Dissection, Cultuur en Analyse van

Het algemene doel van deze procedure is het voorbereiden van een primaire celcultuur van retina-cellen van de xenopus. Dit wordt bereikt door eerst de omringende weefsels te verwijderen om de retina bloot te leggen. De tweede stap is het excideren van het retina-weefsel.

Vervolgens wordt het retinale weefsel gedissocieerd tot enkelvoudige cellen. De laatste stap is het uitplaten van de retinale cellen op een UnCloned-schaal en het toevoegen van flu oh 4:00 AM voor calcium-imaging. Ten slotte wordt confocale microscopie gebruikt om de calciumactiviteit in de retinale celkweek te detecteren.

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van cruciale vragen op het gebied van de ontwikkelingsbiologie, neurobiologie en celbiologie, zoals de rol van calcium en elektrische activiteit bij de ontwikkeling van het netvlies, evenals genexpressie op enkelcelniveau. Over het algemeen zullen personen die nog niet bekend zijn met deze procedure moeite hebben, omdat fijne motoriek noodzakelijk is voor tijdige en nauwkeurige dissecties. Een visuele demonstratie van deze methode is essentieel, aangezien de dissectiestappen moeilijk zijn vanwege de vereiste complexe oog-handcoördinatie.

Om deze procedure in de zuurkast te starten, bereidt u het volgende voor en labelt u dit: één plastic Petrischaal van 60 millimeter met 10 milliliters celkweekmedium, te gebruiken als dissectieschaal. Optioneel kunnen 10 milligram collagenase B aan de dissectieschaal worden toegevoegd voor een eindconcentratie van 1,0 milligram per milliliter om de scheiding van weefsellagen te vergemakkelijken bij de dissectie van embryo's in stadium 25 of jonger.

Bereid daarnaast een 35 millimeter petrischaal voor met twee milliliters celkweekmedium om als kweekplaat te dienen. Gebruik één lege 1,5 milliliter microcentrifugebuis als buis voor de dissociatie van het explantaat en één 15 milliliter conische Falcon-buis met 15 milliliters.

Celcultuurmedium. Bereid vervolgens twee plastic Petri-schalen van 35 millimeter voor met elk twee milliliter CMF voor dissectie: één om te gebruiken als plaat voor de dissociatie van het explantaat en de andere als spoelplaat voor het explantaat buiten de zuurkast. Bereid daarnaast twee plastic Petri-schalen van 60 millimeter voor met elk 10 milliliter.

0,1 XMMR, waarvan één als houderplaat en de andere als sibling-plaat wordt gebruikt, en nog een plastic Petrischaal van 60 millimeter met 10 milliliter 0,1 XMMR plus 0,5 milligram per milliliter MS 2 22. Voeg daarna 40 microliter 5% tripsine in CMF toe aan de dissociatieplaat van de explantaten.

Wervel om te mengen en zet dit vervolgens opzij. Ga daarna over tot de dissectie met behulp van een dissectiescoop en twee paren fijne pincetten. Maak een midsagittale snede aan de ventrale zijde van het embryo, beginnend bij het posterieure uiteinde en doorlopend via de cementklier in het anterieure deel van het embryo.

Open het embryo zorgvuldig door beide zijden van de snede uit elkaar te trekken. Hierdoor komt de dorsale zijde van het embryo naar de dissectieplaat toe te liggen. Open vervolgens het ventrale ectoderm om het endoderm en mesoderm bloot te leggen.

Verwijder vervolgens het endoderm en mesoderm, de eerste en grootste laag van dit weefsel. Het endoderm ziet er zeer pluizig uit, met grote cellen en weinig duidelijke organisatie. Nadat deze laag is verwijderd, worden de somieten en de Noor zichtbaar.

Voor een beter contrast brengt u het embryo over naar een aparte plastic Petrischaal van 60 millimeter die 10 milliliters celkweekmedium en 100 microliters van een 1% oplossing van Nijlblauwzuur bevat, en laat u dit twee tot drie minuten incuberen. Breng het embryo daarna terug naar de dissectieplaat. Hierdoor worden het ectoderm, de somieten en het neurale buis gekleurd voor een eenvoudigere identificatie en oriëntatie.

Richt u op het voorste gedeelte van het embryo en verwijder voorzichtig de Noor en elk overgebleven mesoderm om de hersenen en de oogblaasjes bloot te leggen. Zodra de hersenen en oogblaasjes volledig zijn blootgesteld, gebruikt u de pincet om de neurale buis en het onderliggende ectoderm vlak achter de hersenen door te snijden. Draai dit gedeelte om zodat het ectoderm aan de bovenzijde ligt.

Wees voorzichtig om beschadiging van de onderliggende optische blaasjes te voorkomen en verwijder het ectoderm zorgvuldig. Scheid ten slotte de optische blaasjes van de hersenen met de pincet om een embryo ouder dan stadium 25 te dissekeren. Verwijder eerst het ventrale deel van het embryo met een pincet op de verdovingsplaat.

Voor een beter contrast wordt het embryo gedurende twee tot drie minuten overgebracht naar een plastic Petrischaaltje van 60 millimeter met 10 milliliter 0,1 XMMR en 100 microliter 1% Nile blue sulfate om het ectoderm te kleuren. Breng het embryo vervolgens over naar de dissectieplaat. Houd het embryo vervolgens op zijn plaats en verwijder voorzichtig de retina of de optische blaas die zich direct onder het bovenliggende ectoderm bevindt.

Zodra de optische vesikel of het netvlies is gedissecteerd, wordt dit voorzichtig met een P 100 micropipet en een aerosolbestendige tip overgebracht naar de X explantaat-spoelplaat. Let erop dat het weefsel geen lucht-vloeistofgrenzen raakt. Laat het explantaat vervolgens 30 seconden rusten.

Overbreng vervolgens 80 µL 0,1% trypsine in CMF van de plaat voor dissociatie van de explantaat naar de buis voor dissociatie van de explantaat. Breng daarna het netvlies of de optic vesicle van de spoelplaat voor de explantaat over naar de buis voor dissociatie van de explantaat. Voorkom dat de spoeloplossing van de explantaat wordt overgebracht.

Laat het weefsel vervolgens gedurende één uur bij kamertemperatuur dissociëren in de buis voor explantaat-dissociatie. Indien er gedurende het experiment meerdere beelden van de cellen moeten worden vastgelegd, bevestig dan een raster aan de onderzijde van de kweekplaat met kleine druppels secondelijm. Dit maakt het mogelijk om beelden van identieke cellen in identieke oriëntaties vast te leggen op verschillende momenten tijdens de procedure voor het uitplaten van de cellen.

Verwijder eerst langzaam 40 µL van de oplossing uit de buis voor dissociatie van de explan en gooi dit weg. Gebruik vervolgens de P 100 met een aerosolbestendige tip om de cellen langzaam over te brengen naar de kweekplaat. Pipetteer bij het aanbrengen van de cellen op de plaat langzaam en houd de cellen in een klein gebied in het centrum van de plaat.

Deze figuur toont een voorbeeld van de calciumactiviteit van een enkele cel gedurende één uur van beeldvorming. Deze figuren bieden de representatieve resultaten van calcium-imagingexperimenten in embryonale retinale cellen zoals geanalyseerd in verschillende ontwikkelingsstadia. Kort samengevat laten de resultaten zien dat calcium ontwikkelingsregulerend is, met spiking-pieken in stadium 35 in termen van het correleren van calciumactiviteit met cellen die positief zijn voor een specifieke probe.

In experimenten met vissen waren er, hoewel er geen statistisch significante verschillen waren, wel trends waarbij cellen die positief waren voor een GABAerge marker hogere niveaus van calcium-spiking activiteit vertoonden dan cellen die positief waren voor een glutamaterge marker of voor de codering van het PT F1 A.A gen, een transcriptiefactor die gecorreleerd is met het bevorderen van het GABAerge fenotype. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in ongeveer drie uur en 30 minuten worden voltooid voor één plaat, mits correct uitgevoerd. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals celkweek en C twee hybridisatie of elektrofysiologische registraties, worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals welke cellen specifieke fenotypische markers tot expressie brengen of om elektrofysiologische registraties te analyseren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u retinaal weefsel moet disseceren, retinaal weefsel moet dissociëren en retinale cellen moet uitplaten.