Name: Genoom-brede gendeleties in Streptococcus sanguinis Door High Throughput PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 7 s
Description: Leer hoe je genoom-brede gendeleties maakt in Streptococcus sanguinis met behulp van high-throughput PCR. Deze methode maakt efficiënte genetische modificaties en verificatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd ondersteund door subsidies R01DE018138 van de National Institutes of Health (PX) en gedeeltelijk door Virginia Commonwealth University Presidential Research Incentive Program (PRIP) 144.602-3 (PX). Wij danken Drs. Lei Chen, Yuetan Dou en Xiaojing Wang voor het assisteren bij de bouw van genoom brede mutanten. We danken ook de DNA-Core Facility in Virginia Commonwealth University voor DNA-sequencing.

1. Primer ontwerp <ol><li> Primers zijn ontworpen met behulp huis scripts gebaseerd op de S. sanguinis SK36 genoomsequentie. Drie sets van primers, F1/R1, F2/R2 en F3/R3 zijn ontworpen voor amplificatie van de 1-kb stroomopwaartse sequentie van het doelwitgen, de APHA-3 gen dat codeert voor kanamycine resistentie (Km r) eiwit 3 en de 1 -kb stroomafwaartse sequentie van het doelwitgen, respectievelijk (Figuur 1). Van deze primers wordt F1 en R3 ontworpen met ePrimer3 in de EMBOSS pakket van programma&#39;s ( <a href="http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html" target="_blank">http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html</a> ) om flankerende gebieden amplificeren stroomopwaarts of stroomafwaarts van het doelwit gen. Genspecifieke primers, R1 en F3 zijn ontworpen op basis van de 5&#39;-en 3&#39;-sequenties van het doelwitgen. R1 en F3 primers bevatten 25 bp adaptersequenties einde hun 5&#39;die complementair zijn aan de APHA-3gen. De smelttemperatuur van elke primer werd ontworpen om zo dicht mogelijk bij 60 ° C tot gebruik van een uniforme annealing temperatuur voor PCR reacties in 96-well formaat mogelijk. </li><li> F1, R1, F3 en R3 primers worden gesynthetiseerd in 96-well platen op basis van een gen order. Elke plaat bevat een type primers in hetzelfde gen order. Verdun de primers in 96-well plaat werken primer tot een eindconcentratie van 10 pM voor PCR amplificatie met een meerkanaalspipet. </li></ol> 2. High-throughput PCR Amplification and Purification <ol><li> Om high-throughput versterken 1-kb stroomopwaarts of stroomafwaarts van de doelgroep S. sanguinis genen monteren een PCR cocktail mengsel op ijs in een 15 ml conische buis met 1640 pi ddH 2 O, 250 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ul van 10 mM dNTP mengsel werd 100 ul 50 mM MgSO4, 100 pi 10 ng / ul S. sanguinis SK36 genomisch DNA en 10 pl Platinum Taq DNA polymerase high fidelity en overdracht 23 ul van het mengsel in elk putje op 96-well PCR-plaat met een meerkanaalspipet. Breng 1 pi van elke F1 en R1 (of F3 en R3) van 10 pM primer werkt platen aan de PCR plaat met meerkanaalspipet. Dicht de PCR amplificatie uitgevoerd plaat en bij 94 ° C gedurende 1 min, en 30 cycli van 94 ° C gedurende 30 sec, 54 ° C gedurende 30 sec en 68 ° C gedurende 1,5 minuten. </li><li> Bereid 1% agarose gel die ethidiumbromide met 48 wells fitting meerkanaalspipet loading. Meng 4 pl PCR product met 1 pi 5xDNA loading buffer op 96-well plaat en plaats de monsters op agarose gel met een 10-pl meerkanaalspipet. Draaien elektroforese bij 135 V gedurende 30 minuten. Onderzoek de band op gel onder UVP documentatie en analyse systeem. </li><li> Zuiver de PCR producten van Purelink 96 PCR purification kit met centrifugatie volgens aanwijzingen van de fabrikant. Voor het elueren van DNA, voeg 40 ul steriel ddH 2 O naar de bron van de bINDENDE plaat. </li><li> Willekeurig pick verschillende gezuiverd amplicons op de plaat om de DNA-concentraties met behulp van NanoDrop spectrofotometer te onderzoeken. Dient de concentratie van amplicons op plaat tot ~ 10 ng / ul. </li><li> Een plasmide dat Kmr cassette wordt gedigereerd met EcoRI als PCR sjabloon. Het gedigereerde plasmide wordt gezuiverd door QIAquick PCR purification kit en het lineaire plasmide DNA wordt aangepast aan de uiteindelijke DNA concentratie van 10 ng / ul. Monteer 25 pi mengsel Kmr cassette amplicon inbegrip 16,4 ul ddH 2 O, 2,5 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ui 10 mM dNTP mengsel, 1 pi 50 mM Mg SO 4, 1 pi 10 pM F2, 1 pi 10 pM R2, 1 gl lineair plasmide DNA en 0,1 pl Platinum Taq DNA polymerase high fidelity. Voer PCR amplificatie bij 94 ° C gedurende 1 min, en 30 cycli van 94 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 30 sec en 68 ° C gedurende 1 minuut. Onderzoeken PCR product door gel elektroforese op 1% agarose. Poola bulk van de Kmr cassette amplicon van 10 afzonderlijke PCR gezuiverd door QIAquick PCR purification kit. Stel de amplicon concentratie 10 ng / ul. </li><li> Om de uiteindelijke lineaire recombinant PCR amplicon te verkrijgen, worden drie PCR amplicons met elkaar gecombineerd 1 pi (in nagenoeg gelijke molaire hoeveelheden) in een PCR plaat en de PCR sjabloon. Andere PCR-componenten bevat, met inbegrip 14,4 pl ddH 2 O, 2,5 pi 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ui 10 mM dNTP mengsel, 1 pi 50 mM Mg SO 4, 1 pi 10 pM F1, 1 pi 10 pM R3, 0,1 ul Platinum Taq DNA-polymerase high fidelity. PCR amplificatie wordt uitgevoerd bij 94 ° C gedurende 2 min, 30 cycli van 94 ° C gedurende 30 sec 55 ° C gedurende 30 sec en 68 ° C gedurende 3,5 min, en tenslotte 68 ° C gedurende 4 minuten. </li><li> Onderzoeken PCR amplicons op agarosegel. Zuiveren en kwantificeren PCR amplicons zoals hierboven beschreven. Bevries de gerecombineerde PCR amplicons bij -20 ° C. </li></ol> 3. Combevoegde Cellen Voorbereiding <ol><li> Todd Hewitt bouillon bereid, pH aangepast tot 7,6 met 10 N NaOH, verwarmd tot koken en daarna afgekoeld tot kamertemperatuur en gesteriliseerd met 0,22 urn polystyreen filter 4. Voeg 300 ul hitte geïnactiveerd horse sera (eindconcentratie 2,5%) en 11,7 ml Todd Hewitt bouillon in 15-ml conische buis te maken TH + HS medium. Aliquot TH + HS medium in 2 ml en 10 ml in buizen. </li><li> Inoculeer 5 ul van voorraad S. sanguinis SK36 ingevroren bij -80 ° C in 2 ml TH + HS medium en incubeer overnacht cultuur met aftopping goed bij 37 ° C tezamen met pre-incubatie van 10 ml-TH + HS buis. </li><li> Na overnacht, Pipetteer 50 ul cultuur in 10 ml TH + HS en incubeer de buis bij 37 ° C gedurende 3 uur (overeenkomend met OD 660 van 0,07 tot 0.08), onmiddellijk gebruikt voor transformatie. </li></ol> 4. Cel Transformatie en antibiotische selectie <ol><li> Voeg 2 pl 70 ng S. sanguinis SK36 bevoegdetentie stimulerende peptide (CSP) en 2 ui lineaire recombinant PCR amplicon (~ 50 ng) naar Eppendorf buisjes op 96-well blok voorverwarmen ze bij 37 ° C. Breng 330 pl van 3 hr-bebroede SK36 cultuur in elke buis. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Vervang DNA met steriel ddH 2 O als controle. </li><li> Plaats het blok op ijs en verdeeld 100 pi van elke transformatie op Brain Heart Infusion (BHI) agar plaat met 500 ug / ml kanamycine. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 2 d onder microaerobe omstandigheden. </li></ol> 5. Mutant Bevestiging en opslag <ol><li> Voor elke mutant vervanging, willekeurig neem 2 afzonderlijke kolonies, de kolonie inoculeren in 5 ml BHI dat 500 ug / ml kanamycine en incubeer het inoculum microaerobically nacht bij 37 ° C. Cryopreserveren elke cultuur in 30% glycerol bij -80 ° C </li><li> Om te onderzoeken of de mutant met de verwachte genvervanging, kolonie PCR voor elke mutant met F1 en R3 voerenprimers in 96-well plaat PCR. Ongeveer 1-pi overnacht cultuur van individuele kolonie wordt gebruikt als DNA template in 25-ul PCR-amplificatiereactie. PCR wordt uitgevoerd bij 94 ° C gedurende 5 min, 35 cycli van 94 ° C gedurende 30 sec, 55 ° C gedurende 30 sec en 68 ° C gedurende 3,5 min, en tenslotte 68 ° C gedurende 4 minuten. </li><li> Om precies te identificeren dubbele band mutanten of contaminant PCR amplicon, onderzoekt de PCR amplicon door elektroforese gedurende 4 uur op&gt; 12 cm lang 2% agarose gel met ethidiumbromide kleuring. Onder deze agarosegelelektroforese conditie, werden alle amplicons met ≥ 100 bp verschil duidelijk. Bij bands gevolg van amplificatie van de Kmr cassette en het wild-type gen worden verwacht verschillen &lt;100 bp, een interne T1 primer wordt gebruikt om te bepalen of een wild-type gen kan worden gedetecteerd door PCR. </li><li> Om bevestigen de verwijdering worden de amplicons gezuiverd door Purelink 96 PCR purification kit en de sequentie met de primer P1 diebindt aan de Kmr cassette. Uitsluitend juiste mutanten bevestigd door sequencing. </li></ol>

<ol><li>Sassetti, C. M., Boyd, D. H., Rubin, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+required+for+mycobacterial+growth+defined+by+high+density+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genes required for mycobacterial growth defined by high density mutagenesis.</a> Mol. Microbiol. 48, 77-84 (2003).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+Bacillus+subtilis+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Essential Bacillus subtilis genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 4678-4683 (2003).</li>
<li>Trieu-Cuot, P., Courvalin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide+sequence+of+the+Streptococcus+faecalis+plasmid+gene+encoding+the+3%275%22-aminoglycoside+phosphotransferase+type+III%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nucleotide sequence of the Streptococcus faecalis plasmid gene encoding the 3'5"-aminoglycoside phosphotransferase type III.</a> Gene. 23, 331-341 (1983).</li>
<li>Paik, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+virulence+determinants+for+endocarditis+in+Streptococcus+sanguinis+by+signature-tagged+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Identification of virulence determinants for endocarditis in Streptococcus sanguinis by signature-tagged mutagenesis.</a> Infect. Immun. 73, 6064-6074 (2005).</li>
<li>Lukomski, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpolar+inactivation+of+the+hypervariable+streptococcal+inhibitor+of+complement+gene+%28sic%29+in+serotype+M1+Streptococcus+pyogenes+significantly+decreases+mouse+mucosal+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Nonpolar inactivation of the hypervariable streptococcal inhibitor of complement gene (sic) in serotype M1 Streptococcus pyogenes significantly decreases mouse mucosal colonization.</a> Infect. Immun. 68, 535-542 (2000).</li>
<li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+K-12+in-frame%2C+single-gene+knockout+mutants%3A+the+Keio+collection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection.</a> Mol. Syst. Biol. 2, (2006).</li>
<li>de Berardinis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+complete+collection+of+single-gene+deletion+mutants+of+Acinetobacter+baylyi+ADP1%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Syst.+Biol%22%5BJournal%5D)">A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1.</a> Mol. Syst. Biol. 4, 174(2008).</li>
<li>Rodriguez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+molecular+characterization+of+genetic+competence+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oral.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Physiological and molecular characterization of genetic competence in Streptococcus sanguinis.</a> Mol. Oral. Microbiol. 26, 99-116 (2011).</li>
<li>Perry, D., Kuramitsu, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Streptococcus+mutans+Infect%5BTitle%5D)+AND+%22Immun%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Streptococcus mutans Infect.</a> Immun. 32, 1295-1297 (1981).</li>
<li>Pakula, R., Walczak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+nature+of+competence+of+transformable+streptococci%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">On the nature of competence of transformable streptococci.</a> J. Gen. Microbiol. 31, 125-133 (1963).</li>
<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Xu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+essential+gene+identification+in+Streptococcus+sanguinis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide essential gene identification in Streptococcus sanguinis.</a> Sci. Rep. 1, (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Om de mogelijke polaire effecten van de vervanging van een targetgen met exogeen gen antibiotica op naburige genen minimaliseren, worden twee stappen terwijl de initiële primer ontwerpen. Voor de meeste van verwijderde genen, de primers R1 en F3 om de coderende regio 6 bp verwijderen na het startcodon tot 30 bp vóór het stopcodon. De laatste 30 basenparen vastgehouden mogelijke ribosomale bindingsplaats die de aangrenzende downstream gen beschermen. De bewaarde gebied tussen twee naburige genen wordt uitgebreid tot 100 ...

<table><tbody><tr><td>Primer F2</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>TGACTAACTAGGAGGAATAAATG&lt;br/&gt;GCTAAAATGAGAATAT</td></tr><tr><td>Primer R2</td><td>ibid</td><td></td><td>CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA&lt;br/&gt;CAATTCATCCAGT</td></tr><tr><td>Primer F2p</td><td>ibid</td><td></td><td>GATAAACCCAGCGAACCATTTGA</td></tr><tr><td>Primer P1</td><td>ibid</td><td></td><td>GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA</td></tr><tr><td>Primer P2</td><td>ibid</td><td></td><td>GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC</td></tr><tr><td>Primer 5' end_R1_seq</td><td>ibid</td><td></td><td>GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA</td></tr><tr><td>Primer 5' end_F3_seq</td><td>ibid</td><td></td><td>GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG</td></tr><tr><td>Primer 5' end_R1p_seq</td><td>ibid</td><td></td><td>CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC</td></tr><tr><td>CSP</td><td>Synprep</td><td></td><td>sequentie:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH</td></tr><tr><td>DNA-polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>11304-102</td><td>Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs Inc</td><td>R0101S</td><td>Restrictie-enzym</td></tr><tr><td>Agar</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01185</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Promega</td><td>V3125</td><td></td></tr><tr><td>BHI</td><td>BD Biosciences</td><td>237500</td><td>Brain Heart Infusion</td></tr><tr><td>Paardenserum</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007403</td><td>Paardenserum</td></tr><tr><td>Km</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Kanamycine</td></tr><tr><td>TH-bouillon</td><td>BD Biosciences</td><td>249240</td><td>Todd Hewitt-bouillon</td></tr><tr><td>PureLink 96</td><td>Invitrogen</td><td>K310096</td><td>PureLink 96 PCR-zuiveringskit</td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>QIAquick PCR-zuiveringskit</td></tr><tr><td>Filter</td><td>Corning</td><td>431117</td><td>0.22 &amp;mu;m polystyreenfilter</td></tr><tr><td>Anoxomat-systeem</td><td>Mart Microbiology b.v.</td><td>Anoxomat Mark II</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004377</td><td>Sorvall Legend RT Plus microplaatrotor</td></tr><tr><td>Gel-documentatiesysteem</td><td>UVP LLC</td><td>BioDoc-It 210</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-690-625D</td><td>Isotemp</td></tr><tr><td>Labnet's Gel XL</td><td>Labnet</td><td>E0160</td><td>Labnet's Gel XL</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td>Microcentrifuge 5415 R</td></tr><tr><td>Multikanaalpipetten</td><td>Thermo Scientfic</td><td>4661040, 4661020</td><td>Finnpipette F1</td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems Inc.</td><td>N805-0200</td><td>GeneAmp PCR-systeem 9700</td></tr></tbody></table>

genoom-brede gendeleties in<em&gt; streptococcus sanguinis</em&gt; door high throughput pcr

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Transposon mutagenese en single-gendeletie zijn twee methoden toegepast genoom knockout in bacteriën 1,2. Hoewel transposon mutagenese is minder tijdrovend, minder duur en vereist geen voltooid genoominformatie zijn er twee zwakke punten in deze werkwijze: (1) de mogelijkheid van een heterogene mutanten in de gemengde mutant bibliotheek die tegen de mutanten geselecteerd met verminderde concurrentie; en (2) de mogelijkheid van gedeeltelijke geninactivering waarbij genen niet geheel verliezen hun functie na het inbrengen van een transposon. Single-gendeletie analyse kan compenseren voor de nadelen van transposon mutagenese. Om de efficiëntie van genoom-brede enkele gendeletie te verbeteren, proberen we een high-throughput techniek voor genoom-wijde enkele gendeletie met Streptococcus sanguinis als een model organisme. Elk gen in S. deletieconstruct sanguinis genoom ontworpen om 1 omvat-Kb stroomopwaarts van het targetgen, de APHA-3-gen, dat codeert voor kanamycine resistentie-eiwit, en 1 kb stroomafwaarts van het targetgen. Drie sets van primers F1/R1, F2/R2 en F3/R3 respectievelijk zijn ontworpen en gesynthetiseerd in een 96-well plaat formaat voor PCR-amplificaties van deze drie componenten van elke deletieconstruct. Primers R1 en F3 bevatten 25-bp sequenties die complementair zijn aan gebieden van de APHA-3 gen einde hun 5&#39;. Een grootschalige PCR amplificatie van de APHA-3 gen wordt eenmaal uitgevoerd voor het maken van alle enkel gen deletieconstructen. De promotor van APHA-3 gen aanvankelijk niet het potentiële effect van kanamycine polaire cassette minimaliseren. De gendeletie constructies te realiseren, worden high-throughput PCR amplificatie en zuivering uitgevoerd in een 96-well plaat formaat. Een lineaire recombinant PCR amplicon voor elk gen deletie wordt samengesteld door vier PCR-reacties met high-fidelity DNA polymerase. De initiële exponpreferentiële groeifase van S. sanguinis gekweekt in Todd Hewitt bouillon aangevuld met 2,5% geïnactiveerd paardenserum wordt de bekwaamheid verhogen voor de transformatie van PCR-recombinant constructen. Onder deze voorwaarde, tot 20% van S. sanguinis cellen kunnen worden getransformeerd met ~ 50 ng DNA. Op basis van deze benadering werden 2.048 mutanten met enkele gendeletie uiteindelijk verkregen uit de 2.270 genen in S. sanguinis met uitzondering van vier gen ORFs die volledig binnen andere ORFs in S. sanguinis SK36 en 218 potentiële essentiële genen. De techniek voor het maken gendeletie constructen high throughput en kan gemakkelijk in genoom gen deleties gebruiken voor transformeerbaar bacteriën.

Na PCR-amplificatie met primers F1 en R1, en F3 en R3, werd respectievelijk ongeveer 1-kb stroomopwaarts en stroomafwaarts van elk S. sanguinis-gen verkregen in een 96-well formaat (Figuur 2A). Onder onze PCR-condities en met gebruik van de ontworpen primers werd in elke PCR-reactie een specifiek product geamplificeerd uit genomisch DNA van S. sanguinis. Dit resultaat gaf aan dat de primers zeer specifiek waren voor de targets van S. sanguinis. Door PCR-reamplificatie met prime...

Een efficiënte genoom-brede enkel gen mutatie methode is vastgesteld aan de hand<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Als modelorganisme. Deze methode heeft bereikt via high throughput recombinant PCRs en transformaties.

Genoom-brede gendeleties in<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Door High Throughput PCR

Transposonmutagenese en single-gene deletie zijn twee methoden die worden toegepast voor genoombrede gene knockout in bacteriën 1,2. Hoewel transposonmutagenese ...

Het algemene doel van deze procedure is om genoombrede deleties van enkelvoudige genen in streptococcus sanguine te maken via high-throughput PCR. Dit wordt bereikt door eerst drie ampliconen te verkrijgen via high-throughput PCR-amplificatie, waaronder het antibioticumresistentiegen, evenals de upstream- en downstream-DNA-sequenties van het doelgen. De tweede stap is het verkrijgen van het lineaire recombinante PCR-amplicon met gebruik van de drie PCR-ampliconen als templates.Vervolgens worden de competente s sanguine-cellen geprepareerd. De laatste stap is de transformatie van het lineaire recombinante PCR-amplicon in competente s sanguineous-cellen. Ten slotte worden colon A PCR-amplificatie en DNA-sequencing gebruikt om de correcte mutanten te verifiëren.Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere uitputtende methoden, zoals suïcide-plasmide knockout, is dat deze methode genome-wide deletiemutanten direct via high-throughput kan creëren. PCR-primers kunnen worden ontworpen en gesynthetiseerd zoals beschreven in het schriftelijke protocol, met behulp van in-house scripts gebaseerd op de genoomsequentie van streptococcus sanguineous SK 36. Drie sets primers werden ontworpen voor amplificatie van de sequentie van één kilobase stroomopwaarts van het doelgen, de A PHA drie gen ENC coderend, het kanamycine-resistentie-eiwit, en de sequentie van één kilobase stroomafwaarts van het doelgen.Gen-specifieke primers. R1 en F3 zijn ontworpen op basis van de 5'- en 3'-sequenties van het doelgen om de regio van 1 kb stroomopwaarts of stroomafwaarts van de target s sanguine-genen met een hoge doorvoersnelheid te amplificeren. Stel eerst een PCR-cocktail samen op ijs in een conische buis van 15 ml.Raadpleeg de tekst voor de componenten van het PCR-mengsel dat s sanguineous genomisch DNA bevat. Breng met een meerkanaalpipet 23 µL van het mengsel over naar elke put van een 96-putsen PCR-plaat. Voor de upstream-sequentie van het doelgen wordt met de meerkanaalpipet telkens 1 µL van de F1- en R1-primers vanuit 10 µM werkprimerplaten naar de PCR-plaat overgebracht. Doe hetzelfde met de F3- en R3-primers om de downstream-sequentie van het doelgen te amplificeren. Seal de PCR-plaat en voer de amplificatie uit bij 94 °C gedurende één minuut, gevolgd door 30 cycli van 94 °C gedurende 30 seconden.54 °C gedurende 30 seconden en 68 °C gedurende 1,5 minuut. Bereid na amplificatie een 1% agarosegel voor met een passend bromide en 48 putjes die geschikt zijn voor laden met een multichannelpipet. Meng vier µL van het PCR-product met één µL van vijf X DNA-laadbuffer.Laad de monsters op een agarosegel in een 96-wells plaat met behulp van een 10 µL multichannelpipet. Voer elektroforese uit bij 135 V gedurende 30 minuten. Analyseer de banden op de gel met een UVP-documentatie- en analysesysteem.Zuiver de PCR-producten met de pure link 96 PCR purification kit middels centrifugatie volgens de instructies van de fabrikant voor het elueren van DNA. Voeg 40 µL steriel dubbel gedestilleerd water toe aan elke well van de bindingsplaat. Selecteer willekeurig enkele gezuiverde ampliconen op de plaat om de DNA-concentraties te bepalen.Pas met een NanoDrop-spectrofotometer de concentratie van de ampliconen op de plaat aan tot ongeveer 10 nanogram per microliter. Gebruik vervolgens Eco RI om een plasmide dat de kanamycin-resistentie-cassette bevat te digesteren, zodat dit als PCR-template kan dienen. Zuiver het gedigesteerde plasmide met de Qiagen Quick PCR Purification Kit en pas het lineaire plasmide-DNA aan naar een uiteindelijke DNA-concentratie van 10 nanogram per microliter.Stel een PCR-mengsel van 25 µL samen voor het amplicon van de kanamycin-resistentiecassette, inclusief de primers F twee en R two zoals vermeld in de schriftelijke procedure. Voer, in aanvulling op deze video, de PCR-amplificatie uit zoals hier beschreven. Om het PCR-product te analyseren, wordt gelelektroforese uitgevoerd op een 1% agarosegel.Combine vervolgens een hoeveelheid ampliconen van de canavaline-resistentiecassette van 10 PCR-gezuiverde individuen. Pas de concentratie van de ampliconen aan naar 10 nanogram per microliter. Het moeilijkste aspect van deze procedure is het verkrijgen van het uiteindelijke lineair competente PCR-product uit de drie PCR-producten.Om succes te garanderen, worden de drie PCR-amplificaten aangepast naar een vrijwel gelijke hoeveelheid. Combineer telkens één µL van de drie 10 ng/µL PCR-amplificaten in één PCR-plaat, samen met het PCR-template. Bereid vervolgens het PCR-mengsel, inclusief de F1- en R3-primers zoals vermeld in de schriftelijke procedure.Voer vervolgens PCR-amplificatie van de monsters uit. Analyseer de PCR-ampliconen op een agarosegel na zuivering en kwantificering van de PCR-ampliconen. Bevries de gecombineerde PCR-ampliconen, zoals eerder gedaan, bij -20 °C.Bereid eerst Todd Hewitt- en paardenserummedium voor zoals beschreven in de schriftelijke procedure die bij deze video is gevoegd. Aliquoteer 2 mL medium en 10 mL medium in twee conische buizen van 15 mL. Inoculeer 5 µL ontdooide stock S. sanguine SK 36, die was ingevroren bij -80 °C, in 2 mL medium. Incubeer de strak afgesloten cultuur gedurende de nacht bij 37 °C.Pre-incubeer ook de buis met 10 milliliter medium onder dezelfde omstandigheden na de incubatie gedurende de nacht. Breng 50 microliters van de cultuur over in de buis met 10 milliliter medium. Incubeer de buis gedurende drie uur bij 37 graden Celsius.Voeg direct na de incubatie twee microliters van 70 nanogram sanguineus, SK 36 competentie-stimulerend peptide en twee microliters lineair recombinant PCR-amplicon toe aan eprobes op een 96-wells blok en verwarm deze voor op 37 °C. Breng 330 microliters van de drie uur geïncubeerde SK 36-cultuur over naar elke buis. Vervang het DNA door steriel dubbel gedestilleerd water als controle.Incubeer de buisjes na incubatie één uur lang bij 37 °C. Plaats het blok op ijs en verspreid 100 µL van elke transformatie op brain heart infusion of BHI-agarplaten met 500 µg/mL kanamycine. Incubeer de platen twee dagen bij 37 °C onder micro-aerobe omstandigheden. Selecteer voor elke vervangingsmutant willekeurig twee individuele kolonies en inoculeer elke kolonie in 5 mL BHI bevatten 500 µg/mL kanamycine. Incubeer elk inoculum overnacht bij 37 °C onder micro-anaerobe omstandigheden.Cryopreserveer elke cultuur in 30% glycerol bij -80 °C. Om te onderzoeken of de mutant de verwachte genvervanging bevat, wordt voor elke mutant een kolonie-PCR uitgevoerd met F1- en R3-primers in een 96-wells PCR-plaat.Gebruik ongeveer 1 µL overnight-cultuur van elke individuele kolonie als DNA-template in een PCR-amplificatiereactie van 25 µL. Voer de PCR-amplificatie uit om de vervanging van het mutante gen te bevestigen, zodat dubbele band-mutanten of contaminerende PCR-amplicons nauwkeurig geïdentificeerd kunnen worden. Analyseer het PCR-amplicon via gelelectroforese gedurende vier uur op een gel met een lengte van meer dan 12 cm.2% agarosegel met bromfenolblauw-kleuring onder deze agarosegelelektroforese-condities. Ampliconen met een verschil van 100 basenparen of meer kunnen duidelijk worden geïdentificeerd. Wanneer de banden die voortkomen uit amplificatie van de kanamycin-resistentiecassette en het wildtype-gen naar verwachting minder dan 100 basenparen verschillen, kan alternatief een interne T one-primer van het doelgen worden gebruikt om te bepalen of een wildtype-gen via PCR kan worden gedetecteerd.Om de deletie verder te bevestigen, worden de amplicons gezuiverd met de pure link 96 PCR purification kit en gesequenced met gebruik van de P one primer, die bindt aan de kanamycin-resistentiecassette; behoud alleen de correcte mutanten die door sequencing zijn bevestigd na PCR-amplificatie met de primers F1 en R one voor de upstream-sequentie en F three en R three voor de downstream-sequentie. Ongeveer één kilobase upstream en downstream van elk s sanguineous-gen werd verkregen in 96-wells formaat onder de PCR-condities en met gebruik van de ontworpen primers.In elke PCR-reactie werd een specifiek product geamplificeerd uit genomisch DNA van s sanguine, wat aantoonde dat de primers zeer specifiek waren voor de targets van s sanguine via PCR-reamplificatie met primers F1 en R three en drie amplicons als DNA-templates. Lineaire recombinante PCR-constructen werden met een hoge doorvoersnelheid gecreëerd. Op een 96-wellplaat, bestaande uit een regio stroomopwaarts van elk targetgen, een cany-cassette en een regio stroomafwaarts van elk targetgen in die volgorde, werden de recombinante PCR-constructen vervolgens getransformeerd in s sanguine SK 36 en geselecteerd op cany op BHI-agarplaten.Voor de meeste transformaties werden na een micro-aerobe incubatie van twee dagen meer dan 1000 kolonies per plaat verkregen. Wanneer deze kolonies werden PCR-geamplificeerd met F1 en R drie, werd bij gel-elektroforese een enkele DNA-band waargenomen die overeenkwam met de verwachte grootte van de mutant bij pogingen om potentieel essentiële genen te deleten. Voor de deletie van sommige essentiële genen zouden bij de meeste transformaties geen kolonies verkregen moeten worden.Er werden echter nog steeds kolonies verkregen na transformatie; na PCR-amplificatie van deze kolonies met F1 en R verschenen er drie 2D NA-banden die overeenkwamen met de verwachte mutantgrootte en de wildtypegrootte, zoals aangetoond door gelelektroforese. Voor sommige mutanten lagen de verwachte mutantgrootte en de wildtypegrootte van het PCR-amplicon te dicht bij elkaar om gescheiden te kunnen worden door een lange agarosegel. In dat geval werd een interne T one-primer van het doelgen ontworpen op basis van de wildtypegensequentie.PCR werd uitgevoerd met behulp van de interne T one primer en de F1 primer. Het wildtype SK 36 werd gebruikt als positieve controlestam voor deze PCR. Als er met de interne primer een band van de verwachte grootte werd geamplificeerd uit de mutant, werd het gen geïdentificeerd als een essentieel gen.Aangezien de aanwezigheid van de kanamycinecassette in de mutant eerder was bevestigd via DNA-sequencing met behulp van de P1-primer, zijn op basis van dit protocol 2048 niet-essentiële S. sanguineus-genmutanten verzameld. Hierbij zijn de vier open leesramen die volledig binnen andere open leesramen lagen, uitgesloten.Onder de experimentele omstandigheden werden 218 genen geïdentificeerd die essentieel zijn voor het overleven van s sanguine. Na het bekijken van deze video's heb je naar mijn mening een goed beeld van hoe genoombrede gen-knock-outs kunnen worden uitgevoerd met behulp van high-throughput PCR.

genome-wide-gene-deletions-streptococcus-sanguinis-high-throughput

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Systematische, grootschalige synthetische genetische (gen-gen of epistase) interactie schermen kunnen worden gebruikt om genetische redundantie en route overspraak verkennen. Hier hebben we een high-throughput kwantitatieve synthetische genetische scala screening technologie te beschrijven, genoemd eSGA door ons ontwikkelde voor het ophelderen van epistatisch relaties en het verkennen van genetische interactie netwerken...

Het in kaart brengen Bacteriële Functionele Netwerken en Wegen in<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Gebruik van synthetische Genetische Arrays

De Green Monster methode kan de snelle montage van meerdere deleties gemarkeerd met een reportergen codeert groen fluorescent eiwit. Deze methode is gebaseerd op een giststammen door herhaalde cycli van seksuele assortiment van deleties en fluorescentie gebaseerde verrijking van cellen die meer deleties.

The Green Monster Werkwijze voor de generatie van giststammen dragen Meerdere gendeleties

Source: Tomás, J. M., et al. Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility. J. Vis. Exp. (2022).This video demonstrates the initiator-dependent amplification of a suicide plasmid in E. coli. The plasmid, which carries an antibiotic resistance gene, replicates only in the presence of an initiator protein encoded by the host. After electroporation and incubation in recovery medium, the mixture is plated on antibiotic-containing agar.

Amplification of a Suicide Plasmid in a Bacterial Host

CRISPR/Cas9 is een robuust systeem om genen en genetische elementen te onderbreken. Hier beschrijven we een protocol voor het efficiënt creëren van genomische deleties in zoogdiercellijnen met behulp van CRISPR/Cas9.

Generatie van Genomic Deleties in zoogdiercellijnen via CRISPR / Cas9

Experimentele validatie van enhancer-activiteit wordt het beste benaderd door middel van functieverliesanalyse. Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd dat CRISPR/Cas9-gemedieerde deletie gebruikt om allelspecifieke regulatie van genregulatie in F1 ES-cellen te bestuderen die een hybride genoom bevatten (Mus musculus129 x Mus castaneus).

Het genereren van CRISPR / Cas9 Mediated monoallelische verwijderingen in Enhancer-functie van muis embryonale stamcellen Studie

Dit manuscript beschrijft een duplex digitale PCR test die kan worden gebruikt om tegelijkertijd kwantificeren Enterococcus spp. En HF183 genetische merkers als indicatoren van algemene en menselijke-geassocieerde fecale besmetting in recreatiewater.

Een duplex digitale PCR test voor gelijktijdige kwantificering van de<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; En de Human Fecal-geassocieerde HF183 Marker in Waters

We beschrijven een facile, snelle en relatief goedkope methode voor het genereren van gen-verstoord Streptococcus mutans stammen; Deze techniek kan worden aangepast voor de generatie van gen-verstoord stammen van verschillende diersoorten.

Generatie van een gen-verstoord Streptococcus mutans stam zonder Gene klonen

Hier presenteren we een protocol voor het gebruik van reeds bestaande antibiotica resistentie-cassette schrapping constructies als basis voor het maken van schrapping mutanten in andere stammen van E. coli . Dergelijke mutaties schrapping kunnen worden gemobiliseerd en ingevoegd in de corresponderende locus van een geadresseerde stam met behulp van P1 bacteriofaag transductie.

Productie van Gene verwijderingen in Escherichia coli door P1 transductie met accijnsplichtige antibioticaresistentie Cassettes

Hier beschreven is een eenvoudige methode voor de zuivering van een genproduct in Streptococcus mutans. Deze techniek kan voordelig zijn bij de zuivering van eiwitten, met name membraan eiwitten en hoge moleculaire massa-eiwitten, en kan worden gebruikt met verschillende andere bacteriesoorten.

Zuivering van een hoog molecuulmassa-eiwit in Streptococcus mutans

Hier beschreven is een methode voor gerichte, markerless gen verwijdering in Chlamydia trachomatis met behulp van floxed cassette allelic uitwisseling mutagenese, FLAEM.

Markerless Gene Deletion door Floxed Cassette Allelic Exchange Mutagenesis in Chlamydia trachomatis

Hier beschrijven we de constructie van nulmutanten van Aeromonas in specifieke glycosyltransferasen of regio's die glycosyltransferasen bevatten, de beweeglijkheidstests en flagellenzuivering die worden uitgevoerd om de betrokkenheid en functie van hun gecodeerde enzymen in de biosynthese van een glycaan vast te stellen, evenals de rol van deze glycaan in bacteriële pathogenese.

Generatie van null-mutanten om de rol van bacteriële glycosyltransferasen in bacteriële motiliteit op te helderen

Leer hoe je genoom-brede gendeleties maakt in Streptococcus sanguinis met behulp van high-throughput PCR. Deze methode maakt efficiënte genetische modificaties en verificatie mogelijk.

Genoom-brede gendeleties in

Meer video's verkennen