Chirurgische ingrepen voor een Rat Model van deelspoelen orthotope levertransplantatie met hepatische arteriële reconstructie

Het algemene doel van deze procedure is het uitvoeren van een partiële orthotope levertransplantatie bij ratten als een reproduceerbaar experimenteel model voor transplantatieonderzoek. Dit wordt bereikt door eerst de lever uit de donorrat te explanteren. De tweede stap is de ex vivo preparatie van het levertransplantaat, inclusief een leverresectie van 50%.

Vervolgens wordt de eigen lever van de ontvangende rat verwijderd. De laatste stap is de implantatie van het partiële levertransplantaat in de ontvangende rat. Ten slotte worden de serumalanine-aminotransferasewaarden gemeten om de hepatocellulaire schade aan het levertransplantaat na transplantatie te beoordelen.

Over het algemeen hebben personen die nieuw zijn met deze procedure moeite vanwege de complexiteit die geavanceerde microchirurgische vaardigheden vereist. Om met deze procedure te beginnen, plaatst u de geanestheseerde donorrat op een warmtemat nadat u via een knijptest bij de teen heeft bevestigd dat het dier volledig is geanestheseerd; fixeert u vervolgens de bovenarmen met behulp van het magnetische fixatiesysteem voor retractie. Scheer de vacht van het gehele buikgebied van de rat en steriliseer de betreffende huid met een povidonjodiumoplossing.

Open de buikholte via een mediane incisie met bilaterale extensies. Plaats een spuit van 5 ml onder de rug van de rat zodat de vena cava suprahepatica ventraal wordt opgetild met behulp van een mosquito-klem; trek dit geheel richting de kop en breng subcostale retractoren aan om het operatieveld te openen. Vanwege de noodzaak om de retractoren en de spuit van 5 ml tijdens de procedure frequent te manipuleren, worden er geen chirurgische doeken rond de incisie gebruikt. Dissekeer, onder een chirurgische microscoop bij een 16 x vergroting, het ligamentum falciforme en het linker ligamentum triangulare en klem de linker vena phrenica door; trek de mediane en linker laterale lobben omhoog met een nat gaasje.

Coaguleer en verdeel de para-oesofagele vaten tussen de linker laterale en de anteriore coördinatenlob met bipolaire pincetten. Verplaats de darmen buiten de buikholte naar de linkerzijde van de rat en dek deze af met een nat gaasje. Retracteer de rechter laterale lob naar boven met een nat gaasje.

Isoleer de infrahepatische vena cava uit het retroperitoneale weefsel en ligatureer de rechter bijniervene, die later vlak voor de verwijdering van het transplantaat zal worden doorgesneden om een stent in de galgang in te brengen; ligatureer eerst de galgang op het niveau van de vertakking van de arteria gastroduodenalis. Maak een kleine incisie in de voorwand van de galgang proximaal van het ligatiepunt en gebruik vervolgens een gebogen micropincet in de rechterhand om een stent in de gang in te brengen, terwijl de voorwand van de incisie met een rechte micropincet in de linkerhand wordt vastgehouden. Fixeer deze met een 6-0 zijden draad.

Houd een van de afgeknipten uiteinden van de hechtdraad aan de galgang op een lengte van vier millimeter, zodat de draad tijdens de latere anastomose vastgehouden kan worden. Maak de vena portae vrij van de venae mesenterica superior en lienis door deze af te binden en door te snijden; bind de arteria gastroduodenalis af en snijd deze door. Isoleer vervolgens de arteria hepatica communis vanaf de pancreaskop tot aan de oorsprong.

Draai de lever met wattenstaafjes naar rechts en ontleed het ligament rond de achterzijde van de lever en de slokdarm zodra de voorbereidingen voltooid zijn. Voor de excisie van de lever: verwijder de retracteurs, de muggenklemmen bij het xiphoïd-proces en de spuit van vijf milliliter onder de rug van de rat.

Plaats de darmen terug in de buikholte. Injecteer 500 IU heparinenatrium in twee milliliter normale zoutoplossing via de penielvene. Na ongeveer drie minuten worden de vijf milliliter spuit, de muggenklem en de retractor verwijderd en wordt de arteria hepatica communis proximaal van de oorsprong afgebonden.

Houd een van de afgesneden uiteinden van de draad geligeerd voor de arteria hepatica communis. Klem de vena cava infrahepatisch, dicht bij de vena renalis dextra, met een mosquito-klem.

Klem de poortader af met een wegwerpklamp voor microvaten onder de stomp van de miltader. Incideer de voorwand van de poortader en voeg een 18 gauge katheter in de poortader in. Perfuseer de lever in situ met 60 milliliters koude histidine-tryptofaan-ketoglutaraatoplossing.

Bij een hydrostatische druk van 20 centimeter worden het diafragma, de vena cava intrathoracica en de voorwand van de vena cava infrahepatica onmiddellijk geopend om de perfusie-oplossing uit de lever te spoelen. Klem de vena cava infrahepatica af met een microvatklem net onder de lever. Exciteer de lever door de vena cava infrahepatica te dissekeren.

De poortader, het diafragma, de overige ligamenten, de rechter bijnierader en de arteria hepatica communis. Plaats de geëxciteerde lever in een metalen beker met koude HTK-oplossing, gemonteerd in een plastic bak gevuld met geknoten ijs. Procedures voor het levertransplantaat worden uitgevoerd in de metalen beker gevuld met ijskoude HTK-oplossing; voor het bevestigen van een manchet aan de poortader wordt de poortaderstam afgeklemd met een DeBakey bulldog-klem, waarbij de klem in een overbruggingspositie over de beker wordt geplaatst.

Plaats de poortader door de manchet en klem de al-ader opnieuw samen met de verlenging van de manchet op de 12-uurspositie, vouw de wand van de poortader over de manchet om de stomp van de miltader buiten de manchet op de 7-uurspositie te positioneren en zet de poortader vast met een 6-0 zijden draad om een stent in de leverarterie in te brengen. Fixeer de lever door beide randen van het diafragma met pincetten te klemmen en trek de gemeenschappelijke leverarterie recht door de geligeerde draad vast te houden met de DeBakey bulldog-klem en een rechte microschaar. Maak met de linkerhand een kleine incisie in de voorwand van de gemeenschappelijke leverarterie.

Houd de voorwand van de incisie vast met een rechte micropincet en voer met de rechterhand een stent in de arteria hepatica communis in. Bevestig de stent met een 6-0 zijden draad met behulp van een gebogen micropincet en laat één van de afgeknipten uiteinden van de draad vier millimeter lang. Spoel de lever via de arteriële katheter met 5 mL koude HTK-oplossing voor de 50% leverresectie.

Klem eerst de posterieure coördinaatlob met een muggenpen om deze op zijn plaats te fixeren. Ligeeer vervolgens de pedikel met een 4-0 zijden draad en resecteer de lob.

De anteriore corate lob wordt op dezelfde manier verwijderd. Draai vervolgens de plastic doos 90 graden. Klem de rechterrand van het diafragma en het linkergedeelte van de mediane lob vast.

Maak een kleine incisie aan de bovenrand van de grens van de bilaterale delen van de mediale lob en verwijder vervolgens het linker gedeelte na ligatie. Na ligatie van de pedikel met een vier-nul zijden hechtdraad, verwijdert u de linker laterale lob en cauteriseert u het geresecteerde leveroppervlak zorgvuldig met bipolaire pincetten. De levermassa is nu met ongeveer 50% verminderd voor plasty van de vena cava suprahepatica.

Fixeer eerst de positie van de lever door beide randen van het diafragma vast te klemmen met een muggenklem. Trim vervolgens de voorwand van de vena cava suprahepatica door het bijbehorende diafragma te verwijderen. Bevestig 2 7 0 polypropyleen hechtingen van buiten naar binnen in beide hoeken als houdehechtingen voor de latere anastomose.

Trim daarna de achterwand van de vena cava suprahepatica. Bewaar het levertransplantaat op vier graden Celsius in HTK-oplossing in een koudwaterbad. Bereid de ontvanger op soortgelijke wijze voor op de operatie als bij de donoroperatie en open het abdomen via een middenlijnincisie.

Plaats een nat gaasje over de rechterkant van het duodenum en de gehele darmen. Om een chirurgisch veld rond de vena cava infrahepatisch te verkrijgen, worden de linker laterale en mediane lobben in de linker subfrenische holte gelegd en wordt de rechter laterale lob met een nat gaasje naar boven getrokken.

Isoleer de vena cava infrahepatica van het retroperitoneale weefsel en scheid de rechter bijniervene met vochtig gaas en wattenstaafjes. Roteer de lever naar links en disseceer het ligament rond de achterzijde van de lever. Transecteer de galgang net onder de aftakking van het caudale lob.

Houd één van de afgeknoopte uiteinden van de draad vast voor de gallgang van vier millimeter lang. Ligeer en deel de arteria gastroduodenalis en de arteria hepatica propria op een afstand van drie millimeter van de vertakking vanuit de arteria hepatica communis om een brede arteriële structuur aan het uiteinde van de arteria hepatica communis te creëren. Klem de vena cava infrahepatica af met een metalen microvaatklem net boven de vena renalis dextra en de poortader op het niveau van de bifurcatie in de leverhilus met een mosquito-klem. Klem de vena cava suprahepatica samen met het diafragma af met een perifere vaatklem en fixeer de klem in een klomp oliehoudende klei. Reduceer de anesthesie met isofluraan naar 0,4 volume-procent. Verwijder de recipientenlever door de vena cava suprahepatica te ontleden op de grens tussen de vena cava suprahepatica en de lever.

De poortader net boven de bek van de muggentang en de vena cava infrahepatisch iets onder het middenpunt tussen de lever en de rechter nieraorta. Plaats het levertransplantaat orthotoop. De reconstructie van de vaten is het moeilijkste en belangrijkste onderdeel van deze procedure.

Dit moet zeer zorgvuldig maar snel worden uitgevoerd voor de anastomose van de suprahepatische vena cava met een doorlopende hechting. Plaats de eerste fixatiehechting in de suprahepatische vena cava van de ontvanger van binnen naar buiten met de bijgevoegde 7-0 polypropyleenhechtdraad in de rechterhoek van het transplantaat, gevolgd door het knopen ervan op dezelfde wijze. Plaats de tweede fixatiehechting in de linkerhoek.

Dit zal de beginsteek zijn van een doorlopende hechting. Om de anastomose te verbreden, worden de hechtingen in beide hoeken vastgegrepen en vastgehouden met DeBakey bulldogklemmen, waarbij een lichte tractie superieur lateraal wordt uitgeoefend. Doorboor vervolgens de hechting in de linkerhoek door de wand aan de zijde van het transplantaat, van buiten naar binnen, vlakbij de knoop aan de buitenkant, en hecht de posterieure rij van de satic vena caver intraluminaal met zeven tot acht steken naar de rechterhoek.

Zet de eerste paar hechtingen zorgvuldig, zodat de binnenste lumina in de juiste hoek tegenover elkaar staan. Steek de zeven nul polypropyleenhechtdraad vanuit de graftzijde door het vat naar buiten. Hecht de voorste rij van buitenaf van rechts naar links met ongeveer 10 hechtingen.

Spoel de binnenzijde door met lactaatringeroplossing. Om luchtbellen te verwijderen, wordt de laatste hechting vlakbij de steunhechting geplaatst, waarna deze samen worden aangetrokken. Voor de reconstructie van de poortader wordt de poortader afgeklemd met een microvatklem en wordt de muggenklem in de klei gefixeerd. Maak vervolgens een incisie in de voorwand van de poortader, net onder de kaken van de muggenklem.

Spoel de binnenkant van de ontvangende poortader en de cuff schoon met lactaat-Ringeroplossing. Plaats de cuff in de poortader en zet deze vast met een circumferentiële zijden hechtdraad van maat 6-0. Herperfuseer tot slot de lever.

Verwijder de spuit van vijf milliliter uit de rug van de rat en verhoog de concentratie isofluraan naar 0,8 volumeprocent voor de reconstructie van de lever door middel van een stenttechniek. Houd eerst de draad van de arteria hepatica propria vast met mosquito-klemmen en fixeer deze in de klei. Klem vervolgens de ontvangende arteria hepatica communis af.

Maak een kleine incisie in de vertakking van de Y-structuur aan het uiteinde van de arteria hepatica communis om een trechtervormige opening te creëren. Houd de stent die in de arteria hepatica communis van het transplantaat is geplaatst vast met een gebogen micropincet. Schuif de stent in de arteria hepatica communis van de ontvanger en zet deze vast met een zijden hechtdraad van zes nul. Knoop één uiteinde van dit draad en de draad van vier millimeter op de arteria hepatica communis van het transplantaat samen, zodat beide arteriae hepaticae communes dichter bij elkaar komen te liggen met een verminderde spanning op de anastomotische plaats.

Laat daarna de klem voor de anastomose van de infrahepatische vena cava los door middel van een continue hechting, op dezelfde wijze als bij de suprahepatische vena cava, maar gebruik meer hechtingen met fijnere steken. Verhoog na het verwijderen van de klem de concentratie van het anesthesicum naar 1,0 volume procent voor de reconstructie van de galgang. Houd de draad van de galgang van de ontvanger vast met een mosquito-klem en fixeer deze in de klei.

Maak een kleine incisie in de galgang op het juiste niveau, zodat de gereconstrueerde galgang niet te lang wordt. Plaats de stent en zet deze vast met een zes-nul zijden hechtdraad. Knoop deze draad samen met de draad van het transplantaatkanaal.

Alle reconstructieprocedures zijn nu voltooid. Sluit de abdominale incisie in lagen met continue 4-0 Vicryl-hechtingen. Behandel de ontvangende rat direct na de operatie met een subcutane injectie van sphero sodium en buprenorfine in een totaal van 1,5 milliliters normale zoutoplossing.

Laat de rat 60 minuten herstellen in een speciale kooi voor intensive care met warme lucht en een zuurstofvoorziening voordat deze wordt teruggeplaatst in een normale kooi. Alle ontvangende ratten overleefden tot de geplande euthanasie voor bloedafname op 1, 3, 24 en 168 uur na portale reperfusie. Serummonsters werden geanalyseerd op alanine-aminotransferase-spiegels, die de mate van hepatocellulaire schade aan de levertransplantaten na transplantatie weerspiegelen.

Zoals in deze grafiek wordt getoond, bereikten de LT-waarden een piek na 24 uur en daalden daarna binnen de normale grenzen na 168 uur. Na deze video zou u een goed inzicht moeten hebben in hoe u een partiële topic levertransplantatie bij ratten uitvoert als reproduceerbaar experimenteel model voor transplantatieonderzoek.