Name: Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 52 s
Description: Leer de isolatie en karakterisatie van humane tandpulpstamcellen uit permanente tanden met twee methoden. Deze techniek helpt onderzoekers bij regeneratieve tandheelkunde en weefselengineering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij dankbaar erkennen Dr Leila Shakeri &amp; Dr Aref Dournaei voor hun kritische discus en de heer Mohammad Reza Khadem Sharif voor zijn technische ondersteuning.

1. Bereid de enzymoplossing en proliferatie Medium (PM) <ol><li> Merk Collagenase Type I oplossing: Weeg collagenase type I (12 mg / ml) en los op in 1 ml PBS en filter met een 0,2 urn spuitfilter. Plaats dan het 15 ml tube en bewaar deze bij -20 ° C totdat het nodig is. </li><li> Maak dispase Oplossing: Weeg dispase (16 mg / ml) en los op in 1 ml PBS en filter met behulp van een 0,2 micrometer spuitfilter. Plaats dan het 15 ml buis en houd het bij 4 ° C totdat het nodig is. </li><li> Merk enzymoplossing: Voeg 1 ml collagenase type I oplossingen (12 mg / ml) en 1 ml dispase oplossingen (16 mg / ml) in de 2 ml steriel PBS bevattende 100 mg / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine. Totale concentratie dispase en Collagenase I eindvolume moeten 4 mg / ml en 3 mg / ml, receptief zijn. Vervolgens aliquot dit volume in vier 15 ml buis, die elk 1 ml enzymoplossing. Elke buis kan worden gebruikt voor een pulp digestie. </li><li> Merk wasoplossing: Voeg 100 mg / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine in PBS. </li><li> Standaardcorrecties media: Alpha wijziging van Eagle&#39;s medium (α-MEM) aangevuld met 10% FBS en 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine. </li><li> Maken de verspreiding Media (PM): Alpha wijziging van medium Eagle&#39;s (α-MEM) aangevuld met 10% FBS, 100 uM L-ascorbinezuur 2-fosfaat, 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 0,25 mg / ml amfotericine B. </li><li> Merk odontogene media: Alpha wijziging van medium Eagle&#39;s (α-MEM) aangevuld met 10% FBS, 100 mM L-ascorbinezuur 2-fosfaat, 2 mM L-glutamine, 100 eenheden / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 0,01 uM dexamethason, 5 mM β-glycerolfosfaat, 1,8 mM Monokaliumfosfaat. </li></ol> 2. Bereid Human Dental Pulp weefsel voor Dental Pulp Stem Cell Isolation <ol><li> Normale menselijke derde molaren werden verzameld van volwassenen (21 tot 29 jaar) op de Dental Clinic van de Imam Ali onder goedgekeurde Institutional Review Board (IRB). </li><li> Tanden werden in het medium (α-MEM aangevuld met 10% FBS) en overgebracht naar het laboratorium bij 4 ° C. </li><li> Onder de steriele toestand, het werken binnen een biohazard laminaire stroming kap, set-up werd gedaan een 100 mm petrischaaltjes voor elke tand te verwerken. Tandoppervlakken werden gereinigd met 70% ethanol. </li><li> Tijdens het werken in een van de Petri-schalen, werd tand gehouden door tandheelkundige tang en een scalpel gebruikt om schoon te vuil en periodontale ligament op de wortels. </li><li> Cemento-emaille kruising werd langzaam gesneden met behulp van gesteriliseerde tandheelkundige disc naar de pulpakamer te onthullen. Bedacht moet worden dat snijproces moet langzaam worden uitgevoerd om verminderen oververhitting van het tandweefsel. </li><li> Pulp weefsel werd zachtjes gescheiden van de kroon en wortel. </li&gt; <li> Pulpa werd in kleine stukjes gesneden met behulp van een scalpel. </li></ol> 3. Human Dental Pulp Isolatie <ol><li> Pulp weefsel ondergingen ofwel enzymatische dissociatie van pulpa of directe cel uitgroei van pulp weefselexplantaten voor isolatie van hDPSCs. </li><li> Enzymatische dissociatie van pulpa: <ol><li> Stukjes pulp weefsels werden overgebracht naar enzymoplossing gedurende 1 uur bij 37 ° C. Vortex elke 30 minuten om te helpen breken weefsel. </li><li> Daarna werden grote celaggregaten verwijderd en Single-cell suspensies werden verkregen door het passeren van cellen door middel van een 70-uM cel zeef. </li><li> Eencellige suspensies werden gecentrifugeerd bij 1200 rpm gedurende 5 min bij kamertemperatuur. </li><li> Supernatanten werden voorzichtig afgepipetteerd en pellet werd geresuspendeerd in 1 ml proliferatie medium (PM). (Opmerking: FBS in proliferatie medium beëindigen enzymatische displayAssociation.) </li><li> Eencellige suspensies van dentale pulp werd uitgezaaid in 25 cm2 cultuur kolf met PM en vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C in 5% CO2. </li><li> Het kweekmedium werd elke drie dagen totdat de cel confluentie werd bereikt. </li></ol></li><li> Directe cel uitgroei van pulp weefselexplantaten: <ol><li> Pulpa werd gehakt in 1-2-fragmenten mm, en elk stuk werd in 25 cm2 cultuur flessen met PM en vervolgens geïncubeerd bij 37 ° C in 5% CO2. Bedacht moet worden dat de totale volume van de PM voor uitgroei van cel moet de bevestiging van pulp stukken voor verdere uitgroei cellen (2-3 ml per kolf) te ondersteunen. </li><li> Het medium werd gewijzigd nadat uitgroei werd waargenomen. </li><li> De ontgroeid cellen bij confluentie werden sub-gecultiveerd in een verhouding van 1:4 (passage 1). </li></ol></li></ol> 4. Immunofenotypering <ol><li> 250.000 cellen /tube van beide typen cellen in passage 3 werden geïncubeerd met PE of FITC-geconjugeerd anti-humane antilichamen met isotypen gedurende 30 min bij 4 ° C in een donkere plaats. (Opmerking:. De concentratie van antilichamen werd toegepast volgens de vervaardiging protocol) </li><li> Na de incubatie periode werd 100 pi PBS of FACS verdunningsoplossing toegevoegd aan elke buis en gecentrifugeerd bij 1200 rpm gedurende 5 min in een donkere plaats. </li><li> Supernatanten werden verwijderd en pellets werden geresuspendeerd in 100 ul PBS of FACS verdunning in donkere plaats. </li><li> Gerichte oppervlakte markers (CD markers) werden geëvalueerd door BD FACSCalibur. </li></ol> 5. Inductie van differentiatie van DPSC&#39;s in Gemineraliseerde Cells &amp; Gekwantificeerde Alizarinerood S Assay <ol><li> DPSC&#39;s die werden verkregen door enzymatische dissociatie van pulpa (bekend als DPSC-ED) of directe cel uitgroei van pulp weefselexplantaten (DPSC-OG) waren sub-gekweekte voor 3 gangen. </li><li> Eent Passage 3, werden de cellen zaad in een plaat met 6 putjes bij 5.000 cellen / putje. </li><li> Bij confluentie van 60% werden odontogene medium vervangen door conventionele PM. Drie putjes werden bleef als een negatieve controle door toevoeging van groeimedium. </li><li> Medium wissel alle 3 dagen tot dag 21. </li><li> Op dag 21 werden de cellen gewassen met PBS en werden vastgesteld bij 1 ml / putje 10% paraformaldehyde gedurende 15 min bij kamertemperatuur. </li><li> Daarna werd paraformaldehyde afgepipetteerd zorgvuldig en cellen werden 3 keer gewassen (5-10 min per keer) met gedestilleerd H 2 O. (Opmerking: Vermijd het verstoren van de monolaag.) </li><li> Na wassen werden 1 ml / putje Alizarinerood S toegevoegd gedurende 20 min bij kamertemperatuur. </li><li> Cellen werden gewassen met gedeïoniseerd H 2 O viermaal (5 min per keer met zacht schudden) om extra Alizarinerood verwijderen. </li><li> 1 ml / putje H 2 O werden toegevoegd aan de cellen niet uitdroogt. </li><li> De platen werden verondersteld visuele inspection en / of beeldopname. </li><li> Voor de kwantificering Alizarinerood S assay werden H 2 O vervangen door 1 ml 10% azijnzuur aan elk putje van 6-well plaat en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur onder schudden. </li><li> Vervolgens celmonolaag / putje waren schraap &amp; zowel azijnzuur en cellen overgebracht naar de afzonderlijke 1,5 ml micro-centrifugebuisjes. (Let op:. Elk putje moet de overdracht worden in een afzonderlijke buis dwz drie test putten en drie controleputjes voor elk ED &amp; OG groepen) </li><li> Buizen werden krachtig gevortext gedurende 30 sec. </li><li> Verwarm tot 85 ° C gedurende 10 minuten. (Opmerking: om verdamping te voorkomen, werden buizen afgesloten met parafilm.) </li><li> Na verwarmen, werden buizen overgebracht naar ijs gedurende 5 minuten. (Opmerking: Tubes mag pas worden geopend geworden afgekoeld.) </li><li> De suspensies werden gecentrifugeerd bij 20.000 x g gedurende 15 minuten. Tijdens centrifugeren werden Alizarinerood normen genomenup. </li></ol> Alizarinerood S standaard werden bereid door eerst verdunnen van de verdunningsbuffer en gebruikt om 2-voudige seriële verdunningen gebaseerd op de tabel. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="7"> High Range concentratie van de kleurstof </td><td colspan="7"> Laag bereik concentratie van de kleurstof </td></tr><tr><td> 2 mM </td><td> 1 mM </td><td> 500 uM </td><td> 250 uM </td><td> 125 uM </td><td> 62,5 uM </td><td> 31,3 uM </td><td> 15,6 uM </td><td> 7,8 uM </td><td> 3,9 uM </td><td> 1,9 uM </td><td> 0,9 uM </td><td> 0,4 uM </td><td> Blanco </td></tr></tbody></table><ol start="16"><li> Na het centrifugeren werden 1 ml supernatant / buis overgebracht naar nieuwe afzonderlijke 1,5 ml micro-centrifugebuisjes. </li><li> De pH werd geneutraliseerd met 375 pi 10 ~% Ammoniumhydroxide per buis. (Opmerking: pH woede moet 4,1-4.5.) </li><li> 150 ul standaard en monsters (inclusief afzonderlijke tests en controles) werden toegevoegd aan een ondoorzichtige wanden, transparante bodem 96-well plaat. </li><li> De absorptie werd afgelezen bij 405 nm en OD waarden werden vergeleken met standaard plot voor verdere analyse. </li></ol>

<ol><li>Volponi, A. A., Pang, Y., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+biological+tooth+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based biological tooth repair and regeneration.</a> Trends Cell Biol. 20, 715-722 (2010).</li>
<li>Nosrat, I. V., Widenfalk, J., Olson, L., Nosrat, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+cells+produce+neurotrophic+factors%2C+interact+with+trigeminal+neurons+in+vitro%2C+and+rescue+motoneurons+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dental pulp cells produce neurotrophic factors, interact with trigeminal neurons in vitro, and rescue motoneurons after spinal cord injury.</a> Dev. Biol. 238, 120-132 (2001).</li>
<li>Gandia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dental+pulp+stem+cells+improve+left+ventricular+function%2C+induce+angiogenesis%2C+and+reduce+infarct+size+in+rats+with+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human dental pulp stem cells improve left ventricular function, induce angiogenesis, and reduce infarct size in rats with acute myocardial infarction.</a> Stem Cells. 26, 638-645 (2008).</li>
<li>Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+human+dental+pulp+stem+cells+%28DPSCs%29+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A.%22%5BJournal%5D)">Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 97, 13625-13630 (2000).</li>
<li>Graziano, A., d'Aquino, R., Laino, G., Papaccio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells%3A+a+promising+tool+for+bone+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells: a promising tool for bone regeneration.</a> Stem Cell Rev. 4, 21-26 (2008).</li>
<li>Kerkis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+transplantation+of+human+immature+dental+pulp+stem+cells+from+baby+teeth+to+golden+retriever+muscular+dystrophy+%28GRMD%29+dogs%3A+Local+or+systemic%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Transl.+Med%22%5BJournal%5D)">Early transplantation of human immature dental pulp stem cells from baby teeth to golden retriever muscular dystrophy (GRMD) dogs: Local or systemic.</a> J. Transl. Med. 6, 35(2008).</li>
<li>Onyekwelu, O., Seppala, M., Zoupa, M., Cobourne, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tooth+development%3A+2.+Regenerating+teeth+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Dent.+Update%22%5BJournal%5D)">Tooth development: 2. Regenerating teeth in the laboratory.</a> Dent. Update. 34, 20-29 (2007).</li>
<li>Cordeiro, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+tissue+engineering+with+stem+cells+from+exfoliated+deciduous+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Endod%22%5BJournal%5D)">Dental pulp tissue engineering with stem cells from exfoliated deciduous teeth.</a> J. Endod. 34 (08), 962-969 (2008).</li>
<li>Pierdomenico, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+mesenchymal+stem+cells+with+immunosuppressive+activity+can+be+easily+isolated+from+dental+pulp%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Multipotent mesenchymal stem cells with immunosuppressive activity can be easily isolated from dental pulp.</a> Transplantation. 80, 836-842 (2005).</li>
<li>de Mendonca Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+large+cranial+defects+in+nonimmunosuppressed+experimental+design+with+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Craniofac.+Surg%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of large cranial defects in nonimmunosuppressed experimental design with human dental pulp stem cells.</a> J. Craniofac. Surg. 19, 204-210 (2008).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+identification%2C+characterization+and+banking+of+human+DPSCs%3A+current+strategies+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Methods for the identification, characterization and banking of human DPSCs: current strategies and perspectives.</a> Stem Cell Rev. 7, 608-615 (2011).</li>
<li>Tirino, V., Paino, F., De Rosa, A., Papaccio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+characterization%2C+and+banking+of+human+dental+pulp+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, characterization, and banking of human dental pulp stem cells.</a> Methods Mol. Biol. 879, 443-463 (2012).</li>
<li>Eslaminejad, M. B., Vahabi, S., Shariati, M., Nazarian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+Growth+and+Characterization+of+Stem+Cells+from+Human+Dental+Pulp+of+Deciduous+Versus+Permanent+Teeth%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+%28Tehran%29%22%5BJournal%5D)">In vitro Growth and Characterization of Stem Cells from Human Dental Pulp of Deciduous Versus Permanent Teeth.</a> J. Dent. (Tehran). 7, 185-195 (2010).</li>
<li>Wei, X., Ling, J., Wu, L., Liu, L., Xiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mineralization+markers+in+dental+pulp+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Endod%22%5BJournal%5D)">Expression of mineralization markers in dental pulp cells.</a> J. Endod. 33, 703-708 (2007).</li>
<li>Nombela-Arrieta, C., Ritz, J., Silberstein, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+elusive+nature+and+function+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The elusive nature and function of mesenchymal stem cells.</a> Nat. Rev. Mol Cell Biol. 12, 126-131 (2011).</li>
<li>Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+derived+from+dental+tissues+vs.+those+from+other+sources%3A+their+biology+and+role+in+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine.</a> J. Dent. Res. 88, 792-806 (2009).</li>
<li>Graziano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaffold%27s+surface+geometry+significantly+affects+human+stem+cell+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Scaffold's surface geometry significantly affects human stem cell bone tissue engineering.</a> J. Cell Physiol. 214, 166-172 (2008).</li>
<li>d'Aquino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dental+pulp+stem+cells%3A+from+biology+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Zool.+B.+Mol.+Dev.+Evol%22%5BJournal%5D)">Human dental pulp stem cells: from biology to clinical applications.</a> J. Exp. Zool. B. Mol. Dev. Evol. 312, 408-415 (2009).</li>
<li>Mitsiadis, T. A., Feki, A., Papaccio, G., Caton, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells%2C+niches%2C+and+notch+signaling+in+tooth+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Dent.+Res%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells, niches, and notch signaling in tooth injury.</a> Adv. Dent. Res. 23, 275-279 (2011).</li>
<li>Shi, S., Gronthos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perivascular+niche+of+postnatal+mesenchymal+stem+cells+in+human+bone+marrow+and+dental+pulp%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bone+Miner.+Res%22%5BJournal%5D)">Perivascular niche of postnatal mesenchymal stem cells in human bone marrow and dental pulp.</a> J. Bone Miner. Res. 18, 696-704 (2003).</li>
<li>Tomic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomodulatory+properties+of+mesenchymal+stem+cells+derived+from+dental+pulp+and+dental+follicle+are+susceptible+to+activation+by+toll-like+receptor+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells derived from dental pulp and dental follicle are susceptible to activation by toll-like receptor agonists.</a> Stem Cells Dev. 20, 695-708 (2011).</li>
<li>Tsukamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mineralized+nodule+formation+by+cultures+of+human+dental+pulp-derived+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Mineralized nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts.</a> Arch. Oral Biol. 37, 1045-1055 (1992).</li>
<li>About, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+dentin+production+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human dentin production in vitro.</a> Exp. Cell Res. 258, 33-41 (2000).</li>
<li>Couble, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odontoblast+differentiation+of+human+dental+pulp+cells+in+explant+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif.+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Odontoblast differentiation of human dental pulp cells in explant cultures.</a> Calcif. Tissue Int. 66, 129-138 (2000).</li>
<li>Onishi, T., Kinoshita, S., Shintani, S., Sobue, S., Ooshima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+proliferation+and+differentiation+of+dog+dental+pulp+cells+in+serum-free+culture+medium+by+insulin-like+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral+Biol%22%5BJournal%5D)">Stimulation of proliferation and differentiation of dog dental pulp cells in serum-free culture medium by insulin-like growth factor.</a> Arch. Oral Biol. 44 (99), 361-371 (1999).</li>
<li>Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+human+dental+pulp+cells%3A+various+isolation+methods+and+culturing+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments.</a> Cell Tissue Res. 324, 225-236 (2006).</li>
<li>Bakopoulou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+the+impact+of+two+different+isolation+methods+on+the+osteo%2Fodontogenic+differentiation+potential+of+human+dental+stem+cells+derived+from+deciduous+teeth%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif.+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Assessment of the impact of two different isolation methods on the osteo/odontogenic differentiation potential of human dental stem cells derived from deciduous teeth.</a> Calcif. Tissue Int. 88, 130-141 (2011).</li>
<li>Curtis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EF1alpha+and+RPL13a+represent+normalization+genes+suitable+for+RT-qPCR+analysis+of+bone+marrow+derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">EF1alpha and RPL13a represent normalization genes suitable for RT-qPCR analysis of bone marrow derived mesenchymal stem cells.</a> BMC Mol. Biol. 11, 61(2010).</li>
<li>Suchanek, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dental+pulp+stem+cells+and+their+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pap.+Med.+Fac.+Univ.+Palacky+Olomouc+Czech+Repub%22%5BJournal%5D)">Dental pulp stem cells and their characterization.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 153, 31-35 (2009).</li>
<li>d'Aquino, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+postnatal+dental+pulp+cells+co-differentiate+into+osteoblasts+and+endotheliocytes%3A+a+pivotal+synergy+leading+to+adult+bone+tissue+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Human postnatal dental pulp cells co-differentiate into osteoblasts and endotheliocytes: a pivotal synergy leading to adult bone tissue formation.</a> Cell Death Differ. 14, 1162-1171 (2007).</li>
<li>Atari, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pluripotent+stem+cells+from+human+third+molar+dental+pulp%5BTitle%5D)+AND+%22Histol.+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Isolation of pluripotent stem cells from human third molar dental pulp.</a> Histol. Histopathol. 26, 1057-1070 (2011).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Dit protocol beschrijft het proces van isolatie en karakterisering van hDPSCs van tandheelkundige pulp met behulp van twee methoden, enzymatische dissociatie en directe uitgroei van stamcellen uit pulp weefselexplantaten. Bovendien in vitro differentiatie van deze cellen naar odontoblasts, werd bepaald door kwantitatieve assay Alizarinerood S &amp; QPCR. Bestaande protocollen voor het isoleren van pulp weefsel van menselijke tand werd gebruik gemaakt van verschillende instrumenten z...

Stamcellen zijn cellen die klonogene twee opmerkelijke eigenschappen, bekend als multi-potentie en zelfvernieuwing 15 bezitten. Van alle stamcellen met verschillende replicatieve vermogens, hebben tandheelkundige stamcellen als postnatale stamcellen gewezen laatste jaren vanwege hun toegankelijkheid, plasticiteit en hoge proliferatieve vermogen in vergelijking met andere volwassen stamcellen 16. Kenmerkend vergelijkbaar met de mesenchymale stamcellen, dentale pulp stamcellen zijn hechtende klonogene cellen die meerdere differentiatiecapaciteit in mesenchym en / of niet-mesenchym lineages, zowel in vitro als in vivo. 1-8,17,18 DPSC&#39;s worden geïdentificeerd door hun negatieve uitdrukking van hematopoietische antigenen (bijv. CD45, CD34, CD14), en positieve uitdrukking van CD90, CD29, CD73, CD105, CD44 en STRO-1. 19,20 Gemakkelijk verkregen potentieel met een minimum aan pijn en ziekte te maken menselijke DPSC&#39;s als een waardevollekunnen bron van MSCs in vergelijking met de gewone bronnen, zoals beenmerg mesenchymale stamcellen 21. In het algemeen zijn DPSC&#39;s zijn geïsoleerd door een uitwas werkwijze, dwz migratie van stamcellen uit pulp weefselexplantaten (DPSC-OG) 22-24, en / of door enzymatische digestie (DPSC-ED) 4,6,25. Eerdere studies hebben aangetoond dat de isolatiemethode en kweekomstandigheden kunnen verschillende populaties of geslachten er onvoldoende in vitro passages 26,27. In geval van blijvende tanden (pDPSCs), Huang et al. toonde aan dat enzymatische digestie pDPSCs hogere proliferatie potentie vergeleken met de ontgroeid DPSC&#39;s. 26 Bovendien, in het geval van melktanden (dDPSCs), werd aangetoond dat STRO-1 en CD34 markers, uitgedrukt in dDPSC-ED in vergelijking met dDPSC-OG. Bovendien dDPSC-ED weergegeven hogere mineralisatie in bepaalde osteo / odonto medium. 27 Derhalve dankzij de uitstekende mogelijkheden van DPSC&#39;s in regenerative geneeskunde, meer studies nodig voor een beter begrip van mogelijke verschillende populaties die zijn afgeleid van verschillende isolatiemethoden. Hier was poging makkelijke manier pulp extractie voeren, met eentraps tandheelkundige diamantschijf de pulp extractie te vergemakkelijken. Bovendien, na isolatie van humane pulp-stamcellen door toepassing of ED OG werkwijzen werden algemene eigenschappen en differentiatiecapaciteit tussen twee groepen onderzocht.

<table border="1"><tbody><tr><td> Naam van het reagens </td><td> Vennootschap </td><td> Catalogus of Lot. aantal </td><td> Opmerkingen (optioneel) </td></tr><tr><td> α-MEM </td><td> GIBCO </td><td> 11900-073 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase type I </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C0130-100MG </td><td></td></tr><tr><td> Dispase </td><td> GIBCO </td><td> 17105-041 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilline / streptomycine </td><td> GIBCO </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> Amfotericine B </td><td> GIBCO </td><td> 15290-018 </td><td></td></tr><tr><td> Foetaal runderserum gedefinieerde (FBS) </td><td> HyClone </td><td> SH30070.03 </td><td></td></tr><tr><td> L-ascorbinezuur 2-fosfaat </td><td> Sigma </td><td> A8960-5G </td><td></td></tr><tr><td> L-glutamine </td><td> GIBCO </td><td> 25030-024 </td><td></td></tr><tr><td> Dexamethason </td><td> Sigma </td><td> D4902 </td><td></td></tr><tr><td> β-Glycerol fosfaat dinatriumzout hydrateren, BioUltra </td><td> Sigma </td><td> G9422-100G </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumfosfaat monobasisch </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Osteogenesis Assay Kit </td><td> Millipore </td><td> PS01802031 </td><td></td></tr><tr><td> Muis IgG2b-PE isotype control </td><td> BD Pharmingen </td><td> 50808088029 </td><td></td></tr><tr><td> FITC muis IgG2b isotype control </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559532 </td><td></td></tr><tr><td> FITC muis IgG1 κ isotype </td><td> BD Pharmingen </td><td> 11471471 </td><td></td></tr><tr><td> FITC / PE muis anti-humaan CD34/CD45 </td><td> BD Pharmingen </td><td>341071 </td><td></td></tr><tr><td> PE anti-humaan CD146 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550315 </td><td></td></tr><tr><td> Monoklonale muis anti-humaan CD90/FITC </td><td> Daka </td><td> 00034418 </td><td></td></tr><tr><td> PE muis anti-humaan CD73 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 550257 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-h CD105/Endoglin PE </td><td> BD Pharmingen </td><td> FAB10971P </td><td></td></tr><tr><td> PE muis anti-humaan CD11b/Mac1 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 5553888 </td><td></td></tr><tr><td> CD44 PE muis anti menselijke </td><td> BD Pharmingen </td><td> 555479 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfaatbufferoplossing (PBS) </td><td> GIBCO </td><td> 003000 </td><td></td></tr><tr><td> 70-um celzeef </td><td> Valk </td><td> 352360 </td><td></td></tr><tr><td&gt; 0,2 urn spuitfilter </td><td> Millex-GV </td><td> SLGV033RB </td><td></td></tr><tr><td> 25 cm 2 cultuur fles </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Z707481 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> APPARATUUR </td></tr><tr><td> BD FACSCalibur </td><td> BD </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Multiskan microplaat spectrofotometer </td><td> Thermo Scientific </td><td> 51119200 </td><td></td></tr><tr><td> Fleurcense Microscoop </td><td> Olympus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vloeiende Software versie 2.3.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane dental pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

<p class="jove_content"&gt; Ontwikkeling verstandskiezen zijn gemakkelijk toegankelijke bron van stamcellen in de volwassenheid die kunnen worden verkregen door routine orthodontische behandeling. Human pulp-afgeleide stamcellen (hDPSCs) bezit zijn van hoge proliferatie potentieel met multi-lijn differentiatie capaciteit te vergelijken met de gewone bron van volwassen stamcellen<sup&gt; 1 tot 8</sup&gt;, Daarom hDPSCs zou kunnen zijn van de goede kandidaten voor autologe transplantatie in de tissue engineering en regeneratieve geneeskunde. Naast deze voordelen, bezit de mesenchymale stamcellen (MSC) functies, zoals immunolodulatory effect maken hDPSCs waardevoller, zelfs bij allograft transplantatie<sup&gt; 6,9,10</sup&gt;. Daarom is de eerste stap voor het gebruik van deze bron van stamcellen is het selecteren van de beste protocol voor het isoleren van hDPSCs pulpa. Om dit doel te bereiken, is het cruciaal om het effect van verschillende isolatie omstandigheden onderzoeken op verschillende cellulaire gedrag, zoals hun gemeenschappelijke oppervlaktemerkers en ook de differentiatiecapaciteit.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Zo, hier zijn we scheiden de menselijke pulpa van invloed derde molaar tanden, en vervolgens gebruikt zowel bestaande protocollen gebaseerd op literatuur, voor het isoleren van hDPSCs,<sup&gt; 11 tot 13</sup&gt;<em&gt; Dat wil zeggen</em&gt; Enzymatische dissociatie van pulpa (DPSC-ED) of uitgroei van weefselexplantaten (DPSC-OG). In dit gebied, hebben we geprobeerd om het isolement van methoden met behulp van tandheelkundige diamant schijf. Dan deze cellen gekarakteriseerd in termen van stroma-geassocieerde merkers (CD73, CD90, CD105 en CD44), hematopoëtische / endotheliale Markers (CD34, CD45 en CD11b), perivasculaire marker, zoals CD146 en STRO-1. Daarna werden deze twee protocollen vergeleken op basis van de differentiatie in potentie odontoblasts van kwantitatieve polymerase ketenreactie (QPCR) en Alizarin kleuring. QPCR werden gebruikt voor de beoordeling van de expressie van de mineralisatie-gerelateerde genen (alkalische fosfatase, ALP, extracellulaire matrix phosphoglycoprotein; MEPE en dentine sialophosphoprotein; DSPP).<sup&gt; 14</sup</p

<ol><li> DPSC&#39;s die zijn verkregen door enzymatische dissociatie (DPSC-ED) hier op dag 10, 15,18 (Figuur 1). Kolonies opgestart om op bijna 3 tot 5 dagen na de isolatie vormen. </li><li> Ontgroeid DPSC&#39;s (DPSC-OG) zijn weergegeven in Figuur 2 op dag 5, 10, 13 en 18. Fibroblastachtige cellen begon te migreren van pulp weefsel in de kolf parallel bestellen met bijna 5 dagen na uitzaaien. </li><li> DPSC&#39;s bij passage 3 met beide methoden zijn weergegeven in figuur 3. Beide DPSC&#39;s b...

De werkwijze beschreven isolatie en karakterisering van menselijke pulpa stamcellen (hDPSCs) door ofwel<strong&gt; Enzymatische dissociatie van pulp (DPSC-ED)</strong&gt; Of<strong&gt; Directe uitgroei van stamcellen uit pulp weefselexplantaten (DPSC-OG). Gevolgd door</strong&gt;<em&gt; In vitro</em&gt; Vergelijkende differentiatie van beide soorten hDPSCs in odontoblasts.

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Ontwikkelende verstandskiezen zijn een gemakkelijk toegankelijke bron van stamcellen tijdens de volwassenheid, die verkregen kunnen worden via routinematige orthodontische behandelingen. Humane ...

Het algemene doel van deze procedure is om menselijke pulpa-stamcellen uit permanente tanden te isoleren, te karakteriseren en te differentiëren met behulp van twee methoden. Dit wordt bereikt door gezonde, geïmpacte verstandskiezen te verzamelen en deze in eerste instantie door te snijden ter hoogte van de grens tussen cementum en glazuur. Dentale pulpa-stamcellen (DPSCs) worden geïsoleerd via twee verschillende methoden.In de eerste methode worden polypweefsels enzymatisch verteerd door incubatie in collagenase type one plus disc space solution. Deze noemen we hier ed. Wat betreft de isolatiemethode in de tweede methode, worden polypweefsels enkel in de kolf geplaatst zonder enige digestie.Op deze manier beginnen dpss vanuit het weefsel naar de kolf te migreren. Deze cellen, aangeduid als OG, verwijzen naar de outgrowth-isolatiemethode. De tweede stap van de procedure is de identificatie van stamcellen met behulp van flowcytometrie.De derde stap van de procedure is de inductie van odontoblastdifferentiatie, en de laatste stap van de procedure is de vergelijkende evaluatie van de odontoblastdifferentiatie tussen twee groepen middels Alizarine R-kleuring en qPCR. Ik ben RA Kde van

isolation-characterization-comparative-differentiation-human-dental

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Dit protocol beschrijft de voorbijgaande genetische manipulatie van tandheelkundige stamcellen gewonnen uit de menselijke tandheelkundige follikel. De toegepaste niet-virale wijziging strategie kan een basis voor de verbetering van de cel van de stam van de therapeutische producten geworden.

Isolatie, karakterisering en MicroRNA gebaseerde genetische modificatie van stamcellen van menselijke tandheelkundige follikel

Hier presenteren we een protocol voor menselijke tandheelkundige Pulp stamcellen isolatie en vermeerdering teneinde het prion-eiwit expressie tijdens neuronale differentiatie.

Isolatie, vermeerdering en Prion eiwituitdrukking tijdens neuronale differentiatie van stamcellen van menselijke tandmerg

Dit protocol presenteert een vergelijking tussen twee verschillende inductieprotocollen voor het differentiëren van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen (hDPSC's) naar pancreaslijnen in vitro:het integratieve protocol en het niet-integratieve protocol. Het integratieve protocol genereert meer insulineproducerende cellen (IPC's).

In vitro Inductie van menselijke tandheelkundige pulpstamcellen naar pancreaslijnen

Het huidige protocol presenteert een snelle, efficiënte en zachte methode voor het isoleren van enkele cellen die geschikt zijn voor eencellige RNA-seq-analyse van een continu groeiende muizensnijtand, muizenkies en menselijke tanden.

Snelle isolatie van afzonderlijke cellen van muizen en menselijke tanden

Dit artikel biedt een stapsgewijze handleiding voor het opzetten van een primaire cultuur van stamcellen van tandpulp met behulp van de explantatiecultuurmethode en karakterisering van deze cellen op basis van ICSCRT-richtlijnen. De cellen die door dit protocol worden geïsoleerd, kunnen worden beschouwd als mesenchymale stamcellen voor verdere toepassingen.

Primaire cultuur van stamcellen van tandpulpa

Dit protocol legt de nadruk op de extractie, kweek en conservering van multipotente stamcellen uit tandpulp door middel van enzymatische vergisting. Bovendien toont het hun potentieel aan om te differentiëren in osteoblasten, adipocyten en chondrocyten, wat het belang van precisie en consistentie in het proces benadrukt.

Isolatie, cultuur en karakterisering van stamcellen van tandpulp uit menselijke loof- en permanente tanden

Dit artikel beschrijft de bereiding van vers verkregen melanoomweefsel in primaire celculturen en hoe verontreinigingen van erytrocyten en fibroblasten uit de tumorcellen. Tot slot beschrijven we hoe...

Patiënt Derived Cell Cultuur en isolatie van CD133<sup&gt; +</sup&gt; Vermeende Cancer Stem Cells van Melanoom

Huidige kennis over de cellulaire basis van hartziektes vertrouwt vooral op studies op diermodellen. Hier beschrijven we en validatie van een nieuwe methode om enkele levensvatbare hartspiercellen te verkrijgen van kleine chirurgische monsters van menselijk ventriculair myocard. Menselijke hartspiercellen en kan worden gebruikt voor elektrofysiologische studies en drugstesten.

Isolatie en functionele karakterisering van Human ventriculaire cardiomyocyten van Fresh Chirurgische Samples

De isolatie van kankerstamcellen (KSC) rechtstreeks van menselijke weefsels is voorwaarde voor hun biologische karakterisering. Dit manuscript beschrijft een methode voor de isolatie van prostaat CSC van menselijk weefsel, terwijl ook het verstrekken van tips over het oplossen van moeilijke stappen.

Isolatie van kanker stamcellen uit menselijke stalen van prostaatkanker

Oprichting primaire endometrium stromale celkweek systemen van hysterectomie exemplaren is een waardevolle biologische techniek en een cruciale stap voorafgaand aan het nastreven van een breed scala van onderzoek wil. We beschrijven hier twee methoden om stroma culturen chirurgisch weggesneden endometriale weefsel van menselijke patiënten vastgesteld.

Twee methoden voor het vaststellen van primaire humane Endometriale Stromal Cellen uit hysterectomie Exemplaren

Leer de isolatie en karakterisatie van humane tandpulpstamcellen uit permanente tanden met twee methoden. Deze techniek helpt onderzoekers bij regeneratieve tandheelkunde en weefselengineering.

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden (Video) | JoVE Journal

Isolatie, karakterisering en vergelijkende differentiatie van humane Dental Pulp stamcellen uit permanente tanden met behulp van twee verschillende methoden

Meer video's verkennen