Name: Kwantitatieve meting van de immuunrespons en Sleep in Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Leer de kwantitatieve meting van immuunrespons en slaap bij Drosophila door locomotorische activiteit, bacteriële klaring en NFκB-luciferase-activiteit te analyseren. Deze methode onthult moleculaire verbanden tussen immuunfunctie en gedrag.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation onder toekenning # IOS-1025627 en door de National Institutes of Health onder subsidie ​​# 1R21NS078582-01 naar JAW

Dit protocol gebruikt twee opstellingen (figuur 1) te verwerven vier verschillende uitlezingen vanuit vliegen aan een bacteriële infectie. Deze uitgangen zijn 1) slaap / waak gedrag; 2) uitkomst van overleving; 3) bacteriële belasting in de vlieg, en 4) real-time meting van NFKB reporter activiteit in vivo. In combinatie met de genetische technieken die beschikbaar zijn in Drosophila, deze metingen geven inzicht in de mechanistische moleculair verband tussen het immuunsysteem en gedrag. 1. Meet bewegingsactiviteit en Slaap in Flies <ol><li> De setup wordt gebruikt om bewegingsactiviteit te meten en in vliegen slapen, waaronder de Drosophila Activity Monitoring-systeem (DAM2, Trikinetics), incubators, donkere kamer, en de voorbereiding van proefdieren en activiteit buizen, is eerder 6 beschreven. Dezelfde aanpak wordt hier gebruikt, met enkele kleine wijzigingen. <ol class="lalpha"><li&gt; De verlichting van de incubator wordt geregeld door de incubator zelf. Daarom is het belangrijk om de tijdinstelling synchroniseren van computer en incubators. </li><li> Activiteit buizen worden gereinigd voor hergebruik door koken op een hete plaat in gedeïoniseerd water. Een kleine hoeveelheid reinigingsmiddel wordt toegevoegd voor het eerst koken worden de buizen goed gespoeld en tweemaal gekookt. Als garen wordt toegepast om de buis steekt, kan gebruikt activiteit tubes (met voedsel, wax, vliegen en garen) worden gereinigd zonder voorafgaande verwijdering van het garen. </li></ol></li><li> Voorafgaand aan de behandeling van een experiment, plaats kweken die laat popstadium opgevoerd vliegen in incubators voor drie tot vier dagen aan te passen aan experimentele verlichting en andere omgevingsfactoren. Licht: donker of constante omstandigheden zijn vaak gebruikt om slaapgedrag meten. In dit voorbeeld worden gewend aan vliegen constant licht de invloed van de circadiane klok op de immuunrespons en het gedrag 2,7,8 elimineren. Zoals beschreven in figuur 1A </strong&gt;, load 1-4 dagen oude vliegen in de Trikinetics DAM2 activiteitsmonitoren zoals 6 en record voor minimaal drie dagen voor de infectie. </li></ol> 2. Infect Vliegen met een pathogene stam van bacteriën <ol><li> De hier beschreven protocol specifiek is voor S. marcescens, die gemakkelijk te kweken en te onderhouden. Protocollen voor langdurige opslag en kweekomstandigheden voor andere bacteriële species variëren. S. marcescens opgeslagen in 15-50% glycerol bij -80 ° C. Ter voorbereiding langdurige opslag, 2 volumes overnacht bacteriecultuur (OD 600 = 0,5 - 1,0) te mengen om een volume van autoclaaf 50% glycerol in 1,5 ml microcentrifugebuizen. Dit resulteert in een uiteindelijke glycerolconcentratie van 17%. Bewaar buizen bij -80 ° C. Om een ​​korte termijn voor te bereiden in-use bron van bacteriën, schraap de bevroren voorraad met een steriele 200 ul pipet tip en het uitvoeren van een drie-weg streak op een LB-agar plaat. &#39;S nachts Incubeer de plaat bij 37 &amp; dbijvoorbeeld, C tot geïsoleerde kolonies te krijgen. Bewaar de plaat bij 4 ° C. Een dag voor de geplande infectie, kies een enkele kolonie van de LB-agar plaat met een steriele 200 ul pipet en dompel de punt in een cultuur buis met 5 ml LB-medium. Bacteriën groeien nacht of tot 16 uur in een incubator shaker bij 37 ° C en 250 rpm tot in de exponentiële groeifase. Meten van de concentratie fotometrisch bij OD 600. De concentratie in deze fase varieert van 0,5 tot 1. Als de concentratie te hoog is, subcultuur de bacteriën groeien en nog enkele uren een optimale concentratie te krijgen. Voer de procedure uit in de buurt van een vlam bron. Sommige bacteriestammen zijn ontworpen voor antibioticaresistentie en worden gekweekt en geselecteerd op geschikte antibioticum aan het medium toegevoegd. S. marcescens (ATCC # 8100) niet antibiotica resistent en worden dus gekweekt in steriel medium zonder antibioticum. Om steriele techniek te controleren, doe een mock cultuopnieuw zonder bacteriën als controle. De oplossing vliegen infecteren bacteriën bevat (verdund tot OD 600 = 0,1) en 1% kleurstof (Brilliant Blue FCF) in PBS. Bereid een oplossing voor injectie controle door toevoeging van een equivalente hoeveelheid LB medium gebruikt infectie oplossing en 1% blauwe kleurstof in PBS. Bewaar oplossingen op ijs. </li><li> Bereid glas naalden voor het injecteren van de vliegen. Trek glazen capillairen (OD = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) om een ​​fijne punt met behulp van een micropipet trekker (Narishige). Onder een dissectiemicroscoop gebruikt fijne tang afbreken van de punt van de naald met de opening is groot genoeg om met injectievloeistof vullen door te zuigen met een spuit, maar klein genoeg om beschadiging van de vlieg tijdens de injectie te minimaliseren. Na het breken van de tip, moet de punt groot zijn ongeveer 40-50 micrometer. De glazen naald is bevestigd aan een 3 cc spuit met een plastic buisje. De stroom van injectiemedium wordt geregeld handmatig die positieve druk of sWanneer kunt met de spuit. Contaminatie van de rubber buis met injectievloeistof, de spuit inrichting zowel voor infectie en controle injecties. </li><li> Verdoof vliegen door ze op een CO 2 pad. CO 2 wordt door een verzegelde container water aan de pad bevochtigen en om statische elektriciteit, die manipulatie van vliegen kan bemoeilijken het pad verminderen. Injecteer vliegen door rond te snuffelen het glas naald in het gebied boven de schildje van de dorsale thorax. Het doorgeven van injectie medium in de vlieg wordt gecontroleerd door de kleurstof - vliegen blauw als de kleurstof verspreidt zich via het systeem. De dosering van bacteriën die vliegen ontvangen kan worden gekwantificeerd zoals beschreven in paragraaf 3 hieronder. Sommige experimentele ontwerpen omvatten een controle groep die aseptische letsel ontvangt door het injecteren van vliegen met PBS en kleurstof, maar zonder bacteriën. </li></ol> 3. Bepaal de bacteriële verontreiniging Een benadering om evaluating de immuunrespons tegen bacteriële infectie is het bepalen van de hoeveelheid bacteriën na infectie. D. melanogaster is een groot model om deze parameter te bepalen, omdat de hele vlieg kan worden gehomogeniseerd om de totale bacteriële aantallen te schatten binnen een individu. De rationale achter dit protocol is dat bij groei op een vast medium zoals Luria bouillon (LB) agar op een petrischaal (LB plaat), een bacterie zichtbaar onderscheiden kolonie vormt. Derhalve homogeniseren geïnfecteerde vliegen in vloeibaar LB medium, genereren seriële verdunningen van het homogenaat en verspreiden van de verdunde homogenaat op LB platen, kan het aantal bacteriële cellen infecteren van een vlieg worden bepaald. Een controlegroep van vliegen geïnjecteerd met PBS en kleurstof zonder bacteriën worden gebruikt om te controleren of de infectie niet verontreinigd met andere bacteriële species. Er mogen geen kolonies op de LB agar plaat in deze toestand. <ol><li> Autoclave alle materialen die worden gebruikt voor dezeprocedure voordat de eigenlijke homogenisatiestap. Dit omvat 200 ul pipetpunten geknipt met een schaar, LB media, en stampers voor het homogeniseren. Bereid platen door het gieten van geautoclaveerd LB / agarmedium in 10 cm steriel Petri schalen ten minste 1 dag voor het homogeniseren vliegen. </li><li> Verdoven en verzamel vliegen in 1,5 ml microcentrifuge buizen en tubes slaan op ijs. </li><li> Voer de homogenisering in de buurt van een vlam om besmetting te voorkomen. Een controle homogenisatie met vliegen zonder infectie wordt vooral aanbevolen bij gebruik van een bacteriële stam als S. marcescens, die geen antibioticaresistente. Meng minimaal 2 groepen van 10 elk vliegen per experimentele conditie. Het aantal vliegen gebruikt per homogenaat wordt bepaald door de experimentator. Sommige groepen hebben gebruikt een vlieg per homogenaat, wat handig is voor het evalueren van variatie in bacteriële verontreiniging tussen individuele vliegen 8, terwijl anderen hebben gebruikt 3-10 vliegen per homogenaatte vergelijken over genotype of experimentele conditie 9-12. <ol class="lalpha"><li> Voeg 400 ul LB-medium aan elk microcentrifugebuis met vliegen en homogeniseren met behulp van een kleine motor en een stamper (Kontes). </li><li> Met behulp van gesteriliseerde gesneden pipetpunten, seriële verdunnen het homogenaat 01:10 door toevoeging van 20 ul gehomogeniseerde LB / bacteriële medium tot 1,5 pl microcentrifugebuis met 180 ul LB-medium. Snijden pipetpunten voorkomt verstopping van vlieg vuil en zorgt ervoor dat een geschikt volume wordt overgedragen. </li><li> Verdunningsfactor wordt empirisch bepaald en afhankelijk van het genotype van de vlieg, de gebruikte bacteriestam en experimentele conditie. Voor wild type vliegen geïnfecteerd met S. marcescens, gebruik verdunningen van 1:10 of 1:10 2 3 voor vliegen direct gehomogeniseerd na infectie en verdunningen van 1:10 of 1:10 4 5 voor vliegen gehomogeniseerd 24 uur na infectie. </li><li> Voeg 100 pl LB / bacteriële medium van de microfoonrocentrifuge buizen die de uiteindelijke verdunning en verdeel het medium op een LB plaat met glasbolletjes (VWR) om een ​​gelijkmatige verdeling te verzekeren. </li><li> Gooi de glazen ballen in 100% EtOH oplossing. Plaats de LB platen in een 37 ° C incubator overnacht. </li><li> Als optionele stap, een beeldvormend systeem met zichtbaar licht een beeld van de LB platen (Fluorchem 8900; Alpha Innotech) te verkrijgen. Tel het aantal kolonies hetzij op de plaat zelf of van het beeld van de plaat met het telapparaat gereedschap in Photoshop software (Adobe Photoshop CS3). </li><li> Bereken het aantal kolonievormende eenheden per vlieg met de formule: [n / (N * D * v)] * V; waarbij n = aantal kolonies gegroeid op de LB plaat, N = het aantal vliegen samen in een microcentrifugebuis, D = verdunningsfactor en v = volume van de oplossing uitgespreid op elke plaat, V = volume van het homogenaat. </li></ol></li></ol> 4. Evalueer Slaap en Survival Duur na infectie <ol><li> Voorvliegen die niet worden geoogst voor het meten van bacteriële verontreiniging, blijven volgen gedrag voor een ander 7-10 dagen. Survival duur wordt beïnvloed door het genotype van de vlieg, de omgevingsomstandigheden, en bacteriële soorten die voor infectie. </li><li> Na ~ 10 dagen, te beëindigen van het experiment, downloaden en verwerken gedragsgegevens zoals eerder beschreven 6. Insomniac2 aangepaste software, dat gevestigd is in Matlab, wordt gebruikt om de slaap parameters te analyseren. Het is belangrijk om dode vliegen elimineren uit de gedragsanalyse. Normaal is beperkt analyses binnen de eerste dag na infectie, afhankelijk van het type infectie en fly genotype. Dood in de assay wordt aangegeven door de tijd telt alle activiteiten zijn verstreken. Om de analyse van de overleving te vergemakkelijken, Drosonex, software op maat geschreven in Microsoft Visual C + + 6.0, wordt gebruikt om ruwe data bestanden van het Trikinetics DAM-systeem te verwerken. De software rapportages als Excel-bestanden, overleven duur van elke vlieg (in uren), stelt de activiteit DATeen van alle monitoren in een spreadsheet, en rapporteert het percentage vliegt overgebleven na verloop van tijd zoals ingesteld door de gebruiker. De Excel bestanden zijn ontworpen om in andere statistische software-pakketten integreren voor verdere analyse. </li></ol> 5. Meet NFKP activiteit tijdens infectie met behulp van een luciferase reporter assay Transgene KB-luc vliegen die in deze assay werden gegenereerd zoals eerder beschreven in Kuo et al.. 2010 2. Kortom, de KB-luc reporter bevat 8 herhalingen van NFKB binding sequentie die zijn ingevoegd in een promoter stroomopwaarts van een luciferase open reading frame. <ol><li> Stel vliegen naar experimentele lichtomstandigheden zoals beschreven in paragraaf 1.2. In dit voorbeeld worden 1-4 dagen oud KB-luc vliegen gehuisvest in flesjes met een 5% sucrose, 2% agar medium en voedsel in constant licht (LL) voor 2 dagen dezelfde leeftijd als andere vliegen tijdens infectie bereiken. </li><li> Bereid een 96-well microplaat voor vliegen. Elk putje bevat 2 lagen voedsel medium (figuur 2), de bovenste laag bevat luciferine, het substraat van luciferase. Voeg 300 ul van een 5% sucrose, 2% agar aan elke well en laat stollen. Voeg daarna een 50 ul toplaag aan elk putje met 5% sucrose, 1% agar en 2 mM luciferin (Gold BioTechnology, Inc.) Luciferine concentraties gebruikt voor het meten reporter-activiteit in Drosophila hebben gevarieerd in de literatuur en zijn zo laag als 100 pM 13. De vereiste concentratie kan empirisch worden bepaald. Tussen toedienen voedsel lagen bedekken de plaat met een fijnmazige doek vergemakkelijken drogen met behoud van steriliteit. De plaat moet grondig drogen, tot een uur, om vliegen voorkomen vastlopen in condensdruppels. Omdat luciferine is lichtgevoelig, niet bloot te stellen platen om meer dan nodig branden. </li><li> Breng een duidelijke zelfklevende film (Top-Seal-A, Perkin Elmer) een 96-well plaat en geperforeerde microwell met een fijne naald in een hoeveelheid van 2 gaten per well. Deze gaten zullen niet alleen toe luchtverversing aan elk putje, maar zal ook een manier om vliegen op individuele basis verdoven. Met behulp van een scherp mes en rechte rand, de invoering van een cut tussen elke kolom. Dit zal een eenvoudige manier te laden / lossen vliegen in groepen van 8 tegelijk. Om vliegen te laden in de microwell plaat, neem dit aantal flacons uit de incubator en Anesthetize vliegen op een CO 2 pad. Load vliegt een voor een aan elk putje kolom per kolom. Indien een per ongeluk vliegen vast komen te zitten aan de lijm afdichting, laat de vlieg als ze zijn vaak in staat om zichzelf te bevrijden, zonder interventie. Zet de microwell plaat naar de incubator in LL 8 tot 24 uur aan te passen aan de nieuwe omgeving en aan de luciferine substraat consumeren. </li><li> Cultuur bacteriën, S. marcescens, en met een oplossing voor infectie zoals hierboven beschreven. </li><li> Algemene Chirurgie tvliegt hij met behulp van een micropipet tip aan een lage druk CO 2 lijn. Plaats de micropipet tip direct boven de ventilatieopeningen die voor elk putje. Wees voorzichtig dat de CO 2 druk hoog genoeg om de fly verdoven, maar laag genoeg om letsel bij de vlieg. In groepen van acht, afzonderlijk breng elke fly een CO 2 pad, en infecteren zoals hierboven beschreven. Na infectie, elke vlieg en terug te keren naar zijn oorspronkelijke en verzegelt de microplaat. </li><li> Meet luminescentie (TopCount-NXT Luminescentie en scintillatieteller, Perkin-Elmer). De TopCount luminescentie teller bevat een stapeling cassette voor platen, die het mogelijk maakt voor de geprogrammeerde en geautomatiseerde metingen continu op de gewenste stappen voor elke lengte van de tijd (meestal maximaal vijf dagen). Deze functie is niet beschikbaar op alle instrumenten, en het verzamelen van gegevens voor experimenten uitgevoerd met andere instrumenten kan dus minder frequent. De luminescentie teller is ondergebracht in een roOm met een gecontroleerde temperatuur en verlichting schema. Bij het laden van platen in de cassette stapelen, stapelen de platen met de vliegen tussen heldere lege platen om ervoor te zorgen dat vliegen licht te ontvangen. Programma luminometer volgens de specificaties te verzamelen metingen per uur ten minste 24 uur. In dit voorbeeld zijn de detectoren geprogrammeerd om goed te lezen 10 seconden en het resultaat als tellingen (arbitraire eenheden) per seconde drukken. Deze waarde is een gemiddelde over 3 metingen per putje. Exporteer de gegevens bestanden naar een spreadsheet en het uitvoeren van een standaard analyse, grafieken de resultaten van luminescentie. </li></ol>

<ol><li>Majde, J. A., Krueger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Links+between+the+innate+immune+system+and+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Allergy+Clin.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Links between the innate immune system and sleep.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).</li>
<li>Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+triggered+by+an+immune+response+in+Drosophila+is+regulated+by+the+circadian+clock+and+requires+the+NFkappaB+Relish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li>
<li>Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parasite+resistance+and+the+adaptive+significance+of+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parasite resistance and the adaptive significance of sleep.</a> BMC Evol Biol. 9, 7(2009).</li>
<li>Imeri, L., Opp, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+%28and+why%29+the+immune+system+makes+us+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">How (and why) the immune system makes us sleep.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).</li>
<li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Signaling+Protease+Required+for+Melanization+in+Drosophila+Affects+Resistance+and+Tolerance+of+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections.</a> PLoS Biol. 6, e305(2008).</li>
<li>Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+Locomotor+Activity+to+Study+Circadian+Rhythms+and+Sleep+Parameters+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (43), e2157(2010).</li>
<li>Lee, J. E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+Regulation+in+the+Ability+of+Drosophila+to+Combat+Pathogenic+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections.</a> Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).</li>
<li>Stone, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+circadian+clock+protein+timeless+regulates+phagocytosis+of+bacteria+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila.</a> PLoS Pathog. 8, e1002445(2012).</li>
<li>Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-linked+variation+in+immune+response+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 183, 1477-1491 (2009).</li>
<li>Short, S. M., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Female+and+male+genetic+contributions+to+post-mating+immune+defence+in+female+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Biol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster.</a> Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).</li>
<li>Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+sleep+and+the+immune+response+in+Drosophila%3A+a+role+for+the+NFkappaB+relish%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish.</a> Sleep. 30, 389-400 (2007).</li>
<li>Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+the+Drosophila+immune+response+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of the Drosophila immune response during aging.</a> Aging Cell. 7, 225-236 (2008).</li>
<li>Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+circadian+output+in+Drosophila+mediated+by+neurofibromatosis-1+and+Ras%2FMAPK%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK.</a> Science. 293, 2251-2256 (2001).</li>
<li>Hedengren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relish%2C+a+central+factor+in+the+control+of+humoral+but+not+cellular+immunity+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).</li>
<li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).</li>
<li>Wu, L. P., Choe, K. -M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Immunity%3A+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159, 189-199 (2001).</li>
<li>Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+is+a+genetically+tractable+model+host+for+Mycobacterium+marinum%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum.</a> Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).</li>
<li>Romeo, Y., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+immunity%3A+methods+for+monitoring+the+activity+of+Toll+and+Imd+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways.</a> Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).</li>
<li>Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+arm+of+the+Drosophila+innate+immune+response+requires+an+I%7Bkappa%7DB+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase.</a> Genes Dev. 15, 104-110 (2001).</li>
<li>Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+for+age-associated+changes+in+sleep%3Awake+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).</li>
<li>Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep%2C+aging%2C+and+lifespan+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sleep, aging, and lifespan in Drosophila.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li>
<li>Allee, W. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAllee%2C+WC+%22The+social+life+of+animals%22">The social life of animals</a>. , W.W. Norton & Company, Inc. (1938).</li>
<li>Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+circadian-regulated+elements+contribute+to+cycling+period+gene+expression+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila.</a> Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).</li>
<li>Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+analysis+of+behavioral+and+molecular+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signal analysis of behavioral and molecular cycles.</a> BMC Neurosci. 3, 1(2002).</li>
<li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+anorexia+in+resistance+and+tolerance+to+infections+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila.</a> PLoS Biol. 7, e1000150(2009).</li>
<li>Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+photoreceptive+circadian+clocks+throughout+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila.</a> Science. 278, 1632-1635 (1997).</li>
<li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27, 628-639 (2004).</li>
<li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+video+method+to+study+Drosophila+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li>
<li>Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain+differences+in+sleep+and+other+pathophysiological+sequelae+of+influenza+virus+infection+in+naive+and+immunized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice.</a> J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).</li>
<li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li>
<li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Sleep%22%5BJournal%5D)">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Dit protocol beschrijft een aanpak om te onderzoeken hoe het gedrag, in het bijzonder slapen, is gekoppeld aan immuunrespons parameters. Deze parameters omvatten bacteriële belasting effect op overleving en NFKB zoals die met een luciferase reporter in vivo. Samen vormen deze parameters geven informatie over hoe goed een vlieg kan een infectie te bestrijden. Bacteriën en effect op overleving zijn immuunrespons parameters is een eenvoudige meting in Drosophila betrekken. Rel E20 muta...

<table border="1"><tbody><tr><td> Materiaalnaam </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogusnummer </td><td> Reacties </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Uitrusting </td></tr><tr><td> Incubators </td><td> Percival Scientific, Inc </td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td> Elke incubator kunnen draaien geprogrammeerde licht / temperatuur schema geschikt is. </td></tr><tr><td> Drosophila dienst Activiteiten Monitoren </td><td> Trikinetics Inc, Waltham, MA </td><td> DAM2 </td><td> Zoals beschreven elders 6, dit systeem is een computer interface, software, en andere accessoires. </td></tr><tr><td> Pyrex glazen buizen </td><td> Trikinetics Inc, Waltham, MA </td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate scintillatie en luminescentie teller </td><td>Perkin Elmer </td><td> TopCount NXT 12 detector </td><td> Elke microplaatlezer opsporen van luminescentie kan worden gebruikt voor dit type reporter assay. TopCount bevat meerdere detectors en een geautomatiseerde stapelaar, maar kan worden geprogrammeerd om continu gelezen van meerdere platen. </td></tr><tr><td> Fluorchem 8900 </td><td> Alpha Innotech </td><td></td><td> Imaging van bacteriële culturen is optioneel; elk digitaal imaging systeem met zichtbaar licht vermogen is voldoende. </td></tr><tr><td> Micropipet Puller </td><td> TriTech Research, Inc </td><td> Narishige PC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Supplies </td></tr><tr><td> Borosilicate glazen capillairen </td><td> Wereld Precision Instrument Inc </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml spuit </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 30.5482 </td><td></td></tr><tr><td> Spuit Naalden </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305196 </td><td> 18 G - Verwijder de punt van de naald om beschadiging van de buis voorkomen. </td></tr><tr><td> Silicone Tubing, id (0,030 &quot;) od (0,065&quot;) Dikte van de Muur (0,018 &quot;) </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td> Gebruikt voor het bevestigen glazen capillair naalden om een ​​spuit </td></tr><tr><td> 3 Way Afsluitkraan </td><td> Amerikaanse Pharmaseal Company </td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Stamper Draadloze Motor </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Stamper </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> Glazen bollen 3mm </td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate Microlite 1 + </td><td> Thermo Scientific </td><td> 7571 </td><td> Select 96-well platen die geschikt zijn voor luminescentie - zij zijn ondoorzichtig. </td></tr><tr><td> Topseal-A :96-well microplaten </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005185 </td><td> Microplate Press-On Adhesive Sealing Film </td></tr><tr><td> D-luciferine, kaliumzout </td><td> Goud Biotechnology, Inc </td><td> LUCNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Software </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td> Beschikbaar op aanvraag bij de auteurs </td><td> het gebruik; geschreven door Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) </td><td> Matlab gebaseerde software die routinematig gebruikt is voor de analyse van de slaap 2,6,11 </td></tr><tr><td> Drosonex </td><td> Beschikbaar op aanvraag bij de auteurs </td><td> het gebruik; geschreven door Thomas Coradetti (Stoep Software) </td><td> Een PC MSVC6 programma dat wordt gebruikt voor de survival analyse van ruwe databestanden verzameld met deTrikinetics systeem </td></tr><tr><td> Photoshop CS3 </td><td> Adobe </td><td></td><td> Nuttig voor het verkrijgen van het aantal kve / plaat van digitale beelden (optioneel) </td></tr></tbody></table>

kwantitatieve meting van de immuunrespons en sleep in<em&gt; drosophila</em

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Een complexe interactie tussen de immuunrespons en ontvangende gedrag is beschreven in diverse soorten. Overmaat slaap, in het bijzonder kan optreden als reactie op infectie bij zoogdieren 1 en is onlangs ook beschreven in Drosophila melanogaster 2. Het is algemeen aanvaard dat de slaap gunstig voor de gastheer tijdens een infectie en dat het belangrijk is voor het behoud van een robuust immuunsysteem 3,4. Echter experimenteel bewijs dat deze hypothese ondersteunt beperkt 4 en de functie van overtollige slaap tijdens een immuunreactie blijft onduidelijk. We hebben gebruik gemaakt van een multidisciplinaire aanpak van dit complexe probleem aan te pakken, en hebben studies uitgevoerd in de eenvoudige genetische modelsysteem, de fruitvlieg Drosophila melanogaster. We maken gebruik van een standaard test voor het meten van locomotorisch gedrag en slapen in vliegen, en zien hoe deze test wordt gebruikt om gedrag in vliegen infecte metend met een pathogene bacteriestam. Deze bepaling is ook nuttig om de overlevingskans in individuele vliegen tijdens een infectie. Aanvullende maatregelen van het immuunsysteem omvatten het vermogen van vliegen een infectie en de activering van NFKB een belangrijke transcriptiefactor die centraal in de aangeboren immuunrespons in Drosophila wissen. Zowel uitkomst van overleving en bacteriële klaring tijdens infectie bij elkaar zijn indicatoren van resistentie en tolerantie voor infectie. Weerstand verwijst naar het vermogen van vliegen een infectie duidelijk, terwijl tolerantie wordt gedefinieerd als het vermogen van de gastheer om schade door een infectie dan beperken en overleven ondanks hoge pathogeen in het systeem 5. Real-time monitoring van NFKP activiteit tijdens infectie geeft inzicht in een moleculair mechanisme van overleven tijdens de infectie. Het gebruik van Drosophila in deze assays maakt het eenvoudige genetische en moleculaire analyses van slaapen de immuunrespons en hoe deze twee complexe systemen samengebouwd beïnvloed.

<ol><li> Infectie bevordert de nachtrust. In dit voorbeeld, Canton-S (CS) wildtype en mutant vliegen vliegen ontbreekt een NFKB gen, Relish (Rel E20) 14 werden geladen in twee DAM2 activiteitsmonitoren (n = 32 per genotype) en geïnfecteerd zoals hierboven beschreven. Vliegen werden in constant licht de invloed van de circadiane klok gedrag en 2,7,8 infectie elimineren. De Rel E20 mutanten werden isogenized op CS zoals hiervoor beschreven 11. Beide vliegen werden geïnfecteerd...

Om een ​​verband tussen de immuunrespons en gedrag te begrijpen, beschrijven we een methode om locomotorisch gedrag te meten in<em&gt; Drosophila</em&gt; Tijdens bacteriële infectie en het vermogen van vliegen tot een immuunrespons door monitoring overleving, bacteriële belasting en real-time activiteit van een centrale regulator van aangeboren immuniteit, NFKB.

Kwantitatieve meting van de immuunrespons en Sleep in<em&gt; Drosophila</em

Een complexe interactie tussen de immuunrespons en het gedrag van de gastheer is beschreven bij een breed scala aan soorten. Met name overmatig slapen staat bekend ...

Het algemene doel van het volgende experiment is om de slaap en immuunfunctie bij drosophila te evalueren. Dit wordt eerst bereikt door de locomotorische activiteit van geïnfecteerde vliegen te registreren om de slaap te meten, en als tweede stap, na de infectie, worden de vliegen gehomogeniseerd, verdund en uitgeplaat op LB-agarplaten om de overleving te meten. Het aantal kolonievormende eenheden dat groeit, geeft de capaciteit van de vliegen aan om de infectie te klaren.Vervolgens worden geïnfecteerde vliegen die een transgen bevatten met de NF kappa b luciferase-reporter toegevoegd aan een 96-wells plaat met luciferian, het substraat van luciferase. Real-time meting van kappa b Luciferase duidt op de activatie van een NF kappa B-signaleringsroute tijdens infectie en de uiteindelijke overleving tijdens de slaap. Bacteriële klaring en NF KB reporteractiviteit zijn metingen die mechanistisch inzicht bieden in de moleculaire link tussen immuunfunctie en gedrag.Over het algemeen hebben personen die nieuw zijn aan deze methode moeite ermee, omdat het tijd en oefening kost om te leren hoe vliegen handmatig en consistent geïnfecteerd kunnen worden. Het belangrijkste voordeel van de door

quantitative-measurement-immune-response-sleep

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

We beschrijven de procedures voor de registratie van de dagelijkse bewegingsactiviteit ritmes...

Het testen van de locomotorische activiteit te circadiaanse ritmes Studie en parameters Sleep in Drosophila</em

In this video, we demonstrate a technique for measuring the E. coli bacterial load after injecting E. coli into the thorax of Drosophila melanogaster.

Measuring E. coli Bacterial Load in Drosophila melanogaster following E. coli Infection

Hier beschrijven we een methode voor een snelle en nauwkeurige meting van vliegprestaties in Drosophila, waardoor high-throughput screening.

Een verbeterde methode voor nauwkeurige en snelle meting van Vliegprestaties in<em&gt; Drosophila</em

Hier presenteren we een protocol om de vermijding van gestreste individuen te kwantificeren. Dit paradigma is krachtig maar gebruiksvriendelijk en kan worden gebruikt om de invloed van genen en omgeving op een soort sociale interactie bij Drosophila melanogaster te beoordelen.

Ongecompliceerd Assay voor de kwantificering van Sociale Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is een uitstekend modelorganisme voor het bestuderen van aangeboren immuunsystemen en de fysiologische gevolgen van infectie en ziekte. Dit protocol beschrijft hoe robuuste en kwantitatief herhaalbare bacteriële infecties aan D. melanogaster kunnen worden toegediend, en hoe vervolgens de ernst van de infectie kan worden gemeten en de immuunrespons van de gastheer kan worden gekwantificeerd.

Systemische bacteriële infectie en afweer Phenotypes in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Dit rapport beschrijft een methode voor het meten van Drosophila larvenactiviteit met behulp van de TriKinetics Drosophila Activiteitsmonitor. Het apparaat gebruikt infraroodstralen om bewegingen van maximaal 16 individuele dieren te detecteren. Gegevens kunnen worden geanalyseerd om bewegingsparameters weer te geven, inclusief snelheden en de posities van de dieren binnen de testkamers.

Meting van larvale activiteit in de<em&gt; Drosophila</em&gt; Activity Monitor

Dit protocol wordt beschreven methoden om mondeling bloot en de fruitvlieg Drosophila melanogaster met bacteriële pathogenen infecteren, en voor het meten van het aantal infectieuze bacteriën schuur na infectie van de darm. Verder beschrijven we het effect van immuun mutanten op vliegen overleving na mondelinge bacteriële infectie.

Mondelinge bacteriële infectie en Shedding bij Drosophila melanogaster

Dit protocol beschrijft een in vivo fagocytose assay in volwassen Drosophila melanogaster te kwantificeren fagocytensysteem erkenning en goedkeuring van de microbiële infecties.

Beoordeling van de cellulaire immuunrespons van de fruitvlieg, Drosophila melanogaster, met behulp van een In Vivo fagocytose Assay

Slaaptekort is een krachtig hulpmiddel om de slaapfunctie en -regulatie te onderzoeken. We beschrijven een protocol om Drosophila te ontnemen met behulp van het Slaapvernietigend Apparaat en om de mate van rebound slaap veroorzaakt door deprivatie te bepalen.

Het slaapvernietigende apparaat: een zeer efficiënte methode om drosophila te beroven

Gepresenteerd wordt een protocol voor high-throughput drug screening om de slaap te verbeteren door het slaapgedrag van fruitvliegjes te monitoren in een ouder Drosophila-model .

High-Throughput Small Molecule Drug Screening voor leeftijdsgebonden slaapstoornissen met behulp van Drosophila melanogaster

Dit protocol biedt een kader voor het beoordelen van door stress veroorzaakte gedragsveranderingen in Drosophila melanogaster. Door complementaire assays te combineren kunnen we activiteit, verkenning en besluitvorming voor individuele vliegen kwantificeren. De aanpak is flexibel en kan worden aangepast aan een breed scala aan studies die stressbiologie, metabolisme en neurogedragsfunctie onderzoeken.

Multimodale gedragsfenotypering van stress-geïnduceerde depressie-achtige toestanden bij Drosophila melanogaster

Leer de kwantitatieve meting van immuunrespons en slaap bij Drosophila door locomotorische activiteit, bacteriële klaring en NFκB-luciferase-activiteit te analyseren. Deze methode onthult moleculaire verbanden tussen immuunfunctie en gedrag.

Kwantitatieve meting van de immuunrespons en Sleep in

Meer video's verkennen