Functionele Magnetische Resonantie Imaging (fMRI) met Auditieve Stimulatie in Zangvogels

Het algemene doel van deze procedure is om een geoptimaliseerd protocol te demonstreren voor de succesvolle visualisatie van geluidsperceptie en -verwerking in auditieve gebieden en zangcontrolegebieden in de hersenen van zangvogels. Met behulp van functionele MRI wordt dit bereikt door eerst auditieve stimuli van goede kwaliteit voor te bereiden, die kunnen worden opgenomen in een aan-uit blokparadigma om aan de vogel te presenteren tijdens een functionele MRI- of fMRI-scan. De tweede stap is om de vogel voor te bereiden op de scan door deze eerst te anesthetiseren en vervolgens te positioneren op een aangepast dierenbed, dat vervolgens in de boring van de MRI-scanner wordt geplaatst. Vervolgens kunnen fMRI-beelden worden verkregen tijdens de auditieve stimulatie.

De laatste stap is het voorbewerken van de verkregen MRI-data, inclusief de normalisatie van de beelden naar de atlas van de zebravink. Uiteindelijk wordt statistische voxel-gebaseerde analyse gebruikt om visualisatie van de verkregen resultaten mogelijk te maken en de hersenactivaties die door de auditieve stimuli worden opgewekt te lokaliseren. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ten opzichte van andere vaker gebruikte methoden in het onderzoek naar honingzuigers, zoals elektrofysiologie, histologie en moleculaire mappingtechnieken, is dat fMRI een niet-invasieve in vivo methode is, waardoor hetzelfde subject in de loop van de tijd bestudeerd kan worden en het hele brein in één keer kan worden geanalyseerd zonder voorafgaande hypothese over de lokalisatie van de neurale substraten die betrokken zijn bij het onderzochte proces.

Personen die nieuw zijn met deze methode kunnen problemen ondervinden, omdat het implementeren van functionele MRI bij vogels zeer verschillend en veel uitdagender is dan bij mensen of knaagdieren. Dit komt niet alleen door de kleine omvang van de hersenen van deze proefpersonen, maar ook doordat hun schedel uit talrijke luchtholten bestaat, wat susceptibiliteitsartefacten veroorzaakt. Door een spin-echo-sequentie te gebruiken die minder gevoelig is voor deze artefacten dan een gradiëntsequentie, kunnen we functionele beeldvorming van de gehele hersenen van de zangvogel uitvoeren met een zeer goede ruimtelijke specificiteit. De opening van de scanner is een besloten ruimte die de auditieve stimuli kan vervormen.

Om de voorbereiding voor dit protocol te starten, dient u daarom de geluidsstimuli op te nemen terwijl deze worden afgespeeld in de bore van het zeven T MR-systeem met behulp van een glasvezelmicrofoon en de vervormingen voor het gebruikte MRI-systeem te verifiëren. Hier kunnen we de versterkte en onderdrukte frequenties zien, zoals blijkt uit opnames van witte ruis gemaakt buiten de scanner en op de locatie van de kop van de vogel binnen de magneetbore. Om deze kunstmatige versterking te compenseren, past u voor de getoonde opstelling een equalizerfunctie toe op elke stimulus met behulp van wave lab-software.

In dit protocol bestaat de functie uit een Gaussische kern met de parameters die op het scherm worden weergegeven. Hier moeten de songstimuli bestaan uit verschillende individuele songmotieven van een specifieke vogel, afgewisseld met perioden van stilte; pas de duur van deze stille perioden aan om de totale hoeveelheid geluid en stilte voor alle stimuli identiek te houden. De totale lengte van elke stimulus is 16 seconden, wat overeenkomt met de acquisitietijd van twee fMRI-beelden.

Gebruik voorbereidingssoftware om de intensiteit van elk nummer te normaliseren op basis van de matched root mean square en pas een high-pass filter toe bij 400 hertz voordat deze worden geïntegreerd in de volledige stimulus. Het experiment kan worden ontworpen met presentatiesoftware met behulp van een on-off blokontwerp, waarbij perioden van auditieve stimulatie afwisselen met rustperioden. Elk blok moet 16 seconden duren, wat overeenkomt met de acquisitietijd van twee beelden; presenteer elk stimulustype 25 keer, wat resulteert in de acquisitie van 50 beelden per stimulus en per proefpersoon.

De volgorde van presentatie van de condities moet zowel binnen als tussen de proefpersonen worden gerandomiseerd. Stel het experimentele paradigma daarnaast zo in dat het triggers van de scanner ontvangt. Dit zorgt ervoor dat de scannersoftware bij elke herhaling binnen de fMRI-sequentie een trigger naar de software voor auditieve presentatie stuurt, die op zijn beurt het scannummer registreert en het bijbehorende commando uitvoert.

Hier presenteren we een protocol dat specifiek is aangepast voor het gebruik van volwassen zebravinken. Zebravinken moeten worden gehuisvest in volières onder een fotoperiode van 12 uur licht en 12 uur donker, met ad libitum toegang tot voedsel en water gedurende de gehele studie. Het minimale aantal individuen per experiment is 15.

Dit getal houdt rekening met de gevoeligheid van spin-echo FMRI en de natuurlijke interindividuele variabiliteit van de biologische fenomenen die in het experiment worden gemeten. Ter voorbereiding op het experiment wordt eerst het snavelmasker met plastic slangetjes verbonden met het gasregelapparaat en op de MRI-tafel van een zeven T MR-systeem geplaatst. Open beide zuurstof- en stikstofflessen en schakel het gasregelapparaat in.

Schakel daarnaast het feedback-gestuurde systeem en het apparaat voor warme luchtstroom in. Anestheseer vervolgens de goudvink met 3% isofluraan in een mengsel van zuurstof en stikstof door de snavel in het masker te plaatsen en de kop vast te houden totdat de vogel volledig is geanestheseerd. Dit kan worden geverifieerd door zachtjes aan de poot te trekken.

Wanneer de vogel volledig gesedeerd is, zal de poot niet worden ingetrokken. Bovendien zullen de ogen van de vogel gesloten zijn. Plaats een cloacale temperatuursonde om de lichaamstemperatuur gedurende het experiment te controleren en plaats een pneumatische sensor onder de buik om de ademhalingsfrequentie te bewaken.

Plaats vervolgens een jasje om het lichaam van de vogel gedurende het hele experiment te fixeren. Houd de ademhalingsfrequentie tussen de 40 en 100 ademhalingen per minuut en houd de lichaamstemperatuur constant op 40 graden. Indien de ademhalingsfrequentie te laag of te hoog is, pas dan het niveau van de anesthesie dienovereenkomstig aan.

Als het probleem aanhoudt, moet het experiment worden gestopt en het dier uit de opstelling worden verwijderd. Om het herstel te bevorderen, worden niet-magnetische dynamische luidsprekers aan weerszijden van de kop van de zebravink geplaatst en verbonden met de versterker. Zorg ervoor dat de draden van de luidsprekers worden weggeleid van de temperatuursonde, omdat dit de temperatuurmeting kan beïnvloeden.

Plaats de oppervlakte-RF-spoel op de kop van de zebravisvink wanneer deze dichtbij genoeg is. Positioneer vervolgens de zebravisvink in het centrum van de magneet. Verlaag tot slot het anesthesieniveau naar 1,5%ISO fluor voordat u begint met scannen.

Om te beginnen met het scannen, moet eerst de positie van de hersenen in de magneet worden bepaald. Verwerf één set scout-beelden met een enkele gradiënt-echo-slice in de sagittale, horizontale en coronale vlakken, evenals multislice scout-beelden die vervolgens worden gebruikt voor de positionering van de functionele scans. Verminder daarna de ruis van de gradiënten door hun ramp-tijden te verhogen naar 1000 microseconds.

Bereid vervolgens een rapid acquisition relaxation enhanced, ook wel bekend als een rare T2-gewogen fMRI-sequentie, voor. Stel vervolgens 15 sagittale coupes in die bijna de gehele hersenen beslaan. Selecteer nu het auditieve protocol in de presentatiesoftware om ervoor te zorgen dat de auditieve presentatiesoftware geen enkele trigger van de scanner mist.

Start eerst het auditieve protocol. Zodra het protocol volledig is geladen, start u de fMRI-sequentie. Elk fMRI-experiment dient voorafgegaan te worden door de acquisitie van 10 dummy-beelden om het signaal een stabiele toestand te laten bereiken voordat de auditieve stimulatie begint.

Nadat de acquisitie is voltooid, wordt de data aangevuld tot 64 bij 64. Om de kwaliteit van de data te bepalen, wordt er een eerste blik geworpen op de resultaten met behulp van de functionele tool.

Bereken in de ParaVision-software de differentiële bold-respons tussen alle 'on'-blokken en de baseline. Als er geen activatie wordt waargenomen in de primaire auditieve gebieden, heeft de vogel de auditieve stimuli waarschijnlijk niet gehoord of verwerkt vanwege technische problemen of het anesthesieniveau. De opstelling moet worden gecontroleerd en de meting moet worden herhaald.

Voer na de functionele acquisitie een anatomische 3D T2-gewogen sequence uit in dezelfde oriëntatie als de voorgaande fMRI-scans. Vul deze gegevens vervolgens aan met nullen (zero-fill) tot 256 x 256 x 256.

Verwijder ten slotte de zebravingvink van de MRI-tafel en laat hem in een kooi onder een warmtelamp herstellen van de anesthesie. Normaal gesproken duurt het herstel van een zebravingvink na isofluraan-anesthesie minder dan vijf minuten. Na slechts enkele minuten zal de vogel proberen op te staan, en zodra de vogel volledig hersteld is, zal hij op een stok gaan zitten in plaats van op de bodem van de kooi, waarna de gegevensverwerking kan beginnen.

Zet eerst de MR-gegevens om naar analyze- of nifty-formaat. Voordat u vervolgens begint met de gegevensverwerking in SPM, is het noodzakelijk om de fMRI-gegevens van de zangvogel aan te passen door de voxelgrootte met 10 te vermenigvuldigen. Aangezien de fMRI-analyse-software is ontwikkeld voor het verwerken van fMRI-gegevens verkregen bij mensen, is de eenvoudigste manier om verder te gaan het kunstmatig vergroten van de voxelgrootte van de vogel-fMRI-gegevens met behulp van MRI Crow-software.

Let op dat deze aanpassing geen invloed heeft op de gegevens zelf. Er wordt geen re-sampling of enige andere modificatie van de gegevens toegepast. Vervolgens worden de verkregen gegevens voorbewerkt.

Gebruik SPM8 om eerst de fMRI-gegevens opnieuw uit te lijnen en de anatomische 3D-dataset te coregisteren aan de fMRI-tijdserie. Normaliseer vervolgens de 3D-gegevens en de gecoregisteerde fMRI-tijdserie naar de zebra-vinkbrein MRI-atlas.

Pas de transformatiematrix toe op de FMRI-dataset en maak de gegevens glad met een Gaussian kernel van 0,5 millimeter. Voer vervolgens een statistische voxelgebaseerde analyse uit in SPM eight, eerst op het niveau van de individuele vogels, gevolgd door een analyse op groepsniveau. Projecteer tenslotte de statistische parametrische kaart op de zebra-vinkatlas — de hogeresolutie 3D-atlas van de hersenen van de zebravink — om de resultaten te visualiseren en de functionele activaties te lokaliseren; de stereotactische coördinaten die zijn gebruikt in de beschreven analyse van de FMRI-resultaten van de zebravink zijn voor dit experiment ontworpen in het Bioimaging lab, de MRI-atlasdataset.

De afbakeningen van de hersenen en de nuclei zijn vrij beschikbaar via de hier getoonde website. Hier wordt een lateraal aanzicht getoond van een 3D-representatie van de linkerhemisfeer, met afgebakende structuren uit de atlas geprojecteerd op de midsagittale snede. Hier zien we een voorbeeld van een fMRI-BOLD-respons in het primaire auditieve gebied veld L, en aangrenzende secundaire auditieve gebieden opgewekt door verschillende auditieve stimuli vergeleken met de rustconditie.

T-waarden zijn kleurgecodeerd volgens de schaal in de figuur, en alleen voxels waarin de T-test significant was, worden weergegeven. Dit is een ander voorbeeld van een fMRI-experiment bij zebravinken. De beelden tonen selectieve responsen op de eigen zang van de vogel in de hersengebieden area XMLD en HVC.

De getallen onder de afbeeldingen geven de coördinaten in millimeters vanaf de middellijn aan. Het positieve teken geeft aan dat de coupes en statistische resultaten afkomstig zijn uit de rechterhemisfeer. Het in deze video beschreven protocol kan eenvoudig worden aangepast voor toepassingen bij andere zangvogels, zoals sporen.

Dit is een voorbeeld van de resultaten van een dergelijk fMRI-experiment. Bij een spreeuw toont de figuur activaties geïnduceerd door auditieve stimuli versus rust bij hetzelfde individu over verschillende seizoenen. De implementatie en optimalisatie van functionele MRI bij zangvogels openen nieuwe onderzoeksrichtingen binnen het vakgebied van het zangvogelonderzoek.

Het is reeds aangetoond dat dit een waardevolle techniek is voor de experimentele analyse van complexe sensorimotorische en cognitieve processen die ten grondslag liggen aan vocale communicatie in deze diermodellen. Daarnaast kan fMRI, dankzij de non-invasiviteit en de benadering van de gehele hersenen, worden ingezet als complementaire methode om veelgebruikte lokale en invasieve methoden aan te vullen. Het groeiende aantal fMRI-experimenten bij zangvogels demonstreert de toepasbaarheid voor cognitieve onderzoeksvragen; een toekomstige inspanning om MRI-experimenten verder uit te breiden voorbij auditieve verwerking — een proces dat actief blijft onder anesthesie — is het gebruik van wakker subjects die gewend zijn aan het beeldvormingsprotocol.

Dit zou nieuwe onderzoeksmogelijkheden kunnen bieden waarbij vogels actief kunnen deelnemen aan EMI-experimenten en waarbij de aandacht van de vogels experimenteel kan worden gecontroleerd.