Kwantitatieve meting van de immuunrespons en Sleep in Drosophila

Het algemene doel van het volgende experiment is om slaap en immuunfunctie bij drosophila te evalueren. Dit wordt voor het eerst bereikt door de activiteit van geïnfecteerde vliegen op te nemen om slaap en overleving te meten, als tweede stap worden de vliegen gehomogeniseerd, verdund en uitgespreid op LB-agarplaten. Het aantal kolonievormende eenheden dat groeit, geeft de mogelijkheid van vliegen om de infectie te verwijderen aan.

Vervolgens worden geïnfecteerde vliegen die een transgen tot expressie brengen dat de NF kappa b luciferase reporter bevat, toegevoegd aan een 96-wellplaat met luciferine, het substraat van luciferase. Real-time meting van kappa b Luciferase geeft activering van een NF kappa B signaalroute tijdens infectie aan, samen met slaap en overlevingsresultaten. Bacteriële klaring en NF KB reporter activiteit zijn metingen die mechanistisch inzicht geven in de moleculaire link tussen immuunfunctie en gedrag.

Over het algemeen worstelen individuen die nieuw zijn in deze methode omdat het tijd en oefening kost om te leren hoe vliegen handmatig geïnfecteerd kunnen worden met consistentie. Het grote voordeel van de Lucifer gerapporteerde techniek boven bestaande methoden zoals QPCR is dat NF Kappa B activiteit continu in real time in levende vliegen kan worden gemeten. Begin met het incuberen van laat pupa-stadium drosophila culturen gedurende drie tot vier dagen, zodat de volwassenen zich aanpassen aan omgevingsomstandigheden.

Hier worden de vliegen onder constant licht geplaatst om de invloed van de circadiane klok op de immuunrespons en het gedrag te elimineren. Laad vervolgens een tot vier dagen oude vliegen in de activiteit. Monitoren registreren hun activiteit gedurende minimaal drie dagen voorafgaand aan de infectie, één dag voor de geplande infectie.

Kies een enkele SIA kolonie met een steriele pipettentip en dompel de tip onder in een kweekbuisje met vijf milliliter LB-medium om de steriele techniek te verifiëren. Vergeet niet om een controle mock-kweek zonder bacteriën te maken. Laat de bacteriën overnacht groeien tot het de exponentiële groeifase bereikt. De volgende dag.

Meet de absorbantie van de kweek op 600 nanometer. Voeg een tweede Q vet toe als blanco. Het is klaar wanneer de concentratie tussen 0,5 tot één absorbantie-eenheden is. De kweek kan worden onderverdeeld of de kweektijd kan worden verlengd indien nodig.

Bereid nu de bacteriënoplossing voor om de vliegen te infecteren. Verdun de bacteriën met PBS tot een verwachte absorbantie van 0,1 bij 600 nanometer. Voeg vervolgens voedselkleurstof toe voor de injectiecontrole.

Vervang de bacteriën met LB-medium. Bewaar beide oplossingen op ijs. Maak vervolgens, met behulp van een micropipettrekker, injectienaalden met een fijne punt onder een dissectiemicroscoop.

Gebruik een fijne pincet om de punt van elke naald af te breken, zodat de opening groot genoeg is om te vullen met injectievloeistof door middel van zuiging, maar ook klein genoeg om schade aan de vlieg te minimaliseren. Bevestig een glazen naald aan een drie cc kunststof spuit met een lengte van slangen met behulp van de spuit. De stroom van injectiemedium wordt handmatig geregeld.

Vermijd het verontreinigen van de rubberen slang met injectievloeistof, aangezien het spuitapparaat wordt gebruikt voor zowel infectieuze als controle-injectie. Controleer de stroom van injectiemedium met behulp van een Kim-wipe weefsel. Twee kritieke details voor succesvolle injecties zijn het gebruik van de optimale naaldgrootte en de veilige afdichting tussen de naald en de spuit.

Zodra het injectiesysteem volledig is voorbereid, verdoof de vliegen met een minimale stroom kooldioxide, ga snel te werk zodat geen vliegen langer dan vijf minuten verdoofd zijn. Injecteer nu vliegen door de glazen naald in de regio boven de scheel tellum van de dorsale thorax te steken. De doorgang van injectiemedium in de vlieg wordt geverifieerd door de voedselkleurstof, die te zien is als de geïnjecteerde oplossing zich verspreidt.

Voordat u begint, moet u ervoor zorgen dat alle materialen die voor deze procedure worden gebruikt, ook minstens een dag van tevoren zijn geautoclaveerd. Bereid 10 centimeter petrischalen voor met LV-agarmedium. Op de dag van het experiment verdoof en plaats vliegen in 1,5 milliliter centrifugeerbuisjes.

Bereid een minimum van twee groepen van 10 vliegen elk per experimentele conditie voor. Bereid ook een controlegroep van vliegen zonder infectie voor, vooral wanneer een bacteriestam zonder antibioticaresistentie wordt gebruikt. Bewaar alle geladen buisjes op ijs.

Voeg vervolgens 400 microliter LB-medium toe aan elke vlieg beladen buis. Homogeniseer de vliegen met een kleine peal en doe dit in de buurt van een vlam om besmetting te voorkomen. Gebruik nu de afgesneden pipettentips om de homogenaat stap voor stap te verdunnen in volumes van 200 microliters.

Als het homogenaat onmiddellijk na infectie met sia is gemaakt, maak het tot één op 1000, maar voor 24 uur na infectie homogenaat, maak het tot één op 100.000. Zaai vervolgens de grootste twee verdunningen op 10 centimeter platen met behulp van glazen bollen om een gelijkmatige verdeling te garanderen, incubeer de platen overnacht. De volgende dag telt u het aantal kolonies op de plaat door directe observatie of via kolonietellingssoftware.

Bereken vervolgens het aantal kolonievormende eenheden per vlieg. Deze test gebruikt transgene vliegen die de kappa b luciferase reporter op het juiste moment dragen. De test vereist ook gekweekte bacteriën zoals SCIA die voor injectie zijn voorbereid zoals beschreven in de vorige sectie.

Pas de vliegen aan de experimentele lichtomstandigheden aan. In dit voorbeeld worden een tot vier dagen oude kappa b luciferase vliegen gehuisvest in buisjes met 5% sucrose, 2% agar voedingsmedium, en geplaatst in constant licht gedurende twee dagen. Bereid nu een 96-wel plaatje voor voor de vliegen.

Vul elke wel met twee lagen voedsel. Medium eerst, voeg 300 microliters