Isoleren Primaire Melanocyte-achtige cellen van de Muis van het Hart
29 september 2014
In dit protocol, w e identificeerde een nieuwe populatie van melanocyt-achtige cellen (ook bekend als cardiale melanocyten) in de harten van muizen en mensen die bijdragen aan atriale aritmie veroorzaakt in muizen.
Het algemene doel van deze procedure is het isoleren van levensvatbare hartmelanocyt-achtige cellen uit het hart van een muis. Dit wordt bereikt door eerst harten te oogsten van geëuthanaseerde muizen. De tweede stap is het fijnmalen van de harten en het dissociëren van de cellen middels enzymatische digestie en mechanische agitatie.
Vervolgens wordt de cellsuspensie gecentrifugeerd en wordt het pellet met de cardiomyocyten en melanocyt-achtige cellen opnieuw gesuspendeerd. De laatste stap is het uitplaten en kweken. De uiteindelijk geïsoleerde cardiac melanocyt-achtige cellen kunnen worden gebruikt voor patch-studies of microarray-analyse in reactie op pathofysiologische stressoren om de cellulaire exciteerbaarheid of de status van het transcriptoom te beoordelen.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van bestaande methoden die zijn ontworpen om cardiomyocyten te isoleren en te kweken, is dat het leidt tot de isolatie van veel functionele hartmelanocyt-achtige cellen. We kregen oorspronkelijk het idee voor deze methode toen we een nieuwe celpopulatie in het hart van de muis ontdekten en de fysiologie hiervan wilden onderzoeken. Begin met het voorbereiden van twee sets gesteriliseerde chirurgische instrumenten: één voor het uitnemen van de harten en een andere voor het fijnmalen van het weefsel.
Bereid vervolgens de supplementen voor het medium voor, maar wacht met het toevoegen hiervan aan het kweekmedium tot vlak voor het uitplaten van de cellen. Nadat het kweekmedium is bereid, moet de oplossing in een weefselkweekkap worden gefiltreerd om deze te steriliseren; bewaar het medium vervolgens bij vier graden Celsius. Bereid de DNA's one-oplossing door 0,05 gram DNA's one toe te voegen aan 100 milliliters DPBS met 10% FBS plus antibiotica.
Bereid vervolgens een 0,5% trypsine-oplossing door 0,5 gram trypsine toe te voegen aan 100 milliliter DPBS met antibiotica. Verzamel tot slot de overige benodigdheden om de procedure te voltooien, waaronder Petrischalen, conische buizen van 50 milliliter, celzeefjes van 40 micron, DPBS met antibiotica, en kweekschalen van 60 millimeter en 35 millimeter. Na het euthanaseren van P0 tot P2 neonatale muizenpups, veegt u hun borstkas schoon met alcohol en plaatst u hen in een P2-schaal van 10 centimeter met DPBS. Open onder een stereomicroscoop voorzichtig de borstholte en verwijder het gehele hart inclusief de atria.
Was de harten in DPBS en breng ze over naar een nieuwe Petri-schaal van 10 centimeter. Plaats de Petri-schaal met de uitgesneden harten in een steriele werkkabine en hanteer steriele technieken voor de volgende stappen. Was de harten vervolgens drie keer in steriele DPBS aangevuld met antibiotica.
Plaats de harten in een kweekschaal van 60 millimeter en voeg zes tot acht milliliter 0,5% trypsin-oplossing toe. Snijd vervolgens de harten in kleine stukjes en incubeer deze 30 minuten bij 37 graden Celsius. Trek na voltooiing van de incubatie de resulterende oplossing uit de schaal over in een steriele conische buis van 10 milliliter.
Gebruik een steriele pipet van 10 milliliter om de oplossing snel maar voorzichtig 30 tot 50 keer te resuspenderen, en filter de resulterende suspensie door een celzeef van 40 micron in een nieuwe schone conische buis van 50 milliliter. Aspireer na centrifugatie voorzichtig het supernatant en resuspendeer de resterende pellet in zes tot acht milliliter steriele DPBS. Herhaal deze stap nog twee keer.
Na de derde spoeling na centrifugatie wordt de wasoplossing voorzichtig afgegoten of weggezogen en wordt het pellet geresuspendeerd in zes milliliter aangevuld kweekmedium. Trek vervolgens de geresuspendeerde oplossing op in een steriele transferpipet en plaats de cellen in een schaal van 35 millimeter. Neem de geïsoleerde hartcellen van drie pasgeboren muizen na een incubatie van één nacht, zuig het kweekmedium samen met alle niet-gehechte cellen weg, spoel de platen vervolgens één keer met DPBS, voeg vers medium toe aan de platen en vervang het medium.
Cellen die zijn geïsoleerd uit neonatale of embryonale harten kunnen elke twee dagen gedurende maximaal drie weken in cultuur worden gehouden, terwijl cellen uit volwassen harten maximaal 10 dagen in cultuur kunnen worden gehouden. Om melanocyt-achtige cellen uit een hart van een volwassen muis te isoleren, moeten de uitgesneden harten eerst in een weefselkweekkast worden gewassen in steriele DPBS met antibiotica. Knijp het hart voorzichtig samen met gebogen dissectiepincetten om resterend bloed te verwijderen en spoel het hart daarna nogmaals met DPBS.
Verwijder vervolgens de atria en de atrioventriculaire annulus uit de harten en plaats de uitgesneden weefselmonsters in een schaal van 35 millimeter. Snijd de harten in kleine stukjes met een gebogen schaar en een pincet. Voeg zes tot acht milliliter 0,5% trypsin-oplossing toe aan de schaal en incubeer bij 37 °C gedurende 45 tot 60 minuten.
Herhaal na de incubatie de eerder gedemonstreerde stappen om een suspensie van volwassen hartcellen en platers te verkrijgen zoals voorheen. In dit voorbeeld identificeert de witte pijl de cardiale melanocyt in beide panelen. Merk op dat zonder de hulp van de fluorescerende marker de cardiale melanocyt moeilijk te identificeren is en te onderscheiden van de aan de schaal gehechte atriale myocyten; de lichtblauwe pijlpunt wijst naar atriale cellen die niet goed gehecht zijn aan de hier getoonde schaal, gezonde cardiale melanocyten geïsoleerd uit een neonataal muizenhart.
Ze hebben uitgebreide dendritische uitlopers ontwikkeld en vertonen een sterke gelijkenis met cutane melanocyten. Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze in enkele uren worden uitgevoerd, mits correct uitgevoerd. Na het bekijken van deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe levensvatige melanocyten uit het hart kunnen worden geïsoleerd.
Dat zal geschikt zijn voor fysiologische en moleculaire analyse.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol beschrijft de isolatie van cardiale melanocyt-achtige cellen uit muizenharten, die betrokken zijn bij atriale aritmie. De methode omvat het oogsten, fijnmaken en enzymatisch verteren van hartweefsel om levensvatbare cellen te verkrijgen voor verdere analyse.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Hartbiologie
- Cellulaire fysiologie
- Onderzoek naar aritmie
Achtergrond
- Cardiale melanocyt-achtige cellen vormen een nieuwe celpopulatie.
- Deze cellen kunnen een rol spelen bij het triggeren van aritmie.
- Inzicht in hun functie zou kunnen leiden tot nieuwe inzichten in hartaandoeningen.
- Isolatie van deze cellen maakt een gedetailleerde studie van hun eigenschappen mogelijk.
Doel van de studie
- Om levensvatbare cardiale melanocyt-achtige cellen uit muizenharten te isoleren.
- Om de rol van deze cellen bij atriumaritmie te beoordelen.
- Om verder onderzoek naar cellulaire exciteerbaarheid en transcriptomische status mogelijk te maken.
Gebruikte methoden
- Het oogsten van harten van geëuthanaseerde muizen.
- Het fijnmalen van de harten en het dissociëren van cellen via enzymatische digestie.
- Het centrifugeren van het cellensuspensie om het pellet te isoleren.
- Het uitplaten en cultiveren van de geïsoleerde cellen voor verdere studies.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle isolatie van cardiac melanocyte-achtige cellen.
- Cellen kunnen worden gebruikt voor patch-studies of microarray-analyse.
- Inzichten in cellulaire exciteerbaarheid onder pathofysiologische stressfactoren.
- Potentiële implicaties voor het begrijpen van mechanismen van atriale aritmie.
Conclusies
- Cardiale melanocyt-achtige cellen vormen een aanzienlijke populatie in het hart.
- Ze kunnen bijdragen aan het triggeren van aritmie bij muizen.
- Verder onderzoek is nodig om hun rol in de menselijke cardiale gezondheid te verkennen.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
De isolatie van cardiale melanocyt-achtige cellen maakt mechanische risicoreductie van targets gerelateerd aan aritmie mogelijk door een ziekterellevant systeem te bieden om cellulaire exciteerbaarheid en transcriptomische responsen onder pathofysiologische stress te bestuderen. Dit ondersteunt targetvalidatie en fenotypische screeningsinspanningen in cardiovasculaire discovery-programma's door een gezuiverde celpopulatie aan te bieden voor assay-ontwikkeling en lead-identificatie. De methode verhoogt het voorspellende vertrouwen in de vroege discovery-fase door nieuwe cel-fenotypes te koppelen aan functionele uitkomsten die relevant zijn voor mechanismen van atriumaritmie.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutische R&D
Vroege Ontdekking & Target Validatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om therapeutische hypothesen met betrekking tot triggers van aritmie te onderzoeken door middel van de isolatie van een nieuwe populatie hartcellen.
- Operationele waarde: Biedt een gezuiverde celbron voor functionele studies die de biologische mechanismen ten grondslag aan cellulaire exciteerbaarheid verduidelijken.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt mechanistische risicoreductie door hartmelanocyt-achtige cellen te koppelen aan aritmogeen potentieel in muismodellen.
Screening & Assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert levensvatbare cardiale melanocyt-achtige cellen die geschikt zijn voor patchclamp- en microarray-analyse, wat kwantitatieve fysiologische uitlezingen mogelijk maakt.
- Operationele waarde: Genereert reproduceerbare celpreparaten die kunnen worden uitgeplaat als zuivere populaties of kunnen worden gecocultiveerd met cardiomyocyten voor gestandaardiseerde assays.
- Assay-gereedheid: Levert voldoende celgetallen voor downstream screeningtoepassingen ter beoordeling van cellulaire responsen op pathofysiologische stressoren.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeelden: Geïsoleerde cellen vormen een model voor een nieuwe cofactor voor triggers van atriumritmestoornissen bij muizen, wat de ontwikkeling van preklinische modellen ondersteunt.
- Translationele continuïteit: Maakt onderzoek naar cellulaire exciteerbaarheid en de status van het transcriptoom mogelijk, waardoor de stap van ontdekking naar mechanistisch begrip van ritmestoorningsmechanismen wordt overbrugd.
- Risico-gecorrigeerde vooruitgang: Biedt een systeem om de effecten van doelwitmodulatie op fenotypes gerelateerd aan ritmestoornissen te evalueren voorafgaand aan preklinische investeringen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De isolatiemethode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelhypotheses tot fenotypische screening, en biedt een ziekterelateerd systeem voor het evalueren van de functie van hartcellen in aritmiepaden.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothese-testen en pathway-verduidelijking door het isoleren van een nieuwe celpopulatie die betrokken is bij triggers voor atriale aritmie.
- Screening: Maakt assay-ontwikkeling mogelijk door het genereren van levensvatbare, zuivere celpopulaties die geschikt zijn voor elektrofysiologische en transcriptomische analyse.
- Analytics: Faciliteert kwantitatieve metingen van cellulaire prikkelbaarheid en veranderingen in genexpressie als reactie op pathofysiologische stressoren.
- Translational Research: Verbindt vroege ontdekking met preklinische validatie door het modelleren van een vermeend aritmie-triggerend celtype in een muissysteem.
- Enterprise Reuse: Vestigt een reproduceerbaar isolatieprotocol dat in verschillende studies kan worden toegepast om consistente preparaten van cardiale melanocyt-achtige cellen te genereren.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Mechanistische risicoreductie van aritmie-targets door toegang tot een ziekterelevant celmodel.
- Operationele waarde: Gestandaardiseerde isolatie- en uitplaatprocedure die de reproduceerbaarheid en schaalbaarheid van de celproductie waarborgt.
- Strategische waarde: Ondersteunt go/no-go-beslissingen door biologische onzekerheid rondom nieuwe celpopulaties in de cardiale pathofysiologie te verminderen.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering mogelijk van targets die gekoppeld zijn aan aritmie-mechanismen gemedieerd door cardiale melanocytair-achtige cellen.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in de dissectie van hartweefsel, enzymatische dissociatie en steriele celcultuurtechnieken.
- Afhankelijk van toegang tot neonatale of volwassen muizenharten, enzymatische reagentia (trypsine) en celzeefjes voor het verwijderen van debris.
- Vereist gestandaardiseerde protocollen voor mediabereiding en supplementatie om de celviabiliteit over verschillende experimenten te behouden.
- Overwegingen voor aanpassing omvatten het bijstellen van de enzymatische incubatietijden op basis van de hartrijping (neonataal versus volwassen) om de opbrengst te optimaliseren.
- Praktische beperkingen omvatten de noodzaak van fluorescente markers om geïsoleerde cardiale melanocyt-achtige cellen betrouwbaar te identificeren vanwege de morfologische gelijkenis met atriale myocyten.
