Genoom-brede gendeleties in

Het algemene doel van deze procedure is om genoombrede deleties van enkelvoudige genen in streptococcus sanguine te maken via high-throughput PCR. Dit wordt bereikt door eerst drie ampliconen te verkrijgen via high-throughput PCR-amplificatie, waaronder het antibioticumresistentiegen, evenals de upstream- en downstream-DNA-sequenties van het doelgen. De tweede stap is het verkrijgen van het lineaire recombinante PCR-amplicon met gebruik van de drie PCR-ampliconen als templates.

Vervolgens worden de competente s sanguine-cellen geprepareerd. De laatste stap is de transformatie van het lineaire recombinante PCR-amplicon in competente s sanguineous-cellen. Ten slotte worden colon A PCR-amplificatie en DNA-sequencing gebruikt om de correcte mutanten te verifiëren.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere uitputtende methoden, zoals suïcide-plasmide knockout, is dat deze methode genome-wide deletiemutanten direct via high-throughput kan creëren. PCR-primers kunnen worden ontworpen en gesynthetiseerd zoals beschreven in het schriftelijke protocol, met behulp van in-house scripts gebaseerd op de genoomsequentie van streptococcus sanguineous SK 36. Drie sets primers werden ontworpen voor amplificatie van de sequentie van één kilobase stroomopwaarts van het doelgen, de A PHA drie gen ENC coderend, het kanamycine-resistentie-eiwit, en de sequentie van één kilobase stroomafwaarts van het doelgen.

Gen-specifieke primers. R1 en F3 zijn ontworpen op basis van de 5'- en 3'-sequenties van het doelgen om de regio van 1 kb stroomopwaarts of stroomafwaarts van de target s sanguine-genen met een hoge doorvoersnelheid te amplificeren. Stel eerst een PCR-cocktail samen op ijs in een conische buis van 15 ml.

Raadpleeg de tekst voor de componenten van het PCR-mengsel dat s sanguineous genomisch DNA bevat. Breng met een meerkanaalpipet 23 µL van het mengsel over naar elke put van een 96-putsen PCR-plaat. Voor de upstream-sequentie van het doelgen wordt met de meerkanaalpipet telkens 1 µL van de F1- en R1-primers vanuit 10 µM werkprimerplaten naar de PCR-plaat overgebracht. Doe hetzelfde met de F3- en R3-primers om de downstream-sequentie van het doelgen te amplificeren. Seal de PCR-plaat en voer de amplificatie uit bij 94 °C gedurende één minuut, gevolgd door 30 cycli van 94 °C gedurende 30 seconden.

54 °C gedurende 30 seconden en 68 °C gedurende 1,5 minuut. Bereid na amplificatie een 1% agarosegel voor met een passend bromide en 48 putjes die geschikt zijn voor laden met een multichannelpipet. Meng vier µL van het PCR-product met één µL van vijf X DNA-laadbuffer.

Laad de monsters op een agarosegel in een 96-wells plaat met behulp van een 10 µL multichannelpipet. Voer elektroforese uit bij 135 V gedurende 30 minuten. Analyseer de banden op de gel met een UVP-documentatie- en analysesysteem.

Zuiver de PCR-producten met de pure link 96 PCR purification kit middels centrifugatie volgens de instructies van de fabrikant voor het elueren van DNA. Voeg 40 µL steriel dubbel gedestilleerd water toe aan elke well van de bindingsplaat. Selecteer willekeurig enkele gezuiverde ampliconen op de plaat om de DNA-concentraties te bepalen.

Pas met een NanoDrop-spectrofotometer de concentratie van de ampliconen op de plaat aan tot ongeveer 10 nanogram per microliter. Gebruik vervolgens Eco RI om een plasmide dat de kanamycin-resistentie-cassette bevat te digesteren, zodat dit als PCR-template kan dienen. Zuiver het gedigesteerde plasmide met de Qiagen Quick PCR Purification Kit en pas het lineaire plasmide-DNA aan naar een uiteindelijke DNA-concentratie van 10 nanogram per microliter.

Stel een PCR-mengsel van 25 µL samen voor het amplicon van de kanamycin-resistentiecassette, inclusief de primers F twee en R two zoals vermeld in de schriftelijke procedure. Voer, in aanvulling op deze video, de PCR-amplificatie uit zoals hier beschreven. Om het PCR-product te analyseren, wordt gelelektroforese uitgevoerd op een 1% agarosegel.

Combine vervolgens een hoeveelheid ampliconen van de canavaline-resistentiecassette van 10 PCR-gezuiverde individuen. Pas de concentratie van de ampliconen aan naar 10 nanogram per microliter. Het moeilijkste aspect van deze procedure is het verkrijgen van het uiteindelijke lineair competente PCR-product uit de drie PCR-producten.

Om succes te garanderen, worden de drie PCR-amplificaten aangepast naar een vrijwel gelijke hoeveelheid. Combineer telkens één µL van de drie 10 ng/µL PCR-amplificaten in één PCR-plaat, samen met het PCR-template. Bereid vervolgens het PCR-mengsel, inclusief de F1- en R3-primers zoals vermeld in de schriftelijke procedure.

Voer vervolgens PCR-amplificatie van de monsters uit. Analyseer de PCR-ampliconen op een agarosegel na zuivering en kwantificering van de PCR-ampliconen. Bevries de gecombineerde PCR-ampliconen, zoals eerder gedaan, bij -20 °C.

Bereid eerst Todd Hewitt- en paardenserummedium voor zoals beschreven in de schriftelijke procedure die bij deze video is gevoegd. Aliquoteer 2 mL medium en 10 mL medium in twee conische buizen van 15 mL. Inoculeer 5 µL ontdooide stock S. sanguine SK 36, die was ingevroren bij -80 °C, in 2 mL medium. Incubeer de strak afgesloten cultuur gedurende de nacht bij 37 °C.

Pre-incubeer ook de buis met 10 milliliter medium onder dezelfde omstandigheden na de incubatie gedurende de nacht. Breng 50 microliters van de cultuur over in de buis met 10 milliliter medium. Incubeer de buis gedurende drie uur bij 37 graden Celsius.

Voeg direct na de incubatie twee microliters van 70 nanogram sanguineus, SK 36 competentie-stimulerend peptide en twee microliters lineair recombinant PCR-amplicon toe aan eprobes op een 96-wells blok en verwarm deze voor op 37 °C. Breng 330 microliters van de drie uur geïncubeerde SK 36-cultuur over naar elke buis. Vervang het DNA door steriel dubbel gedestilleerd water als controle.

Incubeer de buisjes na incubatie één uur lang bij 37 °C. Plaats het blok op ijs en verspreid 100 µL van elke transformatie op brain heart infusion of BHI-agarplaten met 500 µg/mL kanamycine. Incubeer de platen twee dagen bij 37 °C onder micro-aerobe omstandigheden. Selecteer voor elke vervangingsmutant willekeurig twee individuele kolonies en inoculeer elke kolonie in 5 mL BHI bevatten 500 µg/mL kanamycine. Incubeer elk inoculum overnacht bij 37 °C onder micro-anaerobe omstandigheden.

Cryopreserveer elke cultuur in 30% glycerol bij -80 °C. Om te onderzoeken of de mutant de verwachte genvervanging bevat, wordt voor elke mutant een kolonie-PCR uitgevoerd met F1- en R3-primers in een 96-wells PCR-plaat.

Gebruik ongeveer 1 µL overnight-cultuur van elke individuele kolonie als DNA-template in een PCR-amplificatiereactie van 25 µL. Voer de PCR-amplificatie uit om de vervanging van het mutante gen te bevestigen, zodat dubbele band-mutanten of contaminerende PCR-amplicons nauwkeurig geïdentificeerd kunnen worden. Analyseer het PCR-amplicon via gelelectroforese gedurende vier uur op een gel met een lengte van meer dan 12 cm.

2% agarosegel met bromfenolblauw-kleuring onder deze agarosegelelektroforese-condities. Ampliconen met een verschil van 100 basenparen of meer kunnen duidelijk worden geïdentificeerd. Wanneer de banden die voortkomen uit amplificatie van de kanamycin-resistentiecassette en het wildtype-gen naar verwachting minder dan 100 basenparen verschillen, kan alternatief een interne T one-primer van het doelgen worden gebruikt om te bepalen of een wildtype-gen via PCR kan worden gedetecteerd.

Om de deletie verder te bevestigen, worden de amplicons gezuiverd met de pure link 96 PCR purification kit en gesequenced met gebruik van de P one primer, die bindt aan de kanamycin-resistentiecassette; behoud alleen de correcte mutanten die door sequencing zijn bevestigd na PCR-amplificatie met de primers F1 en R one voor de upstream-sequentie en F three en R three voor de downstream-sequentie. Ongeveer één kilobase upstream en downstream van elk s sanguineous-gen werd verkregen in 96-wells formaat onder de PCR-condities en met gebruik van de ontworpen primers.

In elke PCR-reactie werd een specifiek product geamplificeerd uit genomisch DNA van s sanguine, wat aantoonde dat de primers zeer specifiek waren voor de targets van s sanguine via PCR-reamplificatie met primers F1 en R three en drie amplicons als DNA-templates. Lineaire recombinante PCR-constructen werden met een hoge doorvoersnelheid gecreëerd. Op een 96-wellplaat, bestaande uit een regio stroomopwaarts van elk targetgen, een cany-cassette en een regio stroomafwaarts van elk targetgen in die volgorde, werden de recombinante PCR-constructen vervolgens getransformeerd in s sanguine SK 36 en geselecteerd op cany op BHI-agarplaten.

Voor de meeste transformaties werden na een micro-aerobe incubatie van twee dagen meer dan 1000 kolonies per plaat verkregen. Wanneer deze kolonies werden PCR-geamplificeerd met F1 en R drie, werd bij gel-elektroforese een enkele DNA-band waargenomen die overeenkwam met de verwachte grootte van de mutant bij pogingen om potentieel essentiële genen te deleten. Voor de deletie van sommige essentiële genen zouden bij de meeste transformaties geen kolonies verkregen moeten worden.

Er werden echter nog steeds kolonies verkregen na transformatie; na PCR-amplificatie van deze kolonies met F1 en R verschenen er drie 2D NA-banden die overeenkwamen met de verwachte mutantgrootte en de wildtypegrootte, zoals aangetoond door gelelektroforese. Voor sommige mutanten lagen de verwachte mutantgrootte en de wildtypegrootte van het PCR-amplicon te dicht bij elkaar om gescheiden te kunnen worden door een lange agarosegel. In dat geval werd een interne T one-primer van het doelgen ontworpen op basis van de wildtypegensequentie.

PCR werd uitgevoerd met behulp van de interne T one primer en de F1 primer. Het wildtype SK 36 werd gebruikt als positieve controlestam voor deze PCR. Als er met de interne primer een band van de verwachte grootte werd geamplificeerd uit de mutant, werd het gen geïdentificeerd als een essentieel gen.

Aangezien de aanwezigheid van de kanamycinecassette in de mutant eerder was bevestigd via DNA-sequencing met behulp van de P1-primer, zijn op basis van dit protocol 2048 niet-essentiële S. sanguineus-genmutanten verzameld. Hierbij zijn de vier open leesramen die volledig binnen andere open leesramen lagen, uitgesloten.

Onder de experimentele omstandigheden werden 218 genen geïdentificeerd die essentieel zijn voor het overleven van s sanguine. Na het bekijken van deze video's heb je naar mijn mening een goed beeld van hoe genoombrede gen-knock-outs kunnen worden uitgevoerd met behulp van high-throughput PCR.