</a> Genesis. 49, 591-598 (2011).</li>
<li>Baker, S. M., Buckheit, R. W. 3rd, Falk, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green-to-red+photoconvertible+fluorescent+proteins%3A+tracking+cell+and+protein+dynamics+on+standard+wide-field+mercury+arc-based+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Green-to-red photoconvertible fluorescent proteins: tracking cell and protein dynamics on standard wide-field mercury arc-based microscopes.</a> BMC Cell Biol. 11, 15(2010).</li>
<li>Watanabe, S., Punge, A., Hollopeter, G., Willig, K. I., Hobson, R. J., Davis, M. W., Hell, S. W., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+localization+in+electron+micrographs+using+fluorescence+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy.</a> Nat. Methods. 8, 80-84 (2011).</li>
<li>Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mKikGR%2C+a+monomeric+photoswitchable+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein.</a> PLoS One. 3, e3944(2008).</li>
<li>Fang, Z., Takizawa, N., Wilson, K. A., Smith, T. C., Delprato, A., Davidson, M. W., Lambright, D. G., Luna, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane-associated+protein%2C+supervillin%2C+accelerates+F-actin-dependent+rapid+integrin+recycling+and+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">The membrane-associated protein, supervillin, accelerates F-actin-dependent rapid integrin recycling and cell motility.</a> Traffic. 11, 782-799 (2010).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Isogai, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+anatomy+of+the+developing+zebrafish%3A+an+atlas+of+embryonic+and+early+larval+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">The vascular anatomy of the developing zebrafish: an atlas of embryonic and early larval development.</a> Dev. Biol. 230, 278-301 (2001).</li>
<li>Lazic, S., Scott, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mef2cb+regulates+late+myocardial+cell+addition+from+a+second+heart+field-like+population+of+progenitors+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mef2cb regulates late myocardial cell addition from a second heart field-like population of progenitors in zebrafish.</a> Dev. Biol. 354, 123-133 (2011).</li>
<li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li>
<li>Godinho, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of zebrafish development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011, 770-777 (2011).</li>
<li>Curran, K., Lister, J. A., Kunkel, G. R., Prendergast, A., Parichy, D. M., Raible, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+Foxd3+and+Mitf+regulates+cell+fate+plasticity+in+the+zebrafish+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interplay between Foxd3 and Mitf regulates cell fate plasticity in the zebrafish neural crest.</a> Dev. Biol. 344, 107-118 (2010).</li>
<li>Nienhaus, G. U., Nienhaus, K., Holzle, A., Ivanchenko, S., Renzi, F., Oswald, F., Wolff, M., Schmitt, F., Rocker, C., Vallone, B., Weidemann, W., Heilker, R., Nar, H., Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconvertible+fluorescent+protein+EosFP%3A+biophysical+properties+and+cell+biology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem.+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Photoconvertible fluorescent protein EosFP: biophysical properties and cell biology applications.</a> Photochem. Photobiol. 82, 351-358 (2006).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book.+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , 4th ed, Univ. of Oregon Press. Eugene. (2000).</li>
</ol>

Geen belangenverstrengeling gemeld.

In recente jaren zijn transgene diermodellen ontwikkeld voor de expressie van fotoconverteerbare eiwitten zoals Kaede of KikGR. Deze dieren ontwikkelen zich normaal, wat aangeeft dat deze eiwitten geen toxische effecten hebben op de embryonale ontwikkeling. De eerste rapportage over een fotoconversie-assay voor het volgen van cellen in dierembryo's werd uitgevoerd door Hatta en medewerkers via injectie van mRNA of DNA dat Kaede codeert in eencellige zebravisembryo's voor ubiquitaire expressie, of door expressie van Kaede...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materialen:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">Benodigde apparatuur voor het kweken van vissen en het verzamelen van eitjes (zie the Zebrafish Book22 voor details).</td></tr><tr><td>Stereomicroscoop</td><td>Leica</td><td>Lecia MZ6 Stereomicroscope</td><td>Uitgerust met laser werkend op 488 nm</td></tr><tr><td>Confocale laser scanning microscoop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss LSM 710 NLO</td><td>uitgerust met lasers werkend op 488 nm, 561 nm en 405 nm</td></tr><tr><td>Warmteblok</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Set Dumont #5 pincetten</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kweekschaal met dekglasbodem</td><td>MatTek Corp</td><td></td><td>Ashland MA USA</td></tr><tr><td>Microloader Pipetpunten</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>naalden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagentia:&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;Egg water medium&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>60 &amp;mu;g/ml Instant Ocean Sea Salts in ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;E3 medium &lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>5 mM NaCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.17 mM KCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.33 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.33 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.00001% (w/v) Methylene Blue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;4 mg/ml Tricaine stockoplossing &lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>400 mg Tricaine (3-aminobenzoëzuurethylester)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>97.9 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2.1 ml 1M Tris (pH9)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bijstellen op pH 7, aliquoteren en bewaren bij -20 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;1% LMA (Low melting temperature agarose, Lonza)&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>1g LMA/100 ml E3 medium 1X</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aliquoteren en bewaren bij 4 &amp;deg;C</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mobiele tracking met behulp van photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenese is een dynamisch proces dat het best bestudeerd kan worden met technieken die documentatie van ontwikkelingsveranderingen in vivo mogelijk maken. Het gebruik van genetisch gecodeerde fluorescerende eiwitten is een waardevolle strategie gebleken voor het ontrafelen van dynamische morfogenetische processen zoals deze plaatsvinden in het intacte organisme. Gedurende het afgelopen decennium heeft de ontwikkeling van fotoactivatable en photoconverteerbare fluorescerende eiwitten de mogelijkheid geopend om het lot van discrete subpopulaties van gemarkeerde eiwitten te onderzoeken1. In tegenstelling tot fotoactivatable eiwitten kunnen photoconverteerbare fluorescerende eiwitten (PCFPs) gemakkelijk worden gevolgd en afgebeeld in hun natuurlijke emissiestatus vóór photoconversie, waardoor het eenvoudiger is om regio's via optische inspectie te identificeren en te selecteren. PCFPs, zoals Kaede2, KikGR3, Dendra4 en EosFP5, kunnen bij blootstelling aan UV- of blauw licht verschuiven van groen naar rood vanwege een His-Tyr-Gly tripeptidevolgorde die een groen chromofoor vormt, welke door een lichtgekatalyseerde β-eliminatie en daaropvolgende uitbreiding van een π-geconjugeerd systeem kan worden photoconverteerd naar een rood chromofoor3. PCFPs en hun monomerische varianten zijn respectievelijk nuttige instrumenten voor het volgen van cellen6-10 en het bestuderen van eiwitdynamiek11-14. In recente jaren zijn PCFPs tot expressie gebracht in verschillende diermodelorganismen, zoals zebravis6, kip7,8 en muis9,10 voor het volgen van het celslot. Hier rapporteren wij een protocol voor cel-specifieke photoconversie van PCFPs in het levende zebravisembryo en het verdere volgen van photoconverteerde eiwitten in latere ontwikkelingsstadia. Deze methodologie maakt het mogelijk om, op weefselspecifieke wijze, celbiologische gebeurtenissen te bestuderen die ten grondslag liggen aan morfogenese in het zebravismodel.

Hier presenteren we een methode voor het foto-geactiveerd schakelen van photoconverteerbare fluorescerende eiwitten (PCFPs) in het levende zebravisembryo en het verdere volgen van het photoconverteerde eiwit op specifieke tijdstippen tijdens de ontwikkeling. Deze methodologie maakt het mogelijk om celbiologische gebeurtenissen te monitoren die ten grondslag liggen aan verschillende ontwikkelingsprocessen in een levend gewerveld organisme.

Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

Embryogenese is een dynamisch proces dat bij voorkeur wordt bestudeerd met technieken waarmee ontwikkelingsveranderingen in vivo kunnen worden gedocumenteerd. Het gebruik van ...

Het algemene doel van deze procedure is het volgen van gefotoschakelde cellen in een levend zebravisembryo. Dit wordt bereikt door eerst een embryo, dat een weefselspecifiek fotoconverteerbaar fluorescent eiwit tot expressie brengt, in laagsmeltende agarose in te bedden. Vervolgens wordt het eiwit binnen het gebied van interesse volledig gefotoconverteerd.Vervolgens wordt het embryo voorzichtig uit de agarose verwijderd en bewaard in eierwater bij 28,5 °C tot aan latere stadia. Ten slotte wordt het gefotoconverteerde embryo opnieuw ingebed in agarose met een laag smeltpunt. Uiteindelijk kunnen resultaten worden verkregen waaruit blijkt dat gefotoconverteerde cellen in latere stadia nauwkeurig kunnen worden gedetecteerd middels confocale microscopie, dankzij de stabiele aanwezigheid van het gefotoconverteerde eiwit.We denken dat de methode die we vandaag presenteren zeer nuttig zal zijn in de context van cel- en ontwikkelingsbiologie. We geloven dat het gebruik van deze methodologie in de context van celmigratie, weefseldynamiek en ander celgedrag erg waardevol zal zijn. De procedure zal worden gedemonstreerd door Veronica Lombardo, een postdoc uit mijn laboratorium, na het kruisen

cell-tracking-using-photoconvertible-proteins-during-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit protocol beschrijft beeldvorming van individuele neuronen of neurale cellen in levende zebravis embryo's. Deze methode wordt gebruikt om cellulaire gedrag en actine lokalisatie met behulp van fluorescentie confocal time-lapse microscopie bestuderen.

Live-Imaging van celbeweeglijkheid en actine cytoskelet van individuele neuronen en neurale cellen in de zebravis embryo&#39;s

Multifoton microscopie maakt de controle van een lage energetische fotonen met diepe penetratie optische en minder fototoxiciteit. We beschrijven het gebruik van deze technologie voor live cell etikettering in zebravis embryo's. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor foto-inductie van diverse licht-responsieve moleculen.

Twee-foton-Based Fotoactivatie in de Live zebravis embryo&#39;s

Een methode wordt beschreven om enkele cellen met een gekooide fluorescerend eiwit met behulp van twee-foton absorptie van een Ti photoactivate: Sapphire femtoseconde laser oscillator. Het lot kaart brengen van de gefotoactiveerd cel, wordt immunohistochemie gebruikt. Deze techniek kan worden toegepast op elk celtype.

Single Cell Fate Mapping in de zebravis

This video demonstrates the tracking of leukocyte recruitment using transgenic zebrafish larvae expressing photoconvertible green fluorescent protein. Pre-injecting red fluorescent dye-labeled bacteria into the otic vesicle and inducing photoconversion enables observation of leukocytes' migration, phagocytosis, and dispersal throughout the body, providing valuable insights into immune response dynamics.

Photoconversion-Based Leukocyte Tracking in Bacterial-Infected Transgenic Zebrafish

Eiwitniveaus in cellen en weefsels vaak zijn gereguleerd door het evenwicht van eiwitproductie en klaring. Met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP), kan de klaringskinetiek van eiwitten experimenteel worden gemeten in vivo.

Meten Eiwit Stabiliteit in Living zebravis embryo&#39;s met behulp van fluorescentie Decay Na Photoconversion (FDAP)

We hebben het fotoomzetbare PSmOrange-systeem geïntroduceerd als een krachtig, eenvoudig en kosteneffectief hulpmiddel voor in vivo celtracking in GFP transgene achtergrond. Dit protocol beschrijft de toepassing ervan in het zebravis modelsysteem.

Het bijhouden van cellen in GFP-transgene zebravis Met behulp van de photoconvertible PSmOrange System

Hier presenteren we een veelzijdige montagemethode die langetermijn tijds-gelaps beeldvorming mogelijk maakt van de ontwikkeling van het achterste lichaam van levende zebravisembryo's zonder de normale ontwikkeling te verstoren.

Een veelzijdige Montage Methode voor de lange termijn beeldvorming van ontwikkeling van de zebravis

Een combinatie van de geavanceerde optische technieken van laser scanning microscopie met lange golflengte fluorescentie multi foton excitatie werd uitgevoerd om vast te leggen van real-time, hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van neurale crest migratie in GS (sox10:EGFP) en GS (foxd3:GFP) zebrafish embryo's.

Multi foton Time Lapse Imaging te visualiseren van ontwikkeling in realtime: visualisatie van migreren neurale kamcellen in Zebrafish embryo's

Hier presenteren we een protocol om te laten zien hoe de photoconversion van de cel wordt bereikt door UV blootstelling aan specifieke gebieden uiten de fluorescente proteïne, Eos, in levende dieren.

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Dit protocol beschrijft een methode voor de photoconversion van Kaede fluorescent proteïne in endocardial cellen van de levende zebrafish embryo waarmee het volgen van endocardial cellen tijdens de atrioventriculaire kanaal en Atrioventriculaire hart ventiel ontwikkeling .

Volgende Endocardial weefsel mutaties via de cel Photoconversion in het Embryo van de zebravis

Dit protocol beschrijft een benadering voor in toto labeling en multidimensionale beeldvorming van zebravissen vroege oogontwikkeling. We beschrijven labeling, embedding en vierdimensionale (4D) beeldvorming met behulp van laserscannen confocale microscopie, en overwegingen voor het optimaliseren van de verwerving van datasets voor het ontleden van mechanismen van optische cupmorfogenese.

4-dimensionale beeldvorming van zebravis optic cup morfogenese

Leer celtracking met fotoconverteerbare eiwitten in levende zebravisembryo's via confocale microscopie. Deze methode maakt precieze monitoring van ontwikkelingsbiologische processen mogelijk.

Mobiele Tracking Met behulp van Photoconvertible eiwitten tijdens ontwikkeling van de zebravis

Meer video's verkennen