Name: Virale nanopartikels voor In vivo Tumor Imaging (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: Leer virale nanopartikels voor tumor imaging in muizen met xenotransplantaten. Deze methode toont biodistributie en tumor targeting met fluorescente labels voor kankeronderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door NIH / NIBIB subsidies R00 EB009105 (tot NFS) en P30 EB011317 (tot NFS), een NIH / NIBIB opleiding subsidie ​​T32 EB007509 (tot AMW), een Case Western Reserve University Interdisciplinair Alliance Investment Grant (tot NFS), en een zaak Comprehensive Cancer Center subsidie ​​P30 CA043703 (tot NFS). Wij danken het Steinmetz-Lab undergraduate student onderzoekers voor hun hands-on ondersteuning: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D&#39;Cruz, Stephen Hern, Lauren Randolph, Brian Dus, en Paul Chariou .

1. VNP (CPMV, BMV, PVX, en TMV) Propagatie <ol><li> Stel de kamerplant kamer controlemiddelen om de 15 uur van de dag (100% licht, 25 ° C, 65% luchtvochtigheid) en 9 uur van de nacht (0% licht, 22 ° C, 60% luchtvochtigheid). </li><li> Inoculeer planten volgens de tijdlijn in tabel 1. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV </td><td> PVX, TMV en BMV </td></tr><tr><td rowspan="2"> Dag 0: Plant 3 cowpea zaden / pot. </td><td> Dag 0: Plant ~ 30 N. benthamiana zaden / pot. Bemesten een keer per week met 1 eetlepel meststof / 5 L water. </td></tr><tr><td> Dag 14: Re-pot N. benthamiana op 1 plant / pot. </td></tr><tr><td> Dag 10: Infect verlaat primaire bladeren met CPMV (5 μg/50 ul / blad) door mechanische inoculatie met behulp van een dun laagje van carborundum. </td><td> Dag 28: Infect drie tot five bladeren met PVX, TMV, of BMV (5 μg/50 ul / blad) door mechanische inoculatie met behulp van een dun laagje van carborundum. </td></tr><tr><td> Dag 20: Harvest bladeren en op te slaan in -80 ° C. </td><td> Dag 42: Harvest bladeren en op te slaan in -80 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabel 1. Tijdlijn voor de teelt, infecteren, en oogsten bladeren. Opmerking: alleen CPMV voortplanting wordt aangetoond als een voorbeeld. 2. VNP (CPMV, BMV, PVX, en TMV) Zuivering Opmerking: Alle stappen worden uitgevoerd op ijs of bij 4 ° C. <ol><li> Meng 100 g bevroren bladeren in een standaard mixer met 2 volumes koude buffer (zie tabel 2). Filtreer door 2-3 lagen kaasdoek. </li><li> Voor PVX, breng de pH op 6,5 met behulp van 1 M HCl. Voeg 0,2% (w / v) ascorbinezuur en 0,2% (w / v) natrium sulfite. </li><li> Centrifugeer ruwe fabriek homogenaat bij 5.500 xg gedurende 20 minuten. Verzamel supernatant. </li><li> Voor BMV, laag 25 ml supernatant over 5 ml van 10% (w / v) sucroseoplossing. Centrifugeer bij 9000 xg gedurende 3 uur en resuspendeer in pellets 38,5% CsCl oplossing (w / v). Mix op door gedurende 5 uur, ga dan verder met stap 2.12. </li><li> Extraheren plantaardig materiaal door het toevoegen van 0,7 volumes van 1:1 (v / v) chloroform :1-butanol. Roer het mengsel gedurende 30-60 minuten. </li><li> Centrifugeer bij 5.500 xg oplossing gedurende 20 minuten. Verzamel de bovenste waterige fase. </li><li> Voeg NaCl tot 0,2 M en 8% (w / v) PEG (MW 8.000). Voor TMV ook met 1% (v / v) Triton X-100. Roer gedurende ten minste 1 uur, laat zitten gedurende ten minste 1 uur. </li><li> Centrifugeer bij 15.000 xg oplossing gedurende 15 minuten. Hersuspendeer pellet in 10 ml buffer. Voor PVX, voeg 0,1% β-mercaptoethanol en ureum tot 0,5 M. </li><li> Centrifugeer bij 8.000 g gedurende 30 min en verzamel supernatant. </li><li> Ultracentrifuge supernatant bij 160.000 xg gedurende 3 uur. Resuspendeer de pellet in 5 ml buffer overnight. </li><li> Bereid een 10-40% sucrosegradiënt met gelijke volumes van 10%, 20%, 30% en 40% sucrose in buffer (zwaarste eerst). Laat de gradiënt om &#39;s nachts evenwicht bij kamertemperatuur. </li><li> Ultracentrifuge geresuspendeerde pellet dan sucrose gradiënt op 100.000 xg gedurende 2 uur (24 uur voor BMV). </li><li> Verzamel lichtverstrooiing band en dialyseren tegen buffer. </li><li> Karakteriseren VNPs (hieronder) en bewaar bij 4 ° C. Voor langdurige opslag, bewaren bij -80 ° C. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> CPMV en TMV </td><td> 0,1 M kaliumfosfaatbuffer (pH 7,0) 38,5 mM KH 2 PO 4 61,5 mM K 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> PVX </td><td> 0,5 M boraatbuffer (pH 7,8) 0,5 M boorzuur Breng de pH met NaOH </td></tr><tr><td> BMV </td><td> SAMA buffer (pH 4,5) 250 mM natriumacetaat 10 mM MgCl2 2 mM β-mercaptoethanol (voeg vers) </td></tr></tbody></table> Tabel 2. Buffers en hun recepten voor elke VNP. Opmerking: alleen CPMV voortplanting wordt aangetoond als een voorbeeld. 3. VNP (CPMV, BMV, PVX, en TMV) Karakterisering <ol><li> Voer UV / zichtbaar spectroscopie om de concentratie van VNPs bepalen. <ol><li> Meet de absorptie van 2 pl monster met een NanoDrop spectrofotometer. </li><li> De concentratie van deeltjes en kleurstoffen met de Beer-Lambert law (A = εcl, waarbij A de absorptie, ε de extinctiecoëfficiënt, c de concentratie is en L de weglengte). De weglengte 0,1 cm voor de NanoDrop. De VNP-specifieke extinctie coëfficiënten zijn: CPMV: 8,1 cm -1 -1 mg ml (bij 260 nm) PVX: 2,97 cm -1 -1 mg ml (bij 260 nm) TMV: 3,0 cm -1 -1 mg ml (bij 260 nm) BMV: 5,15 cm -1 -1 mg ml (bij 260 nm) </li></ol></li><li> Analyseer deeltjes per grootte-uitsluiting snelle proteïne vloeistofchromatografie (FPLC). <ol><li> Met een Superose 6 grootte-exclusiekolom en de ÄKTA Explorer, belasting 50-100 ug VNPs in 200 pl 0,1 M kaliumfosfaatbuffer (pH 7,0). </li><li> Stel detectors tot 260 nm (nucleïnezuur), 280 nm (proteïne), en de golflengte van de bijgevoegde kleurstoffen. </li><li> Gelopen bij een stroomsnelheid van 0,5 ml / min gedurende 72 min. </li><li> De elutieprofiel en A260: A280 nm geeft aan of de VNP voorbereiding zuiver is en of deeltjes zijn intact en gemonteerd. De volgende A260: 280 verhoudingen dan een zuiver preparaat VNP: CPMV: 1,8 ± 0,1 PVX: 1,2 ± 0,1 TMV:1,1 ± 0,1 BMV: 1,7 ± ​​0,1 </li></ol></li><li> Voer denaturerende (prefab NuPAGE) Bis-Tris 4-12% polyacrylamide gradiënt gel elektroforese om de zuiverheid van de bereiding en conjugatie analyseren individuele manteleiwitten. <ol><li> 3 ml 4x LDS-monsterbuffer van 10 ug van de deeltjes in 9 pl kaliumfosfaatbuffer. Een extra 1 ul van 4x LDS-monsterbuffer en 3 pl β-mercaptoethanol aan BMV het grote aantal disulfidebindingen verminderen. </li><li> Incubeer in warmteblok gedurende 5 minuten bij 100 ° C. </li><li> Laad monsters op een SDS-gel. </li><li> Draaien monsters bij 200 V gedurende 1 uur in 1 x MOPS loopbuffer. </li><li> Documenteer de gel onder UV-licht om fluorescerende manteleiwitten visualiseren. </li><li> Voor niet-fluorescerend eiwit vlek met Coomassie blauw (0,25% (w / v) Coomassie Brilliant Blue R-250, 30% (v / v) methanol, 10% (v / v) azijnzuur) gedurende 1 uur. </li><li> Destain met 30% methanol, 10% azijnzuur gedurende de nacht. Change oplossing indien nodig. </li><li> Documenteer de gel onder wit licht. </li></ol></li><li> Analyseren integriteit van deeltjes door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). <ol><li> Verdun monsters 0,1-1 mg / ml in 20 ui DI water. </li><li> Breng 20 pl druppels van de monsters op Parafilm. </li><li> Bedek druppels met een TEM rooster en laat zitten voor 2 minuten. Wick de overtollige oplossing op de grid met filtreerpapier. </li><li> Was net door het toestel op een daling van DI-water dan wicking droog. </li><li> Vlek net door het op een 20 ul druppel 2% (w / v) uranylacetaat gedurende 2 minuten. Wick het overtollige vlek met filtreerpapier. </li><li> Was net nog eens in het water. </li><li> Let op raster onder een transmissie-elektronenmicroscoop. </li></ol></li></ol> 4. Chemische conjugatie van PEG en VNPs met fluoroforen, zuivering en karakterisering <ol><li> Voor berekeningen voor de reacties onder de molaire massa van het VNPs zijn: CPMV: 5,6x 10 6 g / mol PVX: 35 x 10 6 g / mol TMV: 41 x 10 6 g / mol BMV: 4,6 x 10 6 g / mol </li><li> Conjugaat kleurstoffen en PEG het oppervlak van lysines en CPMV PVX middels een stap N-hydroxysuccinimide koppelingsreactie: Voeg 2,500 molaire equivalenten (alle molaire overmaat zie molaire overmaat per VNP) van Alexa Fluor 647 succinimidyl ester en 4.500 equivalenten NHS- PEG (MW 5.000) opgelost in DMSO om CPMV in 0,1 M kaliumfosfaatbuffer. Bij het werken met PVX, voeg een 10.000 molaire overmaat van NHS-kleurstof en NHS-PEG. Stel de buffer en DMSO volumes zodanig dat de eindconcentratie van CPMV en PVX is 2 mg / ml DMSO en gehalte 10% van het totale reactievolume. Incubeer het reactiemengsel overnacht bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. CPMV en PVX hebben 300 en 1270 adresseerbare lysines, respectievelijk. (Verwezen wordt naar de volgende verwijzingen voor verdere lezingchemische modificatie van CPMV en PVX: 13-15). </li><li> Conjugaat kleurstoffen en PEG tyrosines van TMV door diazonium koppeling gevolgd door koper (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie. <ol><li> Bereid diazoniumzout (alkyn) door 400 ul 0,3 M p-tolueensulfonzuurmonohydraat, 25 ul van 3,0 M natriumnitriet en 75 pl van 0,68 M gedestilleerd 3-ethynylaniline opgelost in acetonitril bij 4 ° C gedurende 1 uur. </li><li> Voeg 3,3 ml boraatbuffer, pH 8,8, die 100 mM NaCl tot 1,25 ml van TMV (20 mg / ml voorraadoplossing). </li><li> Reageren de TMV met 450 ul van het diazoniumzout (alkyn) oplossing in een ijsbad gedurende 3 uur toevoegen een alkyn ligatie te hanteren door TMV diazonium koppeling. De oplossing zal veranderen in een licht bruine kleur. TMV heeft 2140 beschikbaar tyrosines voor conjugatie. </li><li> Zuiver het eindproduct met een sucrosekussen zoals beschreven in stap 4.4. </li><li> Bevestig azide-functionele Alexa Fluor 647 en PEG-azide (MW 5.000) using koper (I)-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC). Voeg 2 equivalenten kleurstof en PEG-azide per manteleiwit en incubeer met 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG en 2 mM natrium ascorbaat bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Stel het volume buffer zodanig dat de uiteindelijke concentratie van TMV reactie is 2 mg / ml. (Verwezen wordt naar de volgende verwijzingen voor verdere lezing chemische modificatie van TMV: 16,17). </li></ol></li><li> Conjugaat kleurstoffen lysines en PEG cysteïnen van BMV cysteine ​​mutant (cBMV): <ol><li> Voeg 2000 molequivalenten Oregon Green 488 succinimidylester opgelost in DMSO om cBMV in 0,1 M TNKM buffer (50 mM Tris base, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH 7,4). Stel de buffer en DMSO volumes zodanig dat de eindconcentratie van BMV is 1 mg / ml DMSO en gehalte 10% van het totale reactievolume. &#39;S nachts Incubeer het reactiemengsel bij 4 ° C beschermd tegen licht. </li><li> Purify deeltjes met behulp van Centrifugal filters zoals beschreven in stap 4.4. </li><li> Voeg 2,000 molaire overmaat van PEG-maleïmide (MW 2.000) met dezelfde reactieomstandigheden als voorheen en incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur bij 4 ° C. cBMV heeft 180 reactief lysines en cysteïnes. (Verwezen wordt naar de volgende verwijzingen voor verdere lezing chemische modificatie van BMV: 18). </li></ol></li><li> Zuivering: laat de oplossing door een 40% (w / v) sucrose kussen 160.000 xg gedurende 2,5 uur. Re-los de pellet op in buffer. Als alternatief dialyseren tegen een passende buffer met behulp van 10 kDa cut-off spin-filters. </li><li> Karakterisering: gePEGyleerde en fluorescent-gelabelde VNPs worden geanalyseerd met de hierboven beschreven werkwijzen: UV / zichtbare spectroscopie, SDS gel elektroforese, FPLC en TEM (niet getoond, maar zie figuren 6 en 7). </li></ol> 5. Tumor targeting en imaging met behulp van een muis xenograft model<ol><li> Cultuur HT-29 menselijke colonkankercellen in RPMI medium aangevuld met 5% FBS, 1% penicilline-streptomycine en 1% L-glutamine bij 37 ° C in 5% CO2 met 175 cm 2 celkweek kolven. </li><li> Was tweemaal cellen met steriel PBS en geoogst door incubatie met 5 ml trypsine-EDTA bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Inactiveren de trypsine met 5 ml RPMI medium. Verzamel cellen door centrifugeren bij 500 xg gedurende 5 minuten. bij 4 ° C en resuspendeer in vers RPMI op 5x10 6 cells/50 ul medium (het totaal aan cellen met trypan blauw en een hemocytometer). Te mengen met een gelijk volume Matrigel de injectie (om al oplossingen en steriele reagentia). </li><li> Procure zes weken oude NCR nu / nu muizen en hen op een luzerne vrij dieet voor 2 weken. [Opmerking:. Procedures waarbij dieren worden moet IACUC goedgekeurd] Laten tumorxenotransplantaten door subcutane injectie van 5x10 6 cellen/100 pl / tumor in de flanken (2 tumoren / muis) met behulp van een 18 1/2 meter sterielenaald. Regelmatig toezicht op de dieren. Meet de tumorgrootte met calipers en laat de tumoren groeien tot een gemiddelde volume van 20 mm3 (binnen 12 dagen). Wijs muizen op twee verschillende groepen willekeurig: PBS en VNP (n = 3 dieren / groep / tijdstip). Met een 1 ml insulinespuit 28 gauge, toedienen door intraveneuze injectie staartader 100 pi steriel PBS of 10 mg / kg VNP formulering. </li></ol> Opmerking: Weefselkweek experimenten en studies met levende dieren zullen niet worden aangetoond. Hands-on demonstratie zal worden beperkt tot weefsel verwerking en data-acquisitie. Voor een verwijzing op de HT-29 tumor xenograft model, wordt verwezen naar ref. 19 Drie technieken worden gebruikt om tumor homing van VNPs evalueren: <ol start="4"><li> Fluorescentie beeldvorming met Maestro Imaging System: Sacrifice muizen op verschillende tijdstippen (2, 24 en 72 uur) met behulp van CO2gas. Prepareer de dieren en accijnzen alle belangrijke organen (hersenen, hart, longen, milt, nieren en lever), samen met de tumoren op de flanken, plaatst u de weefsels op parafilm en analyseren met fluorescentie beeldvorming instrument met behulp van gele excitatie-en emissie filters (800 ms blootstelling) de aanwezigheid van fluorescentiesignalen in de weefsels (afgeleid van A647 label geconjugeerd met het VNPs) detecteren. Sla de afbeeldingen en analyseren fluorescerende intensiteit met behulp van ImageJ 1.44o software ( <a href="http://imagej.nih.gov/ij" target="_blank">http://imagej.nih.gov/ij</a> ). Vergelijk de patroon van opname van de VNPs in tumoren met andere belangrijke weefsels met de tijd. </li><li> Na beeldvorming, snijd elk weefsel in de helft en insluiten ene helft in OCT compound voor cryo-snijden en confocale analyse. Verzamel de andere helft in vooraf gewogen cryobuisjes en onmiddellijk te bevriezen ze met behulp van vloeibare N 2. Bij -80 ° C tot gereed voor verdere verwerking. </li><li> Fluorescentie kwantificering: Resnoer weefsels gewichten. Ontdooi bevroren weefsels bij kamertemperatuur en plaats ze in afzonderlijke 50 ml Falcon buizen met 1 ml PBS. Als u een draagbare weefsel homogenisator, Homogeniseer de weefsels gedurende 2-3 minuten in PBS en transporteert dan het homogenaat om microfugebuizen. Centrifugeer de homogenaten gedurende 10 min bij 13.000 xg niet-gehomogeniseerde weefsel. </li><li> Pipetteer 100 ul van de supernatant uit de weefsels van elke groep (PBS formuleringen en VNP / tijdstippen) in een 384 putjes zwarte UV plaat. Evalueer fluorescentie-intensiteit (Ex / Em golflengten 600/665) met behulp van een bord lezer. Normaliseren van de verkregen fluorescentie waarden door het weefsel gewichten. </li><li> Immunohistochemie: Bereid cryo-microtoom secties (10 micrometer) en bewaar bij -20 ° C. Vlek weefselsecties voor celkernen (DAPI) en endotheliale celmarker (FITC-gelabeld anti-muis CD31 antilichaam). Voer confocale microscopie analyse aan de vasculaire en intra-tumorale lokalisatie van fluorescentie-gemerkt VNP kaarts. </li></ol> Opmerking: Deze procedure wordt niet aangetoond representatieve gegevens worden weergegeven in figuur 8. Voor een overzicht van immunohistochemie en kleuring beschreven werkwijzen wordt verwezen naar ref 19.

<ol><li>Description of Plant Viruses [Internet]. , Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://dpvweb.net/ ">http://dpvweb.net/ </a> (2012).</li>
<li>Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VIPERdb2%3A+an+enhanced+and+web+API+enabled+relational+database+for+structural+virology%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology.</a> Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).</li>
<li>Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+of+engineering+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">The art of engineering viral nanoparticles.</a> Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-based+engineering+of+an+icosahedral+virus+for+nanomedicine+and+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top+Microbiol.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology.</a> Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).</li>
<li>Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+Nano-Constructs+Composed+of+Genome-Depleted+Brome+Mosaic+Virus+Doped+with+a+Near+Infrared+Chromophore+for+Potential+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications.</a> ACS Nano. , (2011).</li>
<li>Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+embryonic+and+tumor+neovasculature+using+viral+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles.</a> Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).</li>
<li>Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+virions%3A+dynamic+tracking+of+the+pathway+of+adenoviral+gene+transfer+vectors+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells.</a> Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).</li>
<li>Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+nanoparticles+as+tools+for+intravital+vascular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging.</a> Nat. Med. 12, 354-360 (2006).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+human+prostate+cancer+using+viral+nanoparticles+targeted+to+gastrin-releasing+Peptide+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors.</a> Small. 7, 1664-1672 (2011).</li>
<li>Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+probe+using+hybrid+virus-dye+nanoparticles+for+near-infrared+fluorescence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Communications%22%5BJournal%5D)">A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography.</a> Optics Communications. 255, 366-374 (2005).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cowpea+mosaic+virus+nanoparticles+target+surface+vimentin+on+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells.</a> Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).</li>
<li>Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+vascular+permeability+and+the+EPR+effect+in+macromolecular+therapeutics%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review.</a> Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+addresses+on+an+addressable+virus+nanoblock%3A+uniquely+reactive+Lys+residues+on+cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus.</a> Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).</li>
<li>Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potato+virus+X+as+a+novel+platform+for+potential+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications.</a> Nano Lett. 10, 305-312 (2010).</li>
<li>Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Icosahedral+virus+particles+as+addressable+nanoscale+building+blocks%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).</li>
<li>Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modification+of+tobacco+mosaic+virus+with+%22click%22+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Chembiochem%22%5BJournal%5D)">Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry.</a> Chembiochem. 9, 519-523 (2008).</li>
<li>Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-surface+modification+of+the+tobacco+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus.</a> J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).</li>
<li>Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+Brome+mosaic+virus+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications.</a> RSC Advances. , (2012).</li>
<li>Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrazone+ligation+strategy+to+assemble+multifunctional+viral+nanoparticles+for+cell+imaging+and+tumor+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting.</a> Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).</li>
<li>Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+tumor+homing+and+tissue+penetration+of+the+filamentous+plant+viral+nanoparticle+Potato+virus+X%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X.</a> Molecular Pharmaceutics. , (2012).</li>
<li>Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+conjugation+of+heterologous+proteins+on+the+surface+of+Cowpea+mosaic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjug.+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus.</a> Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Dit protocol verschaft een benadering voor de chemische modificatie van VNPs en hun toepassingen in vivo tumor imaging. Het dier fluorescentie beeldvorming, fluorescentie kwantificering en immunohistochemie technieken hier gepresenteerd zijn nuttig voor het bestuderen van biologische verdeling en evalueren van tumor homing. Deze technieken leveren waardevolle informatie over de toegang van de nanodeeltjes aan de tumor via de EPR effect. Door de resultaten van de verschillende analysemethoden, krijgen we een kra...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Productie van VNP's&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Binnenplantenkamer</td><td>Percival Scientific</td><td>E-41L2</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. unguiculata&lt;/em&gt; zaden (California black-eye no. 5)</td><td>Burpee</td><td>51771A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N. benthamiana&lt;/em&gt; zaden</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;N. benthamiana-zaden waren een geschenk van het Salk Institute. Zaden worden geproduceerd via plantpropagatie.&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Carborundum</td><td>Fisher</td><td>C192-500</td><td></td></tr><tr><td>Pro-mix BX potgrond</td><td>Premier Horticulture</td><td>713400</td><td></td></tr><tr><td>Jack's Professional 20-10-20 Peat-Lite meststof</td><td>JR Peters</td><td>77860</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Apparatuur&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>50,2 Ti-rotor</td><td>Beckman</td><td>337901</td><td></td></tr><tr><td>SW 32 Ti-rotor</td><td>Beckman</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>SLA-3000 rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>07149</td><td></td></tr><tr><td>SS-34 rotor</td><td>Thermo Scientific</td><td>28020</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC-6 Plus centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>Polypropyleenfles</td><td>Beckman</td><td>355607</td><td>Voor rotor SLA-3000</td></tr><tr><td>Polycarbonaatfles</td><td>Beckman</td><td>357002</td><td>Voor SS-34 rotor</td></tr><tr><td>Ultra-Clear buis</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>Voor sucrosegradiënt en SW 32 Ti-rotor</td></tr><tr><td>Polycarbonaatfles</td><td>Beckman</td><td>355618</td><td>Voor pelletering en 50.2 Ti-rotor</td></tr><tr><td>NanoDrop-spectrofotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop2000c</td><td></td></tr><tr><td>PowerEase 500 pre-cast gelsysteem</td><td>Invitrogen</td><td>EI8675EU</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL (24 ml) grootte-uitsluitingskolom</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#196;KTA Explorer 100 chromatograaf</td><td>GE Healthcare</td><td>28-4062-66</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R</td><td>Beckman</td><td>392302</td><td>Tafelcentrifuge</td></tr><tr><td>Cryostaat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>Maestro 2</td><td>Caliper Life Sciences</td><td></td><td>&lt;em&gt;In vivo&lt;/em&gt; beeldvormingssysteem</td></tr><tr><td>Weefselscheurder</td><td>Biospec Products</td><td>985370-395</td><td></td></tr><tr><td>Microplaatlezer</td><td>Tecan</td><td>Infinite-200</td><td></td></tr><tr><td>Transmissie-elektronenmicroscoop</td><td>ZEISS</td><td>Libra 200FE</td><td></td></tr><tr><td>FluoView laser-scanning confocale microscoop</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Chemicaliën en reagentia&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>3-ethynylaniline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>498289-5G</td><td></td></tr><tr><td>zwarte 384-wells plaat</td><td>BD Biosciences</td><td>353285</td><td></td></tr><tr><td>4-12% Bis-Tris NuPAGE SDS-gel</td><td>Invitrogen</td><td>NP0321BOX</td><td></td></tr><tr><td>4X LDS-monsterbuffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>Azijnzuur</td><td>Fisher</td><td>A385-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Sigma Aldrich</td><td>271004-1L</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-azide</td><td>Invitrogen</td><td>A10277</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 carbonzuur, succinimidylester</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0,5 ml centrifugale filters</td><td>Millipore</td><td>UFC501096</td><td>10 kDa cut-off</td></tr><tr><td>Aminoguanidinehydrochloride</td><td>Acros Organics</td><td>36891-0250</td><td></td></tr><tr><td>Boorzuur</td><td>Fisher</td><td>A74-500</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Fisher</td><td>BP101-25</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Acros Organics</td><td>42285-1000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>MP Biomedicals</td><td>157574</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide</td><td>Fisher</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Fisher</td><td>09-801K</td><td>P5-kwaliteit</td></tr><tr><td>FITC anti-muis CD31</td><td>BioLegend</td><td>102406</td><td></td></tr><tr><td>Geitenserum</td><td>Invitrogen</td><td>16210-064</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>natriumzout van L-ascorbinezuur</td><td>Acros Organics</td><td>35268-0050</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>A412P-4</td><td></td></tr><tr><td>MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>Objectglazen</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopdekglaasje</td><td>VWR</td><td>48366-277</td><td></td></tr><tr><td>MOPS-buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>mPEG-mal</td><td>Nanocapsules</td><td>PG1-ML-2k</td><td>MW 2000</td></tr><tr><td>mPEG-N3</td><td>Nanocrystals</td><td>PG1-AZ-5k</td><td>MW 5000</td></tr><tr><td>mPEG-NHS</td><td>Nanocristallen</td><td>PG1-SC-5k</td><td>Mw 5000</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 succinimidylester *6-isomeer*</td><td>Invitrogen</td><td>O-6149</td><td></td></tr><tr><td>p-tolueensulfonzuurmonohydraat</td><td>Acros Organics</td><td>13902-0050</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat dibasisch</td><td>Fisher</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumfosfaat monobasisch</td><td>Fisher</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Natriumacetaat</td><td>Fisher</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>Natriumnitriet</td><td>Acros Organics</td><td>42435-0050</td><td></td></tr><tr><td>Natriumsulfiet</td><td>Amresco</td><td>0628-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher</td><td>S6-500</td><td></td></tr><tr><td>TEM-grid</td><td>Ted Pella</td><td>FCF-400Cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Chemicals</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;ethanol</td><td>Fisher</td><td>O3446I-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Weefselkweek&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Foetaal runderserum</td><td>Invitrogen</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>0267110</td><td></td></tr><tr><td>HT-29-cellen</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-080</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Cellgro</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Invitrogen</td><td>31800-089</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekflessen</td><td>Corning</td><td>431080</td><td>175 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Trypanblauw</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, 0,05% (1X) met EDTA 4Na, vloeibaar</td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;&lt;strong&gt;Dierstudies&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>18% proteïnedieet voor knaagdieren</td><td>Harlan Teklad</td><td>Teklad Global 2018S</td><td>Alfalfevrij dieet</td></tr><tr><td>Insulinespuit</td><td>BD Biosciences</td><td>329410</td><td>28 gauge</td></tr><tr><td>Isofluraan</td><td>Baxter</td><td>AHN3637</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Matrix basaalmembraan</td><td>BD Biosciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>NCR nu/nu-muizen</td><td></td><td></td><td>CWRU School&lt;br/&gt; faciliteit voor athymische dieren en xenografts van de faculteit Geneeskunde</td></tr><tr><td>Steriele spuit</td><td>BD Biosciences</td><td>305196</td><td>18 1/2 gauge</td></tr><tr><td>Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td><td>Andwin Scientific</td><td>4583</td><td></td></tr></tbody></table>

virale nanopartikels voor<em&gt; in vivo</em&gt; tumor imaging

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Het gebruik van nanomaterialen heeft de potentie om materialen wetenschap en geneeskunde een revolutie. Momenteel worden verschillende nanodeeltjes onderzocht voor toepassing in beeldvorming en therapie. Virale nanodeeltjes (VNPs) afgeleid van planten kan worden beschouwd als zelf-geassembleerde bionanomaterials met verschillende grootten en vormen. Plantenvirussen onderzochte in de Steinmetz lab zijn icosahedrale deeltjes gevormd door Cowpea mosaic virus (CPMV) en Brome mosaic virus (BMV), die beide 30 nm in diameter. We ontwikkelen ook staafvormig en filamenteuze structuren afgeleid van de volgende plantenvirussen: Tobacco mosaic virus (TMV), die stijve staven vormen met afmetingen van 300 nm met 18 nm en aardappelvirus X (PVX) die draadvormige deeltjes vormen 515 nm lang en 13 nm breed (wordt verwezen naar refs. 1 en 2 voor meer informatie over VNPs). <p class="jove_content"&gt; Vanuit het oogpunt van een materiaal wetenschapper&#39;s standpunt, VNPs zijn aantrekkelijk bouwstenen om verschillende redenen: de deeltjes zijn monodisperse, kan worden geproduceerd met gemak op grote schaal in planta, zijn uitzonderlijk stabiel en biocompatibel zijn. Ook VNPs zijn &quot;geprogrammeerd&quot; eenheden, die specifiek kunnen worden gemanipuleerd met behulp van genetische modificatie of chemische methoden bioconjugatie 3. De structuur van VNPs is bekend dat atomaire resolutie, en wijzigingen kunnen worden uitgevoerd met ruimtelijke precisie op het atomaire niveau 4, een niveau van controle die niet kan worden bereikt met behulp van synthetische nanomaterialen met de huidige state-of-the-art technologieën. In dit artikel beschrijven we de verspreiding van CPMV, PVX, TMV, en BMV in Vigna ungiuculata en Nicotiana benthamiana planten. Extractie en zuivering protocollen voor elke VNP gegeven. Methoden voor het karakteriseren van gezuiverd en chemisch gelabelde VNPs beschreven. In dit onderzoek richten we ons op chemical etikettering van VNPs met fluoroforen (bijv. Alexa Fluor 647) en polyethyleenglycol (PEG). De kleurstoffen vergemakkelijken volg-en detectiesysteem van de VNPs 5-10, en PEG vermindert immunogeniciteit van het eiwitachtige nanodeeltjes terwijl het verbeteren van hun farmacokinetiek 8,11. We laten zien tumor homing van gePEGyleerde VNPs gebruik van een muis xenograft tumor model. Een combinatie van fluorescentie beeldvorming van weefsels ex vivo met Maestro Imaging System, fluorescentie kwantificering in gehomogeniseerde weefsels, en confocale microscopie wordt gebruikt om biodistributie te bestuderen. VNPs worden gewist via het reticulo-endotheliale systeem (RES); tumor homing wordt passief bereikt via de verbeterde doorlaatbaarheid en retentie (EPR) effect 12. De VNP nanotechnologie is een krachtige plug-and-play-technologie om beeld en te behandelen plaatsen van de ziekte in vivo. Wij blijven VNPs van drugs ladingen en klinisch relevante imaging eenheden, alsmede weefsel-specifieke liganden dragen naargericht moleculaire receptoren tot overexpressie gebracht in kanker en cardiovasculaire aandoeningen.

<img alt="Vergelijkende analyse van plantengroei; experimentele opzet, studie van bladkleurvariatie, chlorosemethode." src="/files/ftp_upload/4352/4352fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
 Figuur 1. Planten geïnfecteerd met plantenvirussen. Vigna unguiculata-planten geïnfecteerd met CPMV (A). Nicotiana benthamiana-planten geïnfecteerd met PVX (B), TMV (C) en BMV (D). De foto's zijn genomen ongeveer 10 dagen na infecti...

Plant virale nanodeeltjes (VNPs) zijn veelbelovend platform voor toepassingen in de medische biologie. Hier beschrijven we de procedures voor plantaardige VNP vermeerdering, zuivering, karakterisering, en bioconjugatie. Ten slotte tonen we de toepassing van VNPs voor tumor homing en beeldvorming met behulp van een muis xenograft model en fluorescentie beeldvorming.

Virale nanopartikels voor<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

Het gebruik van nanomaterialen heeft de potentie om de materiaalkunde en de geneeskunde te revolutioneren. Momenteel worden een aantal verschillende nanodeeltjes ...

Het algemene doel van deze procedure is om de in vivo tumortargeting en biodistributie van fluorescent gelabelde virale nanodeeltjes te bestuderen. Propageer en zuiver in muis-tumormodellen eerst het virus, en vervolgens de kleurstoffen en peg aan de deeltjes te conjugeren. Nadat de gefunctionaliseerde deeltjes zijn gekarakteriseerd, kunnen deze worden geïnjecteerd in muizen met tumorxenografts.Resultaten van maestro-imaging, fluorescentie-intensiteit, metingen van weefselhomogenisaten en immunofluorescentie tonen de lokalisatie van de virale nanodeeltjes in de tumor en diverse organen door het hele lichaam. Nanodeeltjes of VMP's zijn veelbelovende platforms voor toepassingen in de biomedische wetenschappen. Hier beschrijven we de procedures voor PLA VMP-propagatie, zuivering, karakterisering en conjugatie aan de darm.Ten slotte tonen we de toepassing van V mps voor tumorhoming en beeldvorming met behulp van een malino-transplantaatmodel en fluorescentiebeeldvorming. Momenteel worden verschillende soorten nanodeeltjes onderzocht voor toepassingen in beeldvorming en therapie. De belangrijkste voordelen van het gebruik van bio-nanodeeltjes boven synthetische materialen, zoals metalen of polymere nanomaterialen, zijn dat BMP's uit planten monodispers zijn en hun structuren bekend zijn op atomaire resolutie.Plantenvirussen kunnen op grote schaal worden geproduceerd via moleculaire farming en zijn vatbaar voor zowel genetische als chemische modificatie. In deze demonstratie tonen wij de chemische modificatie van virale nanodeeltjes met fluorforen en PEG. De fluorforen zullen worden gebruikt voor beeldverbetering en de PEG zal worden gebruikt om de farmacokinetiek te verbeteren.Chemische modificaties kunnen worden uitgebreid om virale nanodeeltjes te laden met therapieën en contrastmiddelen voor klinische beeldvorming, zoals MRI. Hier demonstreerden we een biodistributiestudie van geladen virale nanodeeltjes, vergelijkbaar met andere nanodeeltjes. De tumoraccumulatie van V NPS is gebaseerd op verhoogde permeabiliteit en retentie, wat wordt beschreven als passieve tumorlokalisatie.Onlangs hebben we ontdekt dat de biodistributieprofielen van verschillende plantenvirussen verschillen. Voor deze demonstratie gebruiken we het copy mosa virus, dat wordt beschouwd als de gouden standaard voor virale nanotechnologie. Wij hebben een specifieke interesse in het ontwikkelen, engineeren en bestuderen van nanomaterialen uit plantenvirussen.Mijn laboratorium richt zich op het verkrijgen van een fundamenteel begrip van hoe Ed cow p mosaic virus bro mosaic virus, rock shaped bacca mosaic virus en filamentous potato virus X interageren met het zoogdiersysteem. Specifiek willen we leren hoe de vorm en de flexibiliteit de EVO-eigenschappen beïnvloeden en hoe deze het beste kunnen worden aangepast voor toepassingen zoals weefselspecifieke beeldvorming en geneesmiddelentoediening. Dit manuscript beschrijft in detail de preparatie van kalp mosaic virus, potato virus X, brown mosaic virus en tobacco mosaic virus.We beschrijven de functionalisering en toepassing van Vic, Gil en Nicotiana in een preklinisch muismodel. In deze demonstratie gebruiken we het cow P-mozaïekvirus in een binnenincubatiekamer. Plant drie cow P-zaden per pot.Infect op dag 10 elk blad met 0,1 µg per µL CPMV door middel van mechanische inoculatie, waarbij een lichte bestuiving met carum wordt gevolgd door het licht inwrijven van de bladeren. Oogst de bladeren na 10 dagen en bewaar deze bij -80 °C. Homogeniseer 100 g bevroren bladeren in een standaard blender in twee volumes koude 0,1 M kaliumfosfaatbuffer pH 7, filtreer het homogenaat door drie lagen kaasdoek en centrifugeer 20 minuten bij 5.500 ×g.Verzamel het supernatant en voer vervolgens een organische extractie van het plantmateriaal uit met 0,7 volumes van een één-op-één mengsel van chloroform en butanol, waarbij het mengsel gedurende ten minste 30 minuten wordt geroerd. Centrifugeer de oplossing vervolgens bij 5.500 G gedurende 20 minuten. Verzamel de bovenste waterige fase en ultracentrifugeer deze.Centrifugeer bij 160.000 G gedurende drie uur. Resuspendeer vervolgens het pellet in vijf milliliter fosfaatbuffer en incubeer het monster gedurende de nacht bij vier graden Celsius. Bereid daarnaast een sucrosegradiënt van 10 tot 40% voor door gelijke volumes 10, 20, 30 en 40% sucrose in buffer te gebruiken.Equilibreer de gradiënt overnacht bij kamertemperatuur door de zwaarste fractie eerst te plaatsen. Laag het RESUSPENDERDE pellet over de sucrosegradiënt en centrifugeer 2 uur lang bij 100.000 G. Verzamel de lichtverstrooiingsband en dialyseer tegen buffer om de kleurstoffen en peg te conjugeren aan oppervlakte-lysineresiduen bij 2.500 molaire equivalenten Fluor en 4.500 equivalenten NHS PEG aan CPMV.Meet na het zuiveren van de reactie het absorptiespectrum van twee microliters monster met de nano drop, waarbij de waarden bij 260, 280 en 651 nanometers worden genoteerd. Analyseer vervolgens de deeltjes op basis van grootte via size-exclusion fast protein liquid chromatography (SE-FPLC) met behulp van een Superdex 200 size-exclusion kolom en de ACTA Explorer; breng 50 tot 100 microgram van het VNP-monster in 200 microliters 0,1 molair kaliumfosfaatbuffer aan.Stel bij pH 7.0 de detectoren in op 260 nanometer voor nucleïnezuren en 280 nanometer voor eiwitten. Stel daarnaast de absorptiegolflengte in van eventuele toegevoegde kleurstoffen. Voer de scheiding uit met een stroomsnelheid van 0,5 milliliter per minuut gedurende 72 minuten.Het Ellucian-profiel in de verhouding 2 62 80 geeft aan of de reactie zuiver is en of de V NPS volledig geassembleerd en intact zijn. Bereid vervolgens een denaturerende SDS-gelelektroforese voor om de conjugatie aan individuele kapproteïnen te analyseren. Voeg voor elk monster drie µL 4X-SDS-monsterbuffer toe aan 10 µg van de partikels in negen µL kaliumfosfaatbuffer en denatureer deze in een heating block gedurende vijf minuten bij 100 °C.Laad de monsters op een SDS-gel en laat deze één uur lang lopen bij 200 volt. Documenteer de gel onder wit licht in een 1X mops-loopbuffer. Na kleuring zijn deze virale nanodeeltjes nu klaar voor tumortargeting en beeldvorming met behulp van een xenograft-muismodel.Doorgaans gebruiken we een injectie in de staartader om deze VN PS intraveneus toe te dienen. Om de tumorhoming van VN PS te evalueren, worden de weefsels geanalyseerd met het Maestro-fluorescentiebeeldsysteem. Gebruik gele excitatie- en emissiefilters met een belichtingstijd van 800 milliseconden om de aanwezigheid van fluorescentiesignalen afgeleid van het aan de VN PS geconjugeerde A 6 47-label te detecteren voor fluorescentiekwantificering.Homogeniseer de weefsels gedurende twee tot drie minuten in PBS. Draag het homogenaat vervolgens over naar centrifugebuisjes. Breng voor elke PBS- en VNP-formulering per tijdspunt 100 µL van het monster over naar een zwarte 384-well UV-plaat. Meet de fluorescentie-intensiteit met een excitatie- en emissiegolflengte van 600 en 665 nm.Succesvolle VNP-propagatie kan worden vastgesteld aan de hand van het verschijnen van mozaïeksymptomen op de bladeren ongeveer een week na mechanische inoculatie. UV-vis spectroscopie kan worden gebruikt om de zuiverheid van de partikels te beoordelen. De absorbentie bij 260 nanometer is proportioneel aan de concentratie aan nucleïnezuren en de absorbentie bij 280 nanometer is proportioneel aan de eiwitconcentratie.Deze size-exclusion elutieprofielen van VN PS werden verkregen met gebruik van een Superos six-kolom en een ACTA purifier. Net als bij de UV-vis spectra kan de A260/A280-verhouding worden gebruikt om de zuiverheid van VNP-preparaten te beoordelen. Daarnaast kan het elutieprofiel worden gebruikt om de zuiverheid van de partikels te bepalen.SDS-gelelektroforese scheidt de gedenatureerde subunits van het kapselprotein. De CPMV-partikels zijn gevormd door twee proteïnen: een groot proteïne van 42 kilodalton en een klein proteïne van 24 kilodalton.Opmerking. Het kleinere proteïne heeft twee elektroforetische vormen in deze TEM-beelden van viruspartikels.De TEM-roosters werden negatief gekleurd met 2%uronylacetaat, waardoor de partikels licht verschijnen op een donkere achtergrond. De CPMV-partikels hebben een grootte van 30 nanometers. De V NPS kunnen vervolgens worden gefunctionaliseerd via bioconjugatiechemie.CPMV heeft bijvoorbeeld lysines die kunnen worden gebruikt om te reageren met gefunctionaliseerde NHS-esters om de functionalisering van de V NPS te bevestigen; de karakterisering wordt uitgevoerd met dezelfde methoden als eerder voor de gezuiverde deeltjes. Dit zijn representatieve gegevens van fluorescerend gelabelde en gepegyleerde VN ps. De gefunctionaliseerde deeltjes kunnen vervolgens worden ingezet voor downstream-applicaties, zoals het onderzoek naar biodistributie en tumorhoming met gepegyleerde en thigh gelabelde VN ps.Hier wordt de biodistributie van CPMV geëvalueerd in naakte muizen met geïmplanteerde humane HT 29 xenografts; de biodistributie en tumorhoming worden geanalyseerd middels maestro-imaging van de weefsels. Ex vivo werd geen fluorescentie waargenomen voor de PBS-controle. Voor CPMV geconjugeerd met 6 47 en peg was er wel prominente fluorescentie in de lever en enige fluorescentie in de milt als gevolg van klaring door het reticulo-endotheliale systeem.Prominente fluorescentie in de tumor wijst op tumorhoming via het effect van verhoogde permeabiliteit en retentie. Deze kwantitatieve gegevens zijn verkregen via fluorescentiemetingen van gehomogeniseerde weefsels, genormaliseerd naar het weefselgewicht. Zoals verwacht geven de gegevens de klaring van CPMV door de lever en milt aan.CPMV wordt ook in de tumor gedetecteerd. Verdere intratumorale lokalisatie met behulp van immunokleuring van cryosecties van weefsels toont de intratumorale lokalisatie van CPMV aan. CPMV is in rood weergegeven.Blauw stelt de kernen voor en groen is een bloedvat dat is gekleurd met anti-CD 31. Het CPMV werd voornamelijk aangetroffen nabij de vasculatuur van de tumor. De beschreven technieken zijn toepasbaar op een verscheidenheid aan bio-nanopartikelsystemen.Het Stein-lab bestudeert VMP's, zoals het koeienmozaïekvirus, het broccoli-mozaïekvirus, het aardappelvirus X en het tabaksmozaïekvirus. De methodologieën kunnen echter worden toegepast op elk ander viraal nanodeeltje of proteïnenanostructuren, zoals hitte-shockeiwitten. Na deze procedure kunnen aanvullende methoden, zoals R-T-P-C-R of Western Blot, als onafhankelijke methoden worden uitgevoerd.Cryosectionering en immunohistochemie kunnen worden gebruikt om aanvullende informatie te verkrijgen over de intratumorale locatie van de v ps en potentiële colocalisatie met tumor-geassocieerde macrofagen of andere organellen. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe virale nanodeeltjes kunnen worden gepropageerd, gezuiverd, gefunctionaliseerd en gekarakteriseerd, en hoe de in vivo biodistributie kan worden bestudeerd met behulp van een tumor-muismodel.

viral-nanoparticles-for-in-vivo-tumor-imaging

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bio-engineering

Wij presenteren een nieuwe benadering voor nanodeeltjes lokalisatie kwantificeren in het vaatstelsel van de menselijke xenografted tumoren met behulp van dynamische, real-time intravitale beeldvorming in een aviaire embryo model.

Evaluatie van de Nanodeeltje Opname in Tumoren in real time via intravitale Imaging

Source: Kim, B. D., et al. Nanoparticle Delivery of an Oligonucleotide Payload in a Glioblastoma Multiforme Animal Model. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates the intravenous injection of therapeutic nanoparticles in a glioblastoma-bearing mouse. The method enables targeted delivery across the blood-brain barrier and supports non-invasive imaging for evaluating nanoparticle biodistribution and therapeutic efficacy in brain tumors.

Intravenous Administration of Therapeutic Nanoparticles in a Murine Glioblastoma Model

The video demonstrates a fluorescence imaging method for in vivo antibody localization in a mouse tumor xenograft model. It involves the injection of tumor cells in a mouse to generate solid xenografts beneath the skin. Subsequent injection of fluorescent antibodies confirms specific localization through enhanced fluorescence signals within the tumor xenograft.

In Vivo Fluorescence Imaging to Localize Antibodies in a Mouse Tumor Xenograft Model

Dit artikel beschrijft de procedures voor optische beeldvorming analyse van de tumor-gerichte nanodeeltjes, HerDox. In het bijzonder wordt gebruik van de gedetailleerde multimode beeldvormingsinrichting voor het detecteren en beoordelen van tumor targeting tumorpenetratie beschreven.

Analyse van Gerichte Viral Eiwit Nanodeeltjes Geleverd aan HER2 + Tumoren

We beschrijven een multi-angle rotatie optische beeldvorming (Maroi) systeem voor in vivo kwantificatie van een fluorescerende marker door saposine C (SAPC)-dioleoylfosfatidylserine (DOPS) nanovesicles geleverd. Gebruikmakend muismodellen van kanker en artritis, laten we zien hoe de Maroi signaalverloop analyse kan worden gebruikt voor een nauwkeurige kartering en biologische karakterisering van ziekteprocessen.

In vivo optische beeldvorming van hersentumoren en artritis met fluorescerende SAPC-DOPS nanovesicles

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om ex vivo validatie uit te voeren van in vivo nabije-infrarood fluorescentie xenograft beeldvormingsexperimenten bij muizen met behulp van met fluorofoor gelabelde nanolichamen en conventionele antilichamen.

Validatie van Nanobody en antilichamen gebaseerde<em&gt; In Vivo</em&gt; Tumor Xenograft NIRF-imaging Experimenten op muizen, waarbij<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Flowcytometrie en Microscopie

Het slechte begrip van de in vivo prestaties van nanomedicijnen belemmert hun klinische translatie. Procedures om het in vivo gedrag van kanker nanomedicijnen op systemisch, weefsel-, enkelcellig en subcellulair niveau te evalueren bij tumordragende immuuncompetente muizen worden hier beschreven. Deze aanpak kan onderzoekers helpen om veelbelovende kanker nanomedicijnen te identificeren voor klinische translatie.

A Comprehensive Procedure voor het evalueren<em&gt; In Vivo</em&gt; Prestaties of Cancer Nanomedicines

Beschrijven we een protocol voor preklinische in vivo volgen van kanker uitzaaiingen. Het is gebaseerd op een verslaggever van de radionuclide-fluorescentie combineren de natrium jodide symporter, ontdekt door niet-invasieve [18F] Zilvertetrafluorboraat-PET, en een fluorescente proteïne voor gestroomlijnde ex vivo bevestiging. De methode is toepasbaar voor preklinische in vivo cel bijhouden dan tumor biologie.

Radionuclide-fluorescentie Reporter Gene Imaging als u wilt bijhouden van de Tumor progressie in knaagdier Tumor modellen

Hier presenteren we gedetailleerde methoden voor de bereiding en evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo.

Voorbereiding, kenmerken, toxiciteit en werkzaamheid Evaluatie van het nasale zelfgeassembleerde nano-emulsietumorvaccin in vitro en in vivo

We presenteren een nieuwe benadering voor twee-fotonmicroscopie van de tumorafgifte van fluorescerend gelabelde ijzeroxide-nanodeeltjes aan glioblastoom in een muismodel.

Intravitale microscopie met twee fotonen van glioblastoom in een muizenmodel

De bloed-hersenbarrière is een belangrijke hindernis bij het toedienen van therapieën voor glioblastoom, een ziekte waarvoor geen genezing bestaat. Hier rapporteren we een in vivo beeldgeleid therapeutisch nanoplatform voor ijzeroxide dat deze fysiologische barrière kan omzeilen op grond van de grootte en zich kan ophopen in de tumor.

Levering van nanodeeltjes van een oligonucleotidelading in een glioblastoom multiforme diermodel

Leer virale nanopartikels voor tumor imaging in muizen met xenotransplantaten. Deze methode toont biodistributie en tumor targeting met fluorescente labels voor kankeronderzoek.

Virale nanopartikels voor

Meer video's verkennen